Aminoácidos livres e uréia durante a fermentação de mosto de Chardonnay com diferentes leveduras

Free aminoacids and urea during the fermentation of Chardonnay must with different yeasts

Aminoácidos livres e uréia durante a fermentação de mosto de chardonnay com diferentes leveduras¹

Sandra Valduga DUTRA², Carlos Eugenio DAUDT²,^*, Marcelo SOUZA³

RESUMO

A análise de aminoácidos e uréia durante a fermentação da cultivar Chardonnay, fermentada com diferentes leveduras, foram os principais objetivos deste trabalho. Os mostos foram coletados em Santana do Livramento, RS, transportados para a UFSM; lá foram divididos em dois lotes aos quais foram adicionadas diferentes leveduras: Saccharomyces cerevisiae Fermol Bouquet e Saccharomyces cerevisiae D47. O aminoácido encontrado no mosto em maior quantidade foi a prolina (327 mg/L) seguido por treonina, arginina e alanina (239 mg/L). A maioria dos aminoácidos foi consumida pelas leveduras, logo após o início da fermentação. A liberação máxima de uréia no meio coincidiu com o máximo de consumo de arginina, que para a levedura Fermol Bouquet foi com 15ºBrix e para a levedura D47 com 11ºBrix. Confirmando a pouca preferência de prolina pelas leveduras, o teor deste aminoácido permaneceu elevado durante o processo fermentativo. Os aminoácidos, arginina, alanina, treonina, serina, ácido aspártico e isoleucina podem ser considerados as melhores fontes de nitrogênio para as leveduras.

Palavras-chave: Aminoácidos, arginina, prolina, uréia, mosto, vinho

SUMMARY

Free aminoacids and urea during the fermentation of chardonnay must with different yeasts. Amino acids and urea analyses during fermentation of Chardonnay must with different yeasts were the main aim of this work. The grapes were harvested and crushed in Santana do Livramento, RS, Brazil and brought to the Department of Food Science and Technology of the Federal University of Santa Maria; there, they were divided in two lots to which were added Saccharomyces cerevisiae Fermol Bouquet and Saccharomyces cerevisiae D47, respectivelly. Proline (327 mg/L) was the amino acid found in the highest amount in the must while treonine, arginine and alanine (239 mg/L) were next. Almost all the amino acids were used by the yeasts at the beginning of fermentation. On the other hand, the maximum excretion of urea happened at the maximum consumption of arginine. This maximum was at 15ºBrix in the fermentation with the yeast Fermol Bouquet and at 11° Brix with D47. Proline, as expected, is not an amino acid preferred by the yeast; on the contrary, arginine, alanine, threonine, serine, aspartic acid and isoleucine can be considered a much better source of nitrogen to the yeasts.

Keywords: amino acids, arginine, proline, urea, must, wine

1 – INTRODUÇÃO

Compostos nitrogenados são importantes para o metabolismo das leveduras. O conteúdo inicial de nitrogênio total do mosto e a quantidade relativa individual de constituintes nitrogenados afetam o crescimento das leveduras, velocidade de fermentação e formação do produto final [2]. A quantidade de nitrogênio total em mostos é muito variável. Essa variação depende principalmente da cultivar, da região e das condições do solo [5]. De acordo com KLIEWER [8], 60% a 90% do conteúdo de nitrogênio em mostos de uvas está presente na forma de aminoácidos livres, sendo os mais importantes entre as viníferas a arginina e prolina. De acordo ainda com KLIEWER [9] a cv. Chardonnay pertence ao grupo de cultivares com baixo conteúdo de arginina e alto de prolina.

O conhecimento da composição de mostos é importante para o enólogo por várias razões, entre as quais, porque aminoácidos livres servem como nutrientes para leveduras e bactérias durante a fermentação alcoólica e maloláctica [10]. Os aminoácidos livres mais abundantes em mostos são geralmente arginina, glutamina, prolina, alanina, ácido glutâmico, treonina, serina e ácido aminobutírico, representando de 80% a 90% do teor total de aminoácidos [20]. Em certas cultivares, a prolina representa entre 80% e 90% do nível de aminoácidos livres totais [4]. O íon amônia e os aminoácidos glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, arginina, serina, alanina são todos excelentes fontes de nitrogênio para Saccharomyces. Portanto, a quantidade e qualidade de nitrogênio viável apresenta um importante papel na cinética da fermentação [13].

A arginina, durante a fermentação, é metabolizada pelas leveduras produzindo ornitina e uréia, que é uma das substâncias precurssoras de carbamato de etila [16]. Este éster, resultado da reação entre a uréia e etanol, é um composto carcinogênico [11], porém seu risco é relativamente baixo se comparado com certas nitrosaminas e micotoxinas [7].

PEREIRA et al. [19] estudaram o efeito da adubação nitrogenada nos teores de arginina e uréia no mosto e encontraram 585mg/L de arginina na testemunha, 618mg/L no tratamento normal (100kg de N/ha) e 686,4mg/L no tratamento dobro (200kg de N/ha). À medida que aumentava a adubação nitrogenada, maior era o teor de arginina no mosto e o teor de uréia no vinho. Os valores mínimos e máximos de uréia foram respectivamente de 1,0mg/L e 2,7mg/L.

A cepa da levedura e o teor de alfa-amino nitrogênio (menos prolina) em suco de uva são importantes fatores na determinação da quantidade residual de uréia em vinhos, havendo diferenças significativas entre cepas e cultivares [16].

O trabalho foi realizado com o objetivo de determinar a quantidade de aminoácidos livres no mosto da cv. Chardonnay e o comportamento de diferentes leveduras na utilização destes aminoácidos e excreção de uréia durante a fermentação.

2 – MATERIAL E MÉTODOS

As uvas Chardonnay utilizadas neste trabalho foram provenientes de Santana do Livramento, RS, foram desengaçadas e esmagadas manualmente para a obtenção dos mostos e foram fermentadas após serem divididas em diferentes lotes e sofrerem a adição de duas diferentes leveduras: Saccharomyces cerevisiae Fermol Bouquet e Saccharomyces cerevisiae D47. Antes da fermentação os mostos foram corrigidos no teor de açúcar para 22ºBrix com o uso de sacarose. Amostras foram periodicamente retiradas a cada 3ºBrix aproximadamente e congeladas para posterior análise.

A uréia foi analizada segundo o método preconizado por ALMY & OUGH [1], modificado por PEREIRA & DAUDT [18]. Para a análise de aminoácidos livres, as amostras sofreram um pré-tratamento para a eliminação de pigmentos, lipídios e proteínas de acordo com SANDERS & OUGH [21]; em resumo, em 1mL de vinho ou mosto adicionaram-se 2mL de 0,1% de ácido trifluoracético em 70:30 H₂O: metanol. Uma coluna C18 foi ativada com lavagem sucessiva de 20mL de metanol, 20mL de 0,1% de ácido trifluoracético em água e 10mL de 0,1% ácido trifluoracético em 80:20 H₂O: metanol. Antes de passar na coluna, a amostra foi filtrada num filtro com poros de 0,22mm. Após a passagem da amostra, foi adicionado 1mL de 0,1% de ácido trifluoracético e o eluente recolhido. Os aminoácidos foram analisados pelo método de derivatização pós coluna com ninidrina e separação por cromatografia de troca aniônica. A análise foi realizada seguindo procedimento padrão, num analisador de aminoácidos Hitachi L-8500. As determinações dos aminoácidos livres foram realizadas no laboratório do Centro Brasileiro de Seqüenciamento de Proteínas – UNB ( Universidade de Brasília – DF)

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tabela 1 amostra o resultado dos principais aminoácidos encontrados no mosto da cv. Chardonnay e a percentagem que eles representam na quantidade de aminoácidos livres. Pode-se observar que o aminoácido presente em maior quantidade foi a prolina, representando 24,7% (327,5mg/L) dos aminoácidos livres totais (1.324mg/L).

Após a prolina, os aminoácidos encontrados em maior quantidade foram a treonina, representando 18% (239,8mg/L) dos aminoácidos livres, a arginina com 18% (239,4mg/L), alanina com 18% (239,1mg/L), serina com 6,7% (89,5mg/L) e ácido glutâmico com 3,4% (45,3mg/L). Esses dados concordam com aqueles encontrados por OUGH et al. [16] que definiram a prolina como o aminoácido mais encontrado na cultivar Chardonnay. A lisina não foi encontrada na cv. Chardonnay e os nove aminoácidos restantes (ácido aspártico, glicina, valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina e histidina) representam apenas 10% dos aminoácidos livres totais.

Na Figura 1 pode-se observar o consumo de arginina durante a fermentação da cv. Chardonnay com diferentes leveduras. A arginina foi considerada uma boa fonte de nitrogênio para as duas leveduras. Quando a fermentação com a levedura Fermol Bouquet atingiu 15°Brix a levedura já tinha consumido mais de 95% da arginina presente no mosto; com a levedura D47 este ponto ocorreu quando a fermentação atingiu 11ºBrix. Pela Figura 2 pode ser observado que estes pontos (15ºBrix e 11ºBrix, respectivamente), coincidiram com o ponto máximo de excreção de uréia pelas leveduras (4,7mg/L de uréia para a levedura Fermol Bouquet e 4,3mg/L de uréia para a levedura D47). Estes dados concordam com outros autores [6,20], que consideram a arginina uma boa fonte de nitrogênio para as leveduras, e concordam com MONTEIRO & BISSON [12] que encontraram um pico de liberação de uréia no ponto de máximo metabolismo da arginina. BISSON [3] encontrou durante a fermentação de Sauvignon Blanc com a levedura Montrachet um consumo de 98,3% de arginina.

A composição de aminoácidos do mosto, a cepa da levedura, a temperatura de fermentação e aeração, são fatores que influenciam a absorção de aminoácidos e liberação de uréia no vinho [17]. Trabalho realizado por DAUDT et al. [4] mostraram diferenças no consumo de arginina e liberação de uréia entre diferentes leveduras.

Na Figura 1, também pode ser observado o consumo de prolina na cv. Chardonnay, maior com a levedura Fermol Bouquet do que com a levedura D47; por ser um aminoácido que não é consumido sob as condições anaeróbias [15], este aminoácido permaneceu em grande quantidade no meio, inclusive aumentando seu teor durante a fermentação com ambas as leveduras. Isto, provavelmente, ocorreu devido ao metabolismo da arginina. BISSON [3] afirmou que a ornitina, um produto da degradação da arginina, pode ser degradada posteriormente via glutamato semialdeído até prolina. Houve um certo consumo de prolina logo no início da fermentação e posteriormente houve um aumento da mesma; este fato já havia sido citado por OUGH & STASHAK [15] que acompanharam a utilização de aminoácidos por quatro leveduras comerciais e observaram que pequenas quantidades de prolina foram usadas no início da fermentação, ocorrendo um aumento posterior.

Os resultados da Figura 3 mostram que o consumo dos aminoácidos alanina e treonina foram semelhantes ao da arginina (Figura 1) nas duas leveduras testadas; portanto, podem ser também considerados como excelentes fontes de nitrogênio para as leveduras, concordando com os resultados apresentados por MONTEIRO & BISSON [13]. Serina, ácido aspártico, isoleucina e tirosina, também apresentaram o mesmo comportamento.

Por outro lado, o ácido glutâmico, fenilalanina, valina, histidina, leucina, metionina e glicina que estavam presentes no mosto inicial em pequenas quantidades (Tabela 1), tiveram um comportamento diferenciado das fontes de nitrogênio anteriormente citadas e estão sendo motivo de estudos.

4 – CONCLUSÕES

O aminoácido encontrado em maior concentração na cv. Chardonnay foi a prolina, seguido de treonina, arginina e alanina.

A maioria dos aminoácidos é consumida logo após o início da fermentação.

O teor de prolina permaneceu elevado durante o processo fermentativo, indicando pouca preferência por parte das leveduras estudadas.

Os aminoácidos arginina, alanina, treonina, serina, ácido aspártico e isoleucina podem ser consideradas as melhores fontes de nitrogênio para as leveduras.

A maior excreção da uréia coincidiu com o consumo máximo de arginina pela levedura.

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 – AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq e a Almadén Vinhos Finos (Seagram) pelo parcial financiamento deste trabalho.

² Departamento de Tecnologia e Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de Santa Maria, 97119-900 - Santa Maria RS.

³ CBSP Centro Brasileiro de seqüenciamento de proteínas - UNB 709010-900 - Brasília DF

* A quem quem correspondência deve ser enviada.

• [1]  ALMY, J., OUGH, C. S. Urea analysis for wines. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Washington, v. 37, n. 4, p. 968-970, 1989.
• [2]  BELL, A. A., OUGH, C. S., KLIEWER, W. M. Effects on must and wine composition, rates fermentation, and wine quality of nitrogen fertilization of Vitis vinifera var. Thompson seedles grapevine. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 30, n. 2, p. 124-129, 1979.
• [3]  BISSON, L. F. Influence of nitrogen yeast and fermentation of grapes. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON NITROGEN IN GRAPES AND WINE, 1991, Washington. Anais.. Washington: The American Society for Enology and Viticulture, 1991. 323p. p. 78-89.
• [4]  DAUDT, C. E., BOEIRA, L. S., PEREIRA, C. N. Influęncia da adubaçăo nitrogenada e de linhagens de leveduras nos teores de vinhos de Vitis vinifera c.v. Cabernet Sauvignon. Cięncia e Tecnologia dos Alimentos, Campinas, v. 15, n. 2, p. 166-169, jul./dez. 1995.
• [5]  HENSCHKE, P.A., OUGH, C. S. Urea accumulation in fermenting grapes juice. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 42, n. 4, p. 317-321, 1991.
• [6]  INGLEDEW, W. M., KUNKEE, R. E. Factors influencing sluggish fermentations of grape juice. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 36, n. 1, p. 65-76, 1985.
• [7]  INGLEDEW, W. M., MAGNUS, C.A., PATTERSON, J. R. Yeast foods and ethyl carbamate formation in wines. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 38, n. 4, p. 332-335, 1987.
• [8]  KLIEWER, W. M. Changes in the concentration of free amino acids in grape berries during maturation. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 19, p. 166-174, 1968.
• [9]  KLIEWER, W. M., Methods for determining the nitrogen status of vineyards. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON NITROGEN IN GRAPES AND WINE, 1991, Washington. Anais.. The American Society for Enology and Viticulture, 1991, 323p. p. 133-147.
• [10]  KLUBA, R. M., MATTICK, L. R., HACKLER, L. R. Changes in concentration of free and total amino acids of several native american grape cultivars during fermentation. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 29, n. 3, p. 181-186, 1978.
• [11]  MIRVISH, S. S. The Carcinogenic action and metabolism of urethan and N-hydroxyurethan. Advance Cancer Research. n. 11, p. 1-42, 1968.
• [12]  MONTEIRO, F. F., BISSON, L. F. Amino acid utilization and urea formation during vinification fermentations. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 42, n. 3, p. 199-208, 1991a.
• [13]  MONTEIRO, F. F., BISSON, L. F. Biological assay of nitrogen content of grape juice and prediction of sluggish fermentation. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 42, n. 1, p. 47-57, 1991b.
• [14]  OUGH, C. S. Proline content of grapes and wines. Vitis, v. 7, p. 321-331, 1968.
• [15]  OUGH, C. S., STASHAK, R. M. Further studies on proline concentration in grapes and wines. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 25, n. 1, p. 7-12, 1974.
• [16]  OUGH, C. S., CROWELL, E. A., MOONEY, L. A. Formation of ethyl carbamate precursors during grape juice urea and ammonia: effects of fortification on intracellular (Chardonnay) fermentation. I Addition of amino acids,and extracellular precursors. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 39, n. 3, p. 243-249, 1988.
• [17]  OUGH, C. S., HUANG, Z., AN, D., and STEVENS D. Amino acid uptake by four commercial yeast at two different temperatures of growth and fermentation: effects on urea excretion and reabsorption. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 42, n. 1, p. 26-40, 1991.
• [18]  PEREIRA, C. N., DAUDT, C. E. Uréia: sua determinaçăo e presença em vinhos brasileiros. Cięncia e Tecnologia dos Alimentos, Campinas v. 15,n. 1, p. 101-103, 1995.
• [19]  PEREIRA, C. N., DAUDT, C. E., BOEIRA, L. C. Arginina e uréia em mostos fermentados com quatro leveduras diferentes. I Vitis vinifera cultivar Gewurztraminer de Garibaldi. Cięncia e Tecnologia dos Alimentos, Campinas, v. 15, n. 3, p. 236-238, 1995.
• [20]  RAPP, A., VERSINI, G. Influence of nitrogen compounds in grapes on aroma compounds of wines. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON NITROGEN IN GRAPES AND WINE, 1991, Washington. Anais.. Washington: The American Society for Enology and Viticulture, 1991. 323p. p. 156-164.
• [21]  SANDERS, E. M., OUGH, C. S. Determination of free amino acids in wine by HPLC. American Journal of Enology and Viticulture, Davis, v. 36, n. 1, p. 43-46, 1985.

¹

Recebido para publicação em 24/05/98. Aceito para Publicação em 21/05/99.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Fev 2000
• Data do Fascículo
  Maio 1999

Histórico

• Aceito
  21 Maio 1999
• Recebido
  24 Maio 1998