ACÚMULO DE CÁDMIO POR Saccharomyces cerevisiae FERMENTANDO MOSTO DE CALDO DE CANA

ACCUMULATION OF CADMIUM BY Saccharomyces cerevisiae FERMENTING MUST OF SUGAR-CANE

ACÚMULO DE CÁDMIO POR Saccharomyces cerevisiae FERMENTANDO MOSTO DE CALDO DE CANA¹

S.M.G. da SILVA², L.G. do PRADO-FILHO^3,*

RESUMO

O presente trabalho estudou o acúmulo de cádmio (Cd) por Saccharomyces cerevisiae, fermentando mosto de caldo de cana com contaminações controladas, em níveis sub-tóxicos, do citado metal. O ensaio de fermentação foi conduzido em erlenmayers de 500 mL, acondicionados em estufa B.O.D. O mosto, não esterilizado, continha 12% de açúcares redutores totais (ART) e pH 4,5. Para a contaminação controlada empregou-se cloreto de cádmio em quatro níveis de contaminações: 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 mg Cd kg^-1 mosto. A inoculação do mosto foi executada com fermento de panificação (10% p/p). Após a fermentação (4 horas) foram determinados, porcentagem de fermento no vinho centrifugado e teor alcoólico do mesmo. Na levedura separada por centrifugação, foram determinados peso úmido, matéria seca, proteína bruta e teores de cádmio por espectrofotometria de absorção atômica. Em todos os níveis de contaminação estudados houve acúmulo de Cd pela levedura.

Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae - caldo de cana - metal pesado - cádmio –

SUMMARY

ACCUMULATION OF CADMIUM BY Saccharomyces cerevisiae FERMENTING MUST OF SUGAR-CANE. The aim of this paper is to study the absorption and cadmium (Cd) concentration by Saccharomyces cerevisiae, fermenting must of sugar-cane, with control contamination, under toxic levels of cadmium (mg Cd kg^-1 must). The fermentation was performed in 500 mL erlemmayers. Non-sterilized must showed 12% of total reducing sugar (w/w) e pH 4,5. For the control contamination, was applied cadmium chloride, with four levels of contamination: 0,5; 1,0; 2,0 and 5,0 mg Cd kg^-1 must. The inoculation of must was carried out with bread yeast (10% w/w). After fermentation (4 hours), samples were colected to evaluate cellular viability and yeast percentage. Fermenting mid was centrifuged and analysis of mid without yeast and raw yeast were performed. The alcohol content was measured , as well as the total humid weight for the yeast material, raw protein and heavy metal by atomic absorption spectroscopy. Watch all level studied have accumulation of cadmium at yeast.

Keywords: Saccharomyces cerevisiae - heavy metal - cadmium - must of sugar-cane-

1 - INTRODUÇÃO

Em anos recentes, os metais, em particular os metais pesados, têm sido alvo de muita atenção devido a sua liberação para o meio ambiente, alta persistência e toxidade para uma grande variedade de organismos, incluindo o homem [25]. O advento da era industrial e a mineração em alta escala, possibilitaram o aparecimento de enfermidades relacionadas com os varios metais tóxicos [09,16].

Os metais pesados compreendem em torno de 40 elementos, com densidade mínima maior que 5,0 g cm^-3 [25] ou 6,0 g cm^-3 [02, 14]. Muitos destes metais são essenciais para o crescimento de organismos eucariotos e procariotos, sendo exigidos em concentrações muito pequenas. Contudo, alguns destes metais, como o cádmio (Cd), não são essenciais para o crescimento celular, e são extremamente tóxicos em baixas concentrações [16, 25, 28].

O fator mais importante que distingue o cádmio de outros poluentes é que ele não é biodegradável, e uma vez no meio ambiente, seu potencial de toxidade é controlado por sua forma físico-química [21, 25]

O cádmio é o elemento número 48 da tabela periódica, com um peso atômico de 112,4 [27]. É medianamente denso (8,6 g cm^-3), branco prateado, sendo um metal maleável com ponto de fusão 320,9ºC e ebulição 765ºC [01, 20]. Embora o cádmio tenha sido descrito como um elemento relativamente raro [26, 32], posteriormente, foi constatado que o mesmo encontra-se presente no ambiente em baixos níveis [27]. Nos dias atuais, a concentração de cádmio na crosta terrestre varia entre 0,15 e 0,20 mg kg^-1, sendo o 67º metal em abundância [15].

O uso industrial do cádmio deve-se ao seu baixo ponto de fusão (320,9ºC), sendo utilizado principalmente no fabrico de ligas metálicas com baixo ponto de fusão, baixo coeficiente de fricção e alta resistência à fadiga. É ainda utilizado na galvanoplastia, construção de baterias, juntamente com o níquel, como estabilizador na industria de plásticos polivinílicos e como pigmento amarelo em tintas e vidros. A produção mundial anual de cádmio está ao redor de 20x10³ toneladas [28].

Quando introduzido no organismo via oral,o cádmio é pouco absorvido, sendo que 95% é eliminado [09], porém, o restante é acumulado nos rins e figado, onde foi detectado que sua meia vida biológica é de 10 anos [24].

Este risco em potencial, sucitou pesquisas na área de alimentos, uma vez que este contaminante tem caráter cumulativo na cadeia biológica da qual o homem faz parte [16]. Como resultado do fenômeno de bioacumulação, as quantidades subtóxicas presentes no ambiente podem atingir níveis de risco nos elos finais da cadeia trófica [28].

É bem conhecido que microrganismos possuem capacidade de acumular cádmio, sendo que Saccharomyces cerevisiae não é exceção [06, II, 17, 29, 30].

Quando as matérias primas para fermentação são oriundos de solos ácidos tratados com adubos fosfatados, ou com lodo de esgoto, podem conter quantidades apreciáveis de cádmio, transportando este metal para o processo fermentativo [05].

No Brasil, o processo de fermentação normalmente utilizado é o chamado Melle-Boinot, no qual as células de levedura recuperadas são recirculadas no processo, mantendo elevada a concentração celular, e obtendo-se, assim, um aumento do rendimento alcoólico, devido o menor consumo de açúcar para multiplicação e crescimento celular [12]. Entretando, o desvio de parte do leite de levedura do processo (10 a 20%) não compromete a produção de etanol, sendo comum em várias usinas e destilarias [11]. Esta levedura é extruzada e seca, sendo utilizada na alimentação animal e humana.

A levedura que cresce em meio com concentrações sub-tóxicas aceitáveis de qualquer metal poderá apresentar, devido à capacidade de bioacumulação, maiores níveis que aqueles presentes no meio de crescimento [29, 30], podendo atingir teores não admissíveis pela legislação vigente, o que a invalidaria como ingrediente de ração e como suplemento protéico humano [07].

O acúmulo de metais pesados por microrganismos é geralmente bifásico: uma rápida ligação com a superfície da célula, independente do metabolismo, é seguida de um acúmulo intracelular dependente do metabolismo e com gasto de energia [06, 19, 26, 29].

Neste acúmulo não dependente do metabolismo (biosorção), os cátions podem ser depositados na membrana via adsorção, precipitação orgânica ou ficarem adsorvidos à grupos aniônicos fixos, presentes na membrana da célula [29]. O cátion divalente Cd⁺² liga-se reversivelmente a estes sítios aniônicos [19]. O acúmulo independente do metabolismo é seguido de outro, dependente do metabolismo (biacumulação). Neste, os cátions são transportados através da membrana celular, provavelmente por proteínas de transporte, até o citossol, onde fica ligado a metaloproteínas [06, 19, 29].

O presente trabalho visou o estudo do acúmulo de cádmio (Cd) por S. cerevisiae, fermentando mosto de caldo-de-cana, com contaminações controladas, em níveis sub-tóxicos do citado metal.

2 — MATERIAIS E MÉTODOS

O mosto, não esterilizado, foi preparado uma única vez, em volume de 10,0 litros, suficiente para realizar toda a pesquisa. A cana foi moída, extraindo-se o caldo. Após a homogenização, o mesmo foi subdividido em porções de 2 litros sendo então armazenado em frascos e estocado a -20ºC ± 1, até o momento do uso, quando foram descongeladas. Este foi então diluído, apresentando como características finais 12% ART [03], e pH 4,5. Foram acrescentados, como nutrientes, 300 mg nitrogênio [(NH₄)₂SO₄], 150 mg fósforo (K₂HPO₄) e 50 mg magnésio (MgCl₂.6H₂O) por quilograma de mosto. Após a homogenização manual, o mesmo foi dividido em porções de 300 g, em erlemmayers de 500 mL, recebendo cada uma quantidades de cloreto de cádmio (CdCl₂.½H₂O), que resultavam nas concentrações de 0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 mg de Cd kg^-1 de mosto. Porções sem contaminação foram usadas como testemunha. Acrescentou-se então 10% p/p de fermento de panificação, marca Fleischmann, adquirido no comércio, de uma única partida, em pacotes de 500g, os quais foram homogenizados, através da quebra dos blocos, e estocados em geladeira (7ºC) até o momento do uso, quando era determinada a viabilidade celular [18]. Todas as fermentações foram conduzidas em estufa incubadora B.O.D. NT705 a 30ºC ± 1, por 4 horas, sendo o término das mesmas confirmado por 3 medidas de ºBrix coincidentes, feitas a cada quinze minutos, e pelo término da formação da espuma. Ao final das fermentações retirou-se alíquotas de 5,0 mL para controle da viabilidade celular [18]. O vinho foi então centrifugado a 1.500 gravidades, e o peso úmido total da levedura recuperada determinado para cada ensaio. No vinho quantificou-se o etanol por cromatografia gasosa [04]. Após a secagem da levedura [22], 1,25g da mesma foi submetida a digestão sulfo-nitro-perclórica (H₂SO₄:HNO₃:HClO₄, na proporção de 2:5:3), segundo a metodologia proposta por Varma [27]. As amostras de biomassa mineralizadas foram então diluídas até 25mL e o cádmio quantificado por espectrofotometria de absorção atômica (espectrofotômetro VARIAN-AA 175). Os teores de cádmio das soluções foram expressos em mg kg^-1 de levedura bruta seca. Da biomassa seca, analisou-se o nitrogênio total segundo Silva [23].

O experimento foi realizado segundo o delineamento estatistico de "blocos casualizados", com 5 tratamentos e 3 repetições [10] e os resultados analisados pelo programa SANEST [33].

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em todos os níveis de contaminação estudados houve acúmulo de cádmio, estatisticamente significante a nível de 99% de confiança, como mostram a Tabela 1 e a Figura 1. Estes resultados estão de acordo com os obtidos por Domingos [07], que trabalhou com acúmulo de cádmio por Saccharomyces cerevisiae fermentando mosto de melaço e os obtidos por Brady & Duncan [06], que trabalharam com bioacumulação de cádmio em soluções contaminadas com cloreto de cádmio.

TABELA 1.
Concentração de cádmio (mg kg^-1) na levedura bruta seca

Dose	mg de Cd kg-1 de mosto
	0,5	1,0	2,0	5,0
Cd na Levedura	1,2C	4,0B	5,1B	8,0A

As médias seguidas pela mesma letra, não diferem entre sí segundo o teste de Tukey a 1% de significância.

FIGURA 1.
Concentração de cádmio adsorvido pela levedura durante o processo de fermentação, por 4h a 30º em mosto de caldo de cana.

Os teores do metal na levedura bruta, mostram uma alta correlação (r = 0,9244) com os teores do mesmo nos mostos, sendo devidos à biosorção e/ou bioacumulação, não sendo possível nas condições estudadas, diferenciar quantitativamente a ação de cada um destes mecanismos, mesmo porque o objetivo do trabalho foi determinar o acúmulo global de cádmio.

A Tabela 2 mostra os teores alcoólicos nos vinhos das fermentações com diferentes níveis de contaminação de cádmio. Estatisticamente, não foi detectada uma diferença significativa na produção de etanol entre os mostos contaminados e a testemunha.

TABELA 2.
Etanol presente no vinho centrifugado (v/v)

Dose	mg de Cd kg-1 de mosto
	0,0	0,5	1,0	2,0	5,0
% etanol	6,57A	6,66A	6,75A	6,99A	6,92A

As médias seguidas pela mesma letra, não diferem entre sí segundo o teste de Tukey a 1% de significância.

A Tabela 3 mostra a viabilidade celular. A análise estatistica não detectou diferenças significativas entre os níveis de contaminação estudados, Entretanto, o estudo presente não inclui o reaproveitamento das leveduras em fermentações consecutivas. Assim sendo, não fica excluída a possibilidade de, com numerosas reciclagens do fermento, aparecerem sintomas de toxidade crônica, com reflexos na viabilidade celular e no transcurso normal das fermentações.

TABELA 3.
Porcentagem da viabilidade celular da levedura recuperada através da centrifugação do mosto contaminado com cádmio, após a fermentação.

Dose	mg de Cd kg-1 de mosto
	0,0	0,5	1,0	2,0	5,0
Células vivas	93,53A	93,85A	90,23A	90,0A	91,37A
Células mortas	6,47	6,15	9,77	10,0	8,63

As médias seguidas pela mesma letra, não diferem entre si segundo o teste de Tukey a 1% de significância.

Do mesmo modo, o peso úmido e o peso seco da levedura recuperada, após cada fermentação (Tabela 4) não mostraram diferenças estatisticamente significantes entre os teores de contaminação estudados. Para estes resultados, também são válidas as ressalvas feitas para a viabilidade celular.

TABELA 4
. Peso úmido e peso seco em gramas, da levedura recuperada, após a fermentação dos mostos contaminados com cádmio.

Dose	mg de Cd kg-1 de mosto
	0,0	0,5	1,0	2,0	5,0
Peso úmido	31,94	31,73	32,03	32,47	31,77
Peso seco	8,17A	8,18A	8,29A	8,32A	8,15A

As médias seguidas pela mesma letra, não diferem entre si segundo o teste de Tukey a 1% de significância.

Entre os teores de proteína bruta mostrados na Tabela 5, foram detectadas diferenças significantes entre a levedura oriunda dos mostos contaminados com concentração de cádmio de 0,0 e 0,5 mg kg^-1 de mosto e os demais tratamentos (1,0; 2,0 e 5,0 mg kg^-1) segundo o teste de Tukey a 1% de significância. Mesmo não se tendo detectado diferença estatisticamente significativa entre a levedura oriunda dos demais níveis de contaminação, pode-se observar um aumento nas porcentagens de proteína em relação aos teores de cádmio no meio.

TABELA 5.
Proteína bruta da levedura recuperada após a fermentação de mostos contaminados com cádmio (f=6,25).

Dose	mg de Cd kg-1 de mosto
	0,0	0,5	1,0	2,0	5,0
Teor de proteína (%)	29,31B	30,63B	42,44A	46,81A	44,23A

As médias seguidas pela mesma letra, para um mesmo sal, não diferem entre si segundo Tukey a 1% de significância.

Os resultados foram similares aos encontrados por Domingos [7]. Segundo o autor, isto pode ser reflexo do bloqueio de vias metabólicas, favorecendo a permanência de produtos nitrogenados dentro da célula, fazendo assim que as mesmas desviem da normalidade metabólica em uma determinada condição, e passem a acumular produtos nitrogenados.

Por outro lado, o cádmio é acumulado pela levedura no citossol, ligado a metaloproteinas (metionina), que tem grande afinidade pelo metal [6, 13, 29]. A produção de metalotioninas, ou de proteínas semelhantes a estas, é sabiamente induzida por cádmio, sendo um dos mecanismos de destoxificação [8, 13, 31].

4 — CONCLUSÕES

Saccharomyces cerevisiae concentra cádmio durante a fermentação de mosto de caldo-de-cana com contaminações sub-tóxicas de cloreto de cádmio.

Nos teores de contaminações empregados no presente estudo, houve aumento estatisticamente significante no teor de proteína bruta das células nas tres maiores doses de contaminação, com relação à testemunha.

Nas dosagens utilizadas e sem a reutilização da levedura em fermentações sucessivas, não foram detectados efeitos tóxicos aparentes, não havendo diferenças entre os tratamentos no que se refere à produção de etanol, viabilidade celular, peso úmido da levedura recuperada, nas células após a fermentação.

5 — BIBLIOGRAFIA

1. ADRIANO, D. C. Cadmium. In: ADRIANO, D. C. Trace Elements in the Terrestrial Environment. New York: Springer-Verlang, 1986. cap.4, p.105-155.

2. ALLOWAY, B. I. The origins of heavy metals in soils. In: ALLOWAY, B. I. Heavy Metals in Soils. 2ª ed. New York: John Wiley, 1995, cap.3, p.38-57.

3. AMORIM, H. V. Progressos na técnica de fermentação alcoólica no Brasil. Álcool e Açúcar, v.2, n.4, p.50-56, 1982.

4. ARAÚJO, J. M. A. Cromatografia de Fase Gasosa. In: ARAÚJO, J. M. A. Química de Alimentos. Viçosa: Imprensa Universitária, 1995. cap.8, p.163-190.

5. BABICH, H. & STOTZKY, G. Influence of chemical speciation on the toxicity of heavy metals to the microbiota. In: NRIAGU, J.O. ed. Aquatic toxicology, New York: Wiley & Sons, 1983. cap.1, p.1-46.

6. BRADY, D.; DUNCAN, J. R. Bioacumulation of metal cations by Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology, v.41, n.01, p.149-159, 1994.

7. DOMINGOS, R. N. Acúmulo de cádmio por Saccharomyces cerevisiae fermentando em mosto de melaço. Piracicaba, 1996. 63p. Dissertação (mestrado) - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo.

8. ECKER, D. J.; BUTT, T. R.; STERNBERG, E. J.; NEEPER, M. P.; DEBOUCK, C.; GORMAN, J. A.; CROOKE, S. T. Yeast metallothionein functional in metal ion detoxification. The Journal of Biological Chemistry. v.261, n.36, p.16.895-16.900, 1986.

9. GERHARDSSON, L.; SKERFVING, S. Concepts on Biological Markers and Biomonitoring for Metal Toxicity. In: CHANG, L. W. Toxicology of Metals. Boca Raton, Flórida: CRC Press IC, 1996. cap.06, p.81-112.

10. GOMES, F. P. Estatistica Experimental. 13º ed. Piracicaba: Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz". 1990, 468 p.

11. LIMA, G. J. M. M. Uso da levedura seca (Saccharomyces cerevisiae) de destilarias de álcool de cana-de-açúcar na alimentação de matrizes suínas em gestação e lactação. Piracicaba, 1983. 139p. Dissertação (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo.

12. LOPES, J. J. C. Bagaço de nutrientes minerais no processo Melle-Boinot de fermentação alcoólica. Piracicaba, 1989, 74p. Dissertação (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo.

13. MACASKIE, L. E.; DEAN, A. C. R. Metal-sequesterning biochemicals. In: VOLESKY, B. Biosorption of Heavy Metals. Boca Raton, Flórida: CRC Pres IC. 1990. cap.2.5, p.199-248.

14. MALAVOLTA, E. Fertilizantes e seu impacto ambiental: Micronutrientes e metais pesados, mistificação e fatos. São Paulo, Produquímica, 1994, 153p.

15. MATTIAZZO-PREZOTTO, M. M. Comportamento de cobre, cádmio, crômio, níquel e zinco adicionados à solos de clima tropical em diferentes valores de pH. Piracicaba, 1994. 197p. Tese (Livre-Docência) - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo.

16. MIRANDA, C. E. S. Determinação de cádmio por espectrofotometria de absorção atômica com pré-concentração em resina de troca iônica empregando sistema FIA. São Carlos, 1993. 89p. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Física e Química de São Carlos, Universidade de São Paulo.

17. MIYADA, V.S. A levedura seca na alimentação de suínos: estudos adicionais sobre o seu valor protéico e vitamínico. Piracicaba, 1987. 159p. Tese (Livre Docência) - .Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo.

18. MORAES, S. A.; ALVES, S. B. Quantificação de inóculo de patógenos de insetos. In ALVES, S. B. Controle Microbiano de Insetos. São Paulo: Editora Manolo, 1986. cap. 14, p.278-288.

19. NORRIS, P. R. & KELLY, D. P. Acumulation of cadmium and cobalt by Saccharomyces cerevisie. Journal of General Microbiology. v.99, n.02, p.317-324, 1977.

20. REILLY, C. Mercury and Cadmium. In. REILLY, C. Metal Contamination of Food. New York, Elsevier, 1991. cap.6, p.131-151.

21. ROBARDS, K.; WOURSFOLD, P. Cadmium: Toxicology and analysis. Analyst. v. 116, n.06, p. 549-568, 1991.

22. SILVA, D. J. Conceitos gerais sobre análise de alimentos e determinação da matéria seca. In: SILVA, D. J. Análise de alimentos (métodos químicos e biológicos). Viçosa: Universidade Federal de Viçosa/Imprensa Universitária, 1990a. cap.01, p.1-11.

23. SILVA, D .J. Dosagem de nitrogênio total pelo método kjeldahl. In: SILVA, D. J. Análise de alimentos (métodos químicos e biológicos). Viçosa: Universidade Federal de Viçosa/Imprensa Universitária, 1990b. cap. 5, p.24-38.

24. TAVARES, T. M.; CARVALHO, F. M. Avaliação da exposição de populações humanas à metais pesados no ambiente: exemplos do Reconcavo Baiano. Química Nova. v.15, n.2, p.147-54, 1992.

25. TREVORS, J.T.; STRATTON, G.W.; GADD, G.M. Cadmium transport, resistance and toxicity in bacteria, algae and fungi. Canadian Journal of Microbiology. v.32, n.06, p.447-464, 1986.

26. VALLE, B.L. & ULMER, D.D. Biochemical effects of mercury, cadmium and lead. Annual Review of Biochemistry. v.41, p.91-128, 1972.

27. VARMA, A. Group IIB elements (Zn, Cd, Hg). In: VARMA, A. Handbook of Atomic Absorption Analysis. 3º ed. Boca Ranton, Flórida: CRC Press INC, 1986. V.II, cap.02, p.73-184.

28. VOLESKY, B. Removal and Recovery of Heavy Metals by Biosorption. In: VOLESKY, B. Biosorption of Heavy Metals. Boca Raton, Flórida: CRC Press IC, 1990a. cap.1.2, p.7-43.

29. VOLESKY, B. Biosorption of Fungal Biomass. In; VOLESKY, B. Biosorption of Heavy Metals. Boca Raton, Flórida: CRC Press IC, 1990b. cap.2.3, p.139-171.

30. VOLESKY, B.; MAY-PHILLIPS, H. A. Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology, v.42, n.05, p.797-806, 1995.

31. WHITE, C.; GADD, G. M. Uptake and cellular distribuition of copper, cobalt and cadmium in strains of Saccharomyces cerevisiae cultured on elevated concetrations of these metals. FEMS Microbiology Ecology. v.38, n.05, p.277-283, 1986.

32. WOOD, J.M. Biological cycles for toxic elements in the environment. Science. v.183, n.4.129, p.1.049-1.052, 1974.

33. ZONTA, E. P.; MACHADO, A. A. SANEST 2: Sistema de Análise Estatística para Conputadores. Piracicaba: SEI, 1992 (softer).

² Departamento. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial - ESALQ/USP.

³ Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial - ESALQ/USP. Av. Pádua Dias, n.11, C.P. 09, CEP: 13.418-900 - Piracicaba, SP

* A quem a correspondência deve ser endereçada.

¹

Recebido para publicação em 06/04/98 Aceito para publicação em 21/10/98. Parte da Dissertação de Mestrado em Microbiologia Agrícola do primeiro autor

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Maio 1999
• Data do Fascículo
  Out 1998

Histórico

• Recebido
  06 Abr 1998
• Aceito
  21 Out 1998