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Food Science and Technology (Campinas)

versão On-line ISSN 1678-457X

Ciênc. Tecnol. Aliment. v.19 n.1 Campinas Jan./Abr. 1999

http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20611999000100015 

Resistência de quatro genótipos de amendoim à produção de aflatoxina B1 após inoculação com Aspergillus flavus link1

 

Guilherme PRADO2, Marize Silva OLIVEIRA2,*, Jovita Eugênia Cruz GAZZINELLI-MADEIRA2, Ignácio José GODOY3, Benedito CORRÊA4, Roberto Gonçalves JUNQUEIRA5, Solange Oliveira FERREIRA6

 

 


RESUMO

Avaliou-se a produção de aflatoxina B1 pelo Aspergillus flavus IMI 190443, inoculado em sementes de genótipos de amendoim: Tatu Vermelho, VRR-245, 2117 e 2155, in natura e autoclavado a 1210 C por 20 minutos, previamente cultivados no Centro Experimental do Instituto Agronômico de Campinas, em 1995/96. A aflatoxina B1 foi quantificada por cromatografia em camada delgada, utilizando comparação visual com padrões. Os níveis de aflatoxina B1 das amostras autoclavadas e in natura dos genótipos Tatu Vermelho, VRR-245 e 2155 foram significativamente diferentes (p <0,05, Teste de Duncan) quando comparados aos níveis do genótipo 2117. O genótipo 2117, originário da Índia, apresentou independente do processo com e sem aquecimento os menores níveis de aflatoxina B1 em relação aos dos outros genótipos. Os resultados obtidos mostram perspectivas de exploração da resistência varietal no controle da aflatoxina.

Palavras-chave: resistência, amendoim, aflatoxina B1.


SUMMARY

RESISTANCE OF AFLATOXIN B1 PRODUCTION BY ASPERGILLUS FLAVUS LINK ITS INOCULATION ONTO FOUR PEANUTS GENOTYPES. The levels of aflatoxin B1 in postharvest peanuts were evaluated after inoculation of seeds of four different genotypes : Tatu Vermelho, VRR-245, 2117 e 2155 with Aspergillus flavus IMI 190443. Field trials were conducted in 1995/96 at the Experimenal Center of the Instituto Agronômico de Campinas. The postharvest seeds were used in natura or autoclaved at 121 oC for 20 minutes prior to inoculation with the mold. The aflatoxin B1 was quantified by thin layer chromatography (TLC) using a visual comparation with standards. The levels of aflatoxin B1 in autoclaved and in natura seeds were significantly different (p < 0,05) between the genotypes Tatu Vermelho, VRR-245, 2155 and the 2117. Samples of genotypes 2117, originating from India, presented the lowest levels of aflatoxin B1 irrespective of heating treatment or not, when compared with the others. The results show possibilities of doing explorations about the varietal resistance in the aflatoxin control.

Keywords: resistance, peanut, aflatoxin B1.


 

 

1 – INTRODUÇÃO

A biodeterioração de sementes e grãos, no campo e durante o armazenamento, limita o acondicionamento seguro e o valor nutricional desses alimentos. Os fungos e insetos são provavelmente os mais importantes organismos que provocam deterioração. Eles podem afetar cor, odor, sabor, valor nutricional, bem como produzir micotoxinas, como as aflatoxinas [15].

Aflatoxinas são produtos do metabolismo secundário de Aspergillus flavus eAspergillus parasiticus, ocorrendo após a fase de crescimento exponencial dos fungos [2, 3], podendo contaminar uma grande variedade de alimentos, principalmente o amendoim no Brasil [9, 16, 17], quando condições ambientais adequadas são encontradas, como temperatura entre 25-30 0C e atividade de água superior a 0,86 [8, 10].

Devido aos efeitos carcinogênicos, mutagênicos e teratogênicos, as aflatoxinas representam um risco à saúde humana e animal, havendo pois a necessidade de desenvolver medidas de controle durante o processo de produção de alimentos: cultivo, colheita, armazenamento e transporte [21].

O processo de produção de aflatoxinas nos alimentos pode ser interrompido mediante aquecimento ou refrigeração [5]. No entanto, métodos utilizados para a destruição das aflatoxinas já elaboradas não são totalmente efetivos [7] e, além disso, causam alterações indesejáveis nos alimentos, tais como perda de su-bstâncias nutritivas e mudanças no aroma e sabor [18]. Por isso outras alternativas estão sendo buscadas para se evitar a produção de aflatoxinas nos alimentos. Uma delas é a pesquisa de novos genótipos de amendoim resistentes à infecção pelo fungo e à produção de aflatoxinas [4, 6, 22]. Entretanto, a baixa produtividade destes genótipos e a instabilidade desta resistência frente a fatores climáticos e geográficos, tornam a pesquisa nessa área limitada [18].

O objetivo deste trabalho foi verificar a resistência de quatro genótipos de amendoim à produção de aflatoxina B1 por Aspergillus flavus.

 

2 – MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Genótipos avaliados

Quatro genótipos foram estudados, a saber: Tatu Vermelho, cultivar do grupo Valência plantado em larga escala no Brasil; acesso de germoplasma VRR-245, do tipo Spanish, destacado em trabalhos anteriores [12] pela maior resistência à produção de aflatoxina, e os acessos 2117 e 2155 dos tipos Valência e Spanish, respectivamente. Os três acessos de germoplasma são introduções do ICRISAT (International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics), Índia.

O plantio foi feito no Centro Experimental do Instituto Agronômico de Campinas, em solo classificado como Latossolo Roxo, em 13/11/95, e consistiu de parcelas subdivididas em blocos ao acaso com 4 repetições. As parcelas experimentais correspondentes aos genótipos consistiram de 3 linhas de plantas, com 4m de comprimento, espaçadas de 0,7m. A colheita foi efetuada aos 112 dias após o plantio, e as vagens das 4 parcelas foram reunidas em amostras únicas e homogêneas, perfazendo 4 amostras, correspondendo aos 4 genótipos. As vagens foram acondicionadas com sacaria convencional de colheita de amendoim e submetidas à secagem ao sol até atingirem a umidade para armazenamento (10-11%).

2.2 – Amostragem e preparo da amostra

As amostras foram, em seguida, descascadas manualmente. De cada amostra retiraram-se, ao acaso, 3 kg de grãos para as análises de laboratório.

Para a determinação inicial de aflatoxinas (verificação de contaminação durante o cultivo e pós-colheita), as amostras (2 kg) foram moídas e homogeneizadas. Posteriormente, foram passadas em peneira de abertura 0,84mm, procedendo-se, em seguida, o quarteamento até 1,0kg.

Para avaliar a resistência dos quatro genótipos, quanto à contaminação com aflatoxinas após inoculação de uma cepa de Aspergillus flavus, metade da amostra (500g) foi previamente autoclavada a 121ºC por 20 minutos para destruição da microbiota natural [11]. A outra parte (500g) foi mantida em condições in natura. Portanto, o delineamento estatístico consistiu de um esquema fatorial 4x2 (4 genótipos x autoclavado e in natura), totalizando 8 tratamentos, tendo sido realizadas 4 repetições por tratamento.

2.3 – Cepa de Aspergillus flavus

Foi utilizada uma cepa de Aspergillus flavus IMI 190443, isolado de pistache da Turquia, forte produtora de aflatoxina B1 , proveniente do International Mycological Institute (Inglaterra).

2.4 – Metodologia

2.4.1 - Determinação da microbiota fúngica inicial das amostras in natura

Foi seguido o método descrito por SWANSON et al.[20], onde dez gramas de cada amostra, previamente moída, foram diluídas em 90ml de tampão salina fosfato (PBS), obtendo-se dessa maneira a diluição 10-1 . Seguiram-se diluições seriadas (decimais) até 10-5, empre-gando-se o mesmo diluente. Alíquotas de 1ml, de cada diluição, foram misturadas a 15ml de ágar batata dextrose acidificado (pH 5,6), fundido e resfriado a 45oC, seguido de homogeneização. Após a solidificação do ágar, as placas foram incubadas a 25oC, durante 7 dias.

As colônias fúngicas foram selecionadas e identificadas de acordo com os métodos recomendados [1, 14].

2.4.2 - Preparo da suspensão de esporos

A cepa de A. flavusIMI 190443 foi inoculada em placa de Petri contendo o meio de AB (Ágar Batata Glicose) e incubada por 7 dias a 37oC. Após a esporulação, uma alçada de esporos foi transferida para um tubo de Eppendorf, contendo aproximadamente 1,5ml de Tween 0,1%, com posterior agitação por 1 minuto para dispersão dos esporos. Transferiram-se, então, 200µl desta suspensão para um Erlenmeyer de 250ml, contendo 25ml do meio de AB solidificado e seguindo-se incubação a 37oC por 7 dias para esporulação. Após esse tempo, adicionaram-se 20ml de Tween 0,1% no frasco e 10 pérolas de vidro, agitando-se gentilmente e transferindo-se o sobrenadante para um outro Erlenmeyer. O número de esporos/ml da suspensão foi calculado pela Câmara de Newbauer e ajustado para 103 esporos/ml.

2.4.3 - Inoculação das amostras

Para a inoculação nos genótipos avaliados, utilizaram-se 5ml dessa suspensão para cada 15g de amendoim inteiros. Seguiu-se, então, incubação por 7 e 14 dias a 25oC, para as amostras autoclavadas e in natura, respectivamente.

2.4.4 - Determinação de aflatoxinas

Foi utilizado o método descrito por SOARES E RODRIGUEZ-AMAYA [19] para a quantificação de aflatoxina B1.

2.4.5 - Determinação da atividade de água

Para a determinação da atividade de água nas amostras in natura, aproximadamente 10g de amostra de cada genótipo foi colocada no aparelho "NOVASINA", pré-calibrado com soluções salinas saturadas, conforme orientação do fabricante.

2.5 – Análise estatística

Os resultados obtidos foram avaliados e submetidos à análise de variância, sendo as médias comparadas pelo Teste de Duncan a 5% de probabilidade.

 

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Análise da microbiota fúngica, aflatoxinas e atividade de água das amostras pós-colheita

Através do estudo das amostras de amendoim, foram isolados os seguintes gêneros fúngicos: Penicillium spp. (50,0%), Geothrichum (50,0%), Fusarium spp. (12,5%) e Cladosporium (12,5%). O gênero Aspergillus não foi isolado.

Ao considerar o número de unidades formadoras de colônias por grama de alimento (UFC/g), a contaminação média das amostras de amendoim foi de 2,0 x 103 UFC/g, variando de 0 a 4,0 x 103 UFC/g. Não foram detectadas aflatoxinas em nenhumas das amostras, sugerindo que as práticas agrícolas de cultivo, colheita, armazenamento e transporte foram adequadas.

Com relação à atividade de água, as amostras analisadas apresentaram valores entre 0,51 e 0,53, considerados abaixo dos níveis mínimos para que ocorra crescimento de fungos e produção de micotoxinas [3, 8].

Convém salientar que a baixa umidade das amostras de amendoim e o não-isolamento de A. flavus e A. parasiticus são fatores que justificam a ausência de aflatoxinas no substrato inicial.

3.2 – Análise de aflatoxina após inoculação

Os valores de aflatoxina B1 obtidos no experimento, após inoculação, tanto nas amostras in natura quanto nas autoclavadas, estão apresentados na Tabela 1. Pode-se verificar que os níveis encontrados foram elevados, e podem ser explicados pelo potencial toxigênico da cepa inoculada e condições adequadas de temperatura e umidade.

 

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Quando se compara a produção de aflatoxina B1 entre os genótipos, tanto nas amostras in natura quanto nas autoclavadas, observou-se que o genótipo 2117 apresentou os menores níveis de contaminação, sugerindo uma maior resistência à infecção pelo fungo e/ou à produção de aflatoxina. Resultados semelhantes foram encontrados por PRADO et al.[13] quando foi comparada a produção de aflatoxina B1 pelo Aspergillus flavus IMI 190443 , nos genótipos Tatu Vermelho e 2117, após 21 dias de incubação. Não houve diferença significativa entre os valores de produtividade agrícola dos dois genótipos, indicando que o 2117 possa ser uma possível opção de cultivo no Brasil [13].

O genótipo VRR-245, que em experimento anterior utilizando-se a cepa de Aspergillus flavus NRRL 5940 mostrou moderada resistência à produção de aflatoxina B1 em relação ao genótipo Tatu Vermelho [12], não repetiu o mesmo desempenho, tanto nas amostras in natura quanto nas autoclavadas. Isto sugere que essa resistência pode estar condicionada ao isolado e/ou ao seu potencial toxigênico, além de indicar possível interação entre isolados e genótipos de amendoim. MEHAN et al. [4] trabalhando com diferentes genótipos de amendoim, na Índia, verificaram que o VRR-245, após inoculação com Aspergillus flavus, foi mais resistente à produção de aflatoxinas, indicando que condições ambientais, como umidade e temperatura, são também fatores que podem influenciar uma maior ou menor resistência à produção de aflatoxina.

Observou-se também, com exceção do genótipo 2155, que os níveis de aflatoxina B1 foram superiores nas amostras autoclavadas, indicando que o processo de aquecimento altera a estrutura do vegetal ou seus mecanismos de defesa de maneira diferente, quando se compara um genótipo com outro. Uma outra explicação, no caso das amostras in natura, pode ser o efeito competição da microbiota natural presente com a cepa de Aspergillus flavus, [3, 7]. A utilização de outras maneiras de destruição da microbiota natural, como irradiação e descontaminação superficial podem contribuir para uma melhor avaliação.

Os resultados obtidos com os genótipos estudados mostram perspectivas de exploração da resistência va-rietal no controle das aflatoxinas. Entretanto, além do conhecimento dos mecanismos indutores dessa resistência, é necessário conhecer melhor as variações como as observadas nos genótipos VRR-245 e 2117, em função da cepa de Aspergillus utilizada, do seu potencial toxigênico, do processo de inoculação em si e das condições de cultivo e colheita.

 

4 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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5 – AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo auxílio financeiro.

 

 

1 Recebido para publicação em 14/04/98. Aceito para publicação em 18/03/99.

2 Fundação Ezequiel Dias - Divisão de Bromatologia e Toxicologia. Rua Conde Pereira Carneiro, 80, Gameleira. Belo Horizonte - MG - Brasil - 30510-010.

3 Instituto Agronômico de Campinas - Caixa Postal 28 - Campinas -SP.

4 Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Microbiologia da Universidade de São Paulo, 05508-900, SP.

5 Faculdade de Farmácia, Departamento de Alimentos - Universidade Federal de Minas Gerais - Av. Olegário Maciel, 2360. Belo Horizonte - MG.

6 Bolsista de Aperfeiçoamento Científico da FAPEMIG.

* A quem a correspondência deve ser enviada.