Efeito e modo de ação das bacteriocinas produzidas por Lactococcus lactis subsp. lactis ITAL 383, ATCC 11454 e CNRZ 150 contra Listeria innocua LIN 11

Effect and mode of action of the bacterioncin produced by Lactococcus. lactis subsp. lactis ITAL 383, ATCC 11454 e CNRZ 150 against Listeria innocua LIN 11

Efeito e modo de ação das bacteriocinas produzidas por Lactococcus lactis subsp. lactis ITAL 383, ATCC 11454 e CNRZ 150 contra Listeria innocua LIN 11¹

Izildinha MORENO^2,*, Alda L. S. LERAYER², Vera Lúcia S. BALDINI², Mauro F. F. LEITÃO³

RESUMO

O efeito e o modo de ação das bacteriocinas produzidas por L. lactis subsp. lactis ITAL 383 e CNRZ 150 são similares à nisina de L. lactis subsp. lactis ATCC 11454. Estas bacteriocinas apresentaram um modo de ação bactericida, causando a lise de células de L. innocua LIN 11, associada ao decréscimo da absorbância e da viabilidade celular. O efeito letal foi maior para células em fase exponencial comparativamente à fase estacionária de crescimento. A adsorção dessas bacteriocinas às células de L. innocua LIN 11 foi muito rápida e influenciada pelo pH do meio de suspensão; adsorção máxima foi verificada a pH 6,0 e logo após o contato inicial. Perda completa de adsorção ocorreu em pH 2,0.

Palavras-chave: bacteriocina, modo de ação, L. lactis subsp. lactis, Listeria innocua.

SUMMARY

EFFECT AND MODE OF ACTION OF THE BACTERIOCIN PRODUCED BY Lactococcus. lactis subsp. lactis ITAL 383, ATCC 11454 e CNRZ 150 AGAINST Listeria innocua LIN 11. The effect and mode of action of the bacteriocin produced by L. lactis subsp. lactis ITAL 383 and CNRZ 150 are similar to the nisin produced by L. lactis subsp. lactis ATCC 11454. It was clearly bactericidal, and caused lysis of a strain of L. innocua LIN 11 detected by the decrease of absorbance values and the cell viability. Their lethal effect was considerably higher during the logarithmic growth when compared to the stationary phase. Adsorption developed rapidly and was influenced by the pH value of the suspension medium. Maximum adsorption was observed at pH 6,0 and immediately after initial contact and loss at pH 2,0.

Keywords: bacteriocin, mode of action, L. lactis subsp. lactis, Listeria innocua.

1 – INTRODUÇÃO

A ação das bacteriocinas pode ocorrer de diferentes formas, dependendo mais dos fatores relacionados à espécie bacteriana, como a fase de crescimento celular, e de suas condições de crescimento, do que uma característica relacionada a sua própria molécula [13]. Podem, dessa forma, promover um efeito letal bactericida, sem lise celular [5, 6, 7, 24] ou com lise celular (bacteriolítico) [6, 12, 14, 26] ou, ainda, inibir a multiplicação microbiana, com efeito bacteriostático [6].

Até o presente, a nisina consiste na única bacteriocina utilizada comercialmente como agente natural de conservação de alimentos. De um modo geral, a ação da nisina sobre células de microrganismos Gram-positivos ocorre em duas etapas. A primeira, envolve a adsorção não-específica da nisina sobre a parede celular de microrganismos Gram-positivos, fenômeno reversível e dependente do pH. A nisina permanece sensível às proteases e o tratamento com enzimas proteolíticas protege as células sensíveis contra seu efeito letal [5, 6, 8, 13]. A adsorção não-específica da nisina foi verificada em diversos experimentos pela redução do título, após o contato com as células de microrganismos sensíveis [5, 6, 8] e resistentes [8]. Esses estudos demonstraram, também, que a adsorção é dependente do pH, com um valor mínimo de 3,0 [20] e um máximo de 6,5 [25], da composição fosfolipídica da membrana citoplasmática dos microrganismos sensíveis [10], da presença de cátions divalentes e trivalentes (Mg⁺², Ca⁺² e Gd³⁺) [1] e da concentração utilizada [3].

Em uma segunda etapa, a nisina torna-se insensível às proteases e as células sofrem mudanças irreversíveis. Ela seria fortemente atraída aos fosfolipídios na membrana, formando poros ou canais de 0,2-1,0nm de diâmetro. A simultânea despolarização da membrana causaria um rápido efluxo de moléculas essenciais (íons K⁺, aminoácidos e ATP), levando a uma série de alterações que terminariam com a lise celular [1, 3, 4, 10, 22, 23].

A avaliação de novos tipos de bacteriocinas requer informações relacionadas as suas propriedades físicas, químicas e biológicas, além de outros fatores como toxicidade e aspectos econômicos. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito e o modo de ação das bacteriocinas de L. lactis subsp. lactis ITAL 383 [18] e CNRZ 150 contra L. innocua LIN 11, comparando-as com a nisina produzida por L. lactis subsp. lactis ATCC 11454. Complementando este estudo, verificou-se também, a capacidade de adsorção destas bacteriocinas às células sensíveis de L. innocua LIN 11.

2 – MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Origem e conservação dos microrganismos utilizados

Foram utilizadas três linhagens de L. lactis subsp. lactis, sendo duas pertencentes à Coleção de Bactérias Lácticas do Instituto de Tecnologia de Alimentos-ITAL (ITAL 383 e ATCC 1154) e uma (CNRZ 150), gentilmente cedida pelo Dr. Jean Richard do Institut National de Recherches Agronomiques - INRA, Jouy-en-Josas, França. Durante os experimentos, essas culturas foram mantidas a 4° C, em leite em pó desnatado reconstituído a 10% de sólidos e esterilizado a 121° C durante 10 minutos. Para a realização dos testes, as culturas puras foram incubadas a 30^oC e transferidas para o meio de cultivo, caldo M17.

A linhagem L. innocua LIN 11, isolada de leite, também do INRA, foi mantida a 4° C, em ágar TS suplementado com 0,6% de extrato de levedura (TSA-YE). Para a realização dos testes, a cultura pura foi transferida para caldo TS-YE e incubada a 35°C durante 18 a 24 horas.

2.2 – Extração das bacteriocinas e avaliação da atividade

As culturas produtoras de bacteriocinas (ITAL 383, CNRZ 150 e ATCC 11454) na fase exponencial de crescimento, em caldo M17, foram centrifugadas a 7500rpm durante 10 minutos a 4ºC. Os sobrenadantes foram neutralizados a pH 6,5 com solução estéril de NaOH 10N e esterilizados por filtração em membranas Millex-GV de 0,22µm (Millipore S.A., St Quentin-en-Yvelines).

As atividades das bacteriocinas foram avaliadas pelo método de diluição crítica de MAYR-HARTING et al. [17]. Em placas de microtitulação (Microwel Plate 96F), os sobrenadantes foram diluídos sucessivamente na proporção de 1:2 em solução tampão fosfato de sódio 10mM pH 7,0. Alíquotas de 10m l de cada diluição foram depositadas no ágar (TSA-YE) contido em placas de Petri e previamente inoculado com a cultura indicadora (L. innocua LIN 11). Após incubação a 30^oC durante 24 horas, os meios foram analisados quanto à formação de halos de inibição. O título designado como unidade arbitrária de bacteriocina por mililitro (UAml^-1) foi definido como sendo a recíproca da maior diluição que apresentou halo de inibição, multiplicada por 100 para a obtenção da preparação original.

As placas de Petri contendo a cultura indicadora foram preparadas a partir da cultura de L. innocua LIN 11 na fase estacionária de crescimento, diluída na proporção de 1/10 em solução aquosa de peptona a 0,1%. A cultura diluída (500µl) foi misturada a 4,5ml de ágar TSA-YE semi-sólido (0,75% de ágar) a 45° C e vertida em placas contendo ágar TSA-YE. Após solidificação e secagem do ágar em câmara de fluxo horizontal durante 60 minutos, os meios foram incubados a 30° C durante 2 horas antes de sua utilização.

2.3 – Efeito e modo de ação sobre L. innocua LIN11 e em diferentes fases de crescimento

Uma suspensão celular de L. innocua LIN11 foi inoculada a 1,0% em caldo TS-YE (três frascos) e incubada a 30° C durante 24 horas. Após 3 horas de incubação, alíquotas de 500µl das bacteriocinas de cada cultura foram adicionadas a cada frasco. Em intervalos regulares de uma hora, foram retiradas amostras para a medida da absorbância a 620h m, determinação do pH e contagem de células viáveis, que foi feita por semeadura em superfície de diluições apropriadas das amostras em ágar TS-YE e incubação a 35°C durante 24 a 48 horas. As semeaduras das contagens entre 10³-10⁶ UFCml^-1 foram realizadas utilizando-se o distribuidor Spiral, enquanto para as menores concentrações, alíquotas de 0,1ml foram semeadas na superfície do ágar. Os resultados foram comparados àqueles das culturas-controle, não adicionadas de bacteriocinas. O efeito das bacteriocinas em diferentes fases de crescimento de L. innocua LIN 11 foi avaliado em diferentes tempos (0:00h, 1:30h, 3:00h e 5:00h), previamente determinados por Emin [9].

A suspensão celular de um cultivo de L. innocua LIN11 na fase estacionária de crescimento foi obtida após centrifugação a 6000rpm, durante 10 minutos, a 4° C. As células foram lavadas três vezes consecutivas em solução tampão fosfato de sódio 10mM pH 7,0 e ressuspensas em 1,0ml de caldo TS-YE, obtendo-se uma concentração de 10⁹ UFCml^-1 [6].

2.4 – Capacidade de adsorção e a influência do pH

Uma alíquota de 0,1ml de uma suspensão celular de L. innocua LIN11 e 0,1ml de cada bacteriocina foi inoculada em 1,8ml de solução tampão fosfato de sódio 5mM ajustado a diferentes valores de pH (2,0, 4,0, 6,0 e 8,0). As misturas foram incubadas a 30ºC durante 60 minutos [25]. Em intervalos regulares de 10 minutos, amostras foram centrifugadas a 7500rpm durante 10 minutos a 4oC, para a obtenção dos sobrenadantes. As atividades residuais das bacteriocinas foram avaliadas pelo método de diluição crítica de MAYR-HARTING et al. [17], utilizando-se como indicadora L. innocua LIN 11. Foram empregados dois controles, um deles sem a adição da suspensão celular e o outro sem os sobrenadantes.

A suspensão celular do cultivo de L. innocua LIN11 na fase estacionária de crescimento foi obtida após centrifugação a 7500rpm durante 10 minutos a 4ºC. As células foram lavadas em 1/5 do volume com solução tampão fosfato de sódio 5mM pH 6,0 e ressuspensas na mesma solução tampão, em volume equivalente a 20 vezes do volume inicial da cultura [19, 25].

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Efeito e modo de ação sobre L. innocua LIN11 e em diferentes fases de crescimento

Os resultados do modo de ação das bacteriocinas de L. lactis subsp. lactis ITAL 383 e CNRZ 150 e da nisina de ATCC 11454 no crescimento de L. innocua LIN 11 são apresentados nas Figuras 1A, 1B e 1C, respectivamente. Observa-se que a adição das bacteriocinas ao cultivo de L. innocua LIN 11 com três horas de crescimento promoveu uma redução de células viáveis de 0,6 (ITAL 383), 1,1 (ATCC 11454) e 1,0 (CNRZ 150) ciclos logarítmicos (log UFCml^-1), respectivamente. Reduções máximas da população de L. innocua LIN 11 foram detectadas após 5 horas [1,2], 7 horas (3,8] e 6 horas [3,4] de incubação, após tratamento com as bacteriocinas de ITAL e CNRZ 150 e a nisina de ATCC 11454, respectivamente. Observa-se, também, a redução concomitante da medida da absorbância, o que revela a lise de células de L. innocua LIN 11.

FIGURA 1.
Efeito e modo de ação de bacteriocinas produzidas por L. lactis subsp. lactis ITAL 383 (A), CNRZ 150 (B) e da nisina de ATCC 11454 (C) no crescimento (Absorbância a 620h m e Log UFC/ml) de L. innocua LIN 11 em caldo TS-YE a 30^oC (Controle: sem adição de bacteriocina; Teste: com adição de bacteriocina).

Após a redução máxima, o crescimento de L. innocua LIN manteve-se praticamente inalterado para a bacteriocina de CNRZ 150 (Figura 2B) e a nisina de ATCC 11454 (Figura 3C), enquanto para ITAL 383 (Figura 2A), as células sobreviventes retomaram seu crescimento, alcançando uma população de células viáveis (1,3´ 10⁹UFC/ml^-1) similar ao do controle (3,2´ 10⁹UFC/ml^-1) com 10 horas de incubação. Isto ocorreu devido a adição de concentrações insuficientes de bacteriocinas para a inibição total desse microrganismo. O modo de ação das bacteriocinas é dependente de muitos fatores, dentre os quais a sua concentração. A inibição de células persiste enquanto houver bacteriocina ativa remanescente no meio de crescimento [2, 11, 16].

FIGURA 2.
Efeito da adição das bacteriocinas de L. lactis subsp. lactis ITAL 383 (A), CNRZ 150 (B) e da nisina de ATCC 11454 (C) em diferentes fases de crescimento de L. innocua LIN 11 em caldo TS-YE a 30⁰C (Controle: sem adição de bacteriocina; FES: fase estacionária; IFE: início da fase exponencial, MFE: meio da fase exponencial e FFE: final da fase exponencial).

FIGURA 3.
Capacidade de adsorção de bacteriocinas produzidas por L. lactis subsp. lactis ITAL 383 (A), CNRZ 150 (B) e da nisina de ATCC 11454 (C) após contato com células sensíveis de L. innocua LIN 11 e em diferentes valores de pH (atividade: unidade arbitrária x 103ml^-1).

Esses resultados são similares aos relatados por CARMINATI et al. [5] que encontraram redução de 4 ciclos logarítmicos da população de L. monocytogenes após 2 a 4 horas de crescimento com bacteriocinas de L. lactis subsp. lactis. Neste caso, não foi evidenciada a diminuição concomitante da densidade óptica, o que indica uma ação bactericida. VENENA et al. [24] também observaram uma ação bactericida para a lactococcina B produzida por L. lactis subsp. cremoris 9B4, que causou a redução de 99% de uma população de L. lactis subsp. lactis SK112, após 3 horas de incubação. Dentre as bacteriocinas de lactococos descritas na literatura, verifica-se que a lactostrepcina Las 5 de L. lactis subsp. cremoris 202 [26] e a bacteriocina S50 de L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis S50 [14] apresentaram um modo de ação bactericida. As lactostrepcinas 10 e 300 [15], a diplococcina 346 [7], as bacteriocinas de L. lactis subsp. lactis 3, 6 e 26 [5], a lacticina 481 [21] e a lactococcina B de L. lactis subsp. cremoris 9B4 [24] foram bacteriolíticas.

Comparando-se o modo de ação da bacteriocina produzida por ITAL 383, com atividade final de 3,2×10³UAml^-1, com a de CNRZ 150 e a nisina de ATCC 11454, ambas com 1,6×10³UAml^-1 verifica-se que o mecanismo de ação sobre L. innocua LIN 11 é bacteriolítico, porém, com intensidade de ação distinta. A bacteriocina de ITAL 383, mesmo com maior atividade, apresentou capacidade de inibição menor, com destruição máxima de células de 68,2%, quando comparada a CNRZ 150 (99,9%) e ATCC 11454 (99,8%). Diferenças no modo e na velocidade de ação foram relatadas por CILANO et al. [6] para bacteriocinas de lactococos que foi dependente da linhagem examinada. Esses resultados demonstram uma importância da seleção da cultura indicadora utilizada para a definição do mecanismo de ação das bacteriocinas, em decorrência de alterações na estrutura e composição da parede celular desses microrganismos [6].

Os resultados do efeito das bacteriocinas de L. lactis subsp. lactis ITAL 383 (atividade final de 6,4×10³UAml^-1) e de CNRZ 150 e da nisina de ATCC 11454 (ambas com atividade de 3,2×10³UAml^-1) em diferentes fases de crescimento celular de L. innocua LIN11 são apresentados nas Figuras 2A, 2B e 2C, respectivamente. Foram considerados 4 tempos: 0:00, 1:30, 3:00 e 5:00 horas correspondendo, respectivamente, à fase estacionária, ao início, ao meio e ao final da fase exponencial de crescimento. Observa-se uma maior ação das bacteriocinas sobre células de L. innocua LIN11 em fase exponencial de crescimento (início, meio e final). A redução de células viáveis (D ciclos logarítmicos) variou de 2,1, 2,9 e 2,1 para ITAL 383, de 2,3, 3,1 e 2,4 para ATCC 11454 e de 2,6, 3,4 e 2,3 para CNRZ 150, respectivamente. A intensidade de ação das bacteriocinas foi maior para as células na metade da fase exponencial de crescimento. Na fase estacionária, o efeito das bacteriocinas foi menor, com reduções máximas de 1,1, 1,2 e 1,3 para ITAL 383, ATCC 11454 e CNRZ 150, respectivamente.

Esses resultados demonstram que o estado fisiológico de culturas sensíveis tem grande influência na susceptibilidade à ação das bacteriocinas; células metabolicamente ativas são mais sensíveis. EMIN [9] observou que a nisina purificada (20UIml^-1) teve maior eficiência sobre células de L. innocua na fase exponencial de crescimento (início e meio) [9], enquanto PIARD et al. [21] relataram que 90% de células de L. lactis subsp. cremoris nessa mesma fase de crescimento foram inibidas após 1 hora de contato com lacticina 481 e, somente 50% de células na fase estacionária. O mesmo foi observado por DAVEY [7] para a diplococcina de Lactococcus lactis subsp. cremoris 346. Ao microscópio eletrônico, as células de lactococos na fase estacionária de crescimento, apresentam danos menores em sua estrutura após terem sido tratadas com a nisina. Porém, elas perdem completamente a capacidade multiplicação [16].

3.2 – Capacidade de adsorção e a influência do pH

Os resultados de capacidade de adsorção das bacteriocinas de L. lactis subsp. lactis ITAL 383 e CNRZ 150 e da nisina de ATCC 11454 sobre células de L. innocua LIN 11, em diferentes valores de pH são apresentados nas Figuras 3A, 3B e 3C, respectivamente. Observa-se que a adsorção às células sensíveis foi muito rápida e influenciada pelo pH do meio de suspensão. Em pH 6,0, adsorção máxima de 75% foi verificada para a bacteriocina de ITAL 383 e de 87,5% para ATCC 11454 e CNRZ 150, logo após o contato com as células. A adsorção também ocorreu em pH 8,0, sendo mais rápida para ATCC 11454 e CNRZ 150, com 50% de adsorção logo após o contato, enquanto para a de ITAL 383 foram necessários 10 minutos. A redução do título inicial após o contato com células sensíveis foi relatada para bacteriocinas de L. lactis subsp. lactis contra S. pyogenes [6] e L. monocytogenes [5]. Perda completa de adsorção ocorreu em pH 2,0 para as três bacteriocinas avaliadas. Em pH 4,0, adsorção de 50% da bacteriocina de ITAL 383 ocorreu após 20 minutos, enquanto a bacteriocina de CNRZ 150 e a nisina de ATCC 11454 apresentaram 50% de adsorção logo após o contato.

Segundo HURST [13], a adsorção da nisina sobre células sensíveis é dependente do pH, com um máximo em pH 6,5. Considerando-se 100% de adsorção nesse valor, 69% ocorreu em pH 5,5 e somente 43% em pH 4,3. Portanto, os resultados obtidos nesta pesquisa são similares, pois considerando-se 100% de adsorção em pH 6,0, verifica-se que 67% foi adsorvida em pH 4,0 e 33% em pH 8,0, após 20 minutos de contato com a bacteriocina de ITAL 383, enquanto 57% de adsorção ocorreu em pH 4,0 e 14% em pH 8,0, logo após o contato com a bacteriocina de ATCC 11454 e a nisina de CNRZ 150. Da mesma forma YANG et al. [25] verificaram que adsorção máxima da nisina em células produtoras de L. lactis subsp. lactis ATCC 11454 e em células indicadoras de Lactobacillus plantarum NCDO 955 ocorreu em pH 6,5. Perda completa de adsorção foi observada em valores de pH £ 3,0.

4 – CONCLUSÕES

As bacteriocinas produzidas por L. lactis subsp. lactis ITAL 383 e CNRZ 150 apresentaram um modo de ação e um mecanismo de adsorção similares ao da nisina de ATCC 11454. O efeito foi substancialmente bactericida, com a lise de células de L. innocua LIN 11. As três bacteriocinas foram bastante ativas contra células em fase exponencial de crescimento, com intensidade maior para as que se encontravam na metade dessa fase. A adsorção às células sensíveis foi muito rápida e influenciada pelo pH do meio de suspensão, com adsorção máxima em pH 6,0 e logo após o contato inicial. Completa perda de adsorção ocorreu em pH 2,0.

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 — AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo auxílio financeiro e ao Dr. Jean Richard, que proporcionou treinamento à primeira autora em seu laboratório no Institut National de Recherches Agronomiques – INRA, Jouy-en-Josas, França.

² Pesquisadores - ITAL-Centro de Tecnologia de Laticínios. Cx Postal 133, CEP 13.073-001. Campinas SP, Brasil. E-mail: [e-mail]

³ Professor - UNICAMP-Departamento de Ciência de Alimentos. Campinas SP, Brasil

* A quem a correspondência deve ser enviada.

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¹

Recebido para publicação em 06/04/98. Aceito para publicação em 18/03/99.

Trabalho extraído da Tese de Mestrado em Ciência dos Alimentos da primeira autora

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Dez 1999
• Data do Fascículo
  Jan 1999

Histórico

• Aceito
  18 Mar 1999
• Recebido
  06 Abr 1998