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Food Science and Technology

Print version ISSN 0101-2061On-line version ISSN 1678-457X

Ciênc. Tecnol. Aliment. vol.19 n.2 Campinas May/Aug. 1999

http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20611999000200021 

Hidrólise parcial enzimática da gordura de babaçu1

 

Andréa Lícia de Almeida OLIVEIRA2, Luiz Antonio GIOIELLI3,*, Maricê Nogueira OLIVEIRA3

 

 


RESUMO

Lipases são enzimas de origem animal, vegetal ou microbiana que catalisam a hidrólise total ou parcial de óleos e gorduras, fornecendo ácidos graxos livres, acilgliceróis parciais e glicerol. O trabalho teve como objetivo verificar a ação da lipase comercial FAP (Amano Pharmaceutical Co.) no processo de hidrólise parcial da gordura de babaçu. Foi utilizada a Metodologia de Superfície de Resposta para representar o sistema na região estudada. O tratamento estatístico possibilitou analisar a influência das variáveis indepentes concentração de enzima (3 a 327U/mL) e tempo de reação (1 a 31h) na variável dependente: % de hidrólise. Os resultados experimentais observados nas reações, variaram de 6,52 a 41,44% de hidrólise da gordura de babaçu. Pela aplicação do modelo estatístico, os resultados estimados variaram de 13,57 a 43,80% de hidrólise. O nível de significância foi de 99% para o modelo % de hidrólise. Foi observado que 87,8% da variação da resposta pode ser explicada pela regressão múltipla, demostrando ser bom o ajustamento do modelo aos dados experimentais.

Palavras-chave: hidrólise, enzima, gordura de babaçu.


SUMMARY

Partial enzymatic hydrolysis of babassu fat. Lipases are enzymes from animal, vegetal or microbial sources, that catalise the hydrolysis of oils and fats, in order to produce free fatty acids, acilglycerols partials and glycerol. The partial hydrolysis of babassu fat by microbial lipase FAP (Amano Pharmaceutical Co.) was studied. Response surface methodology was employed in order to develop mathematical models. Statistical treatment analysed the effects of independent variables: enzyme concentration (3 to 327U/mL) and reaction time (1 to 31 h), in dependent variable: % of hydrolysis. The experimental results observed in the reactions, ranged from 6.52 to 41.44% of hydrolysis of babassu fat. By applying the statistical model, the results ranged from 13.57 to 43.80% of hydrolysis.

Keywords: hydrolysis, enzime, babassu fat.


 

 

1 – INTRODUÇÃO

A hidrólise de óleos e gorduras tem a finalidade de produzir ácidos graxos livres, acilgliceróis parciais e glicerol. Os processos usados industrialmente são físico-químicos, sob condições como 700 psi de pressão, temperatura de 100 a 2800C, por 2 a 48h. Normalmente o rendimento da hidrólise é acima de 97% e a mistura final deve ser destilada para remover os subprodutos formados durante a reação [13, 15, 33].

Lipases são enzimas de origem animal, vegetal ou microbiana classificadas como hidrolases (EC3.1.1.3), que atuam sobre as ligações ésteres de tri, di e monoacilgliceróis [20]. Elas hidrolisam somente ligações acil de lipídeos emulsificados, sendo ativas na interface água/óleo. Elas diferenciam-se das esterases, que atuam sobre ligações ésteres de substâncias solúveis em água [4]. Enzimas lipolíticas são definidas como hidrolases de ésteres contendo ácidos graxos de cadeia longa, saturados ou insaturados, com doze ou mais átomos de carbono [8].

Lipases de Candida cylindracea são empregadas comercialmente na hidrólise de sebo e óleo de linhaça em indústrias japonesas, produzindo 4000 ton de ácidos graxos por ano [9].

A reação lipolítica é reversível e, portanto, as lipases podem catalisar a formação de acilgliceróis a partir de glicerol e ácidos graxos sob certas condições [26]. As lipases podem também catalisar reações de interesterificação de óleos e gorduras, obtendo-se produtos que não são formados pelos métodos químicos de interesterificação [12].

A utilização de lipases também encontra aplicação em operações de refino de óleos vegetais, na degomagem e neutralização [14].

Em princípio, a lipase pode ser usada na forma livre ou imobilizada. Os reagentes formam duas diferentes fases, e a enzima adsorve à interface, onde é ativa [28].

A especificidade por ácidos graxos de lipases microbianas é de grande interesse teórico e industrial. Esta propriedade afeta a composição dos produtos da hidrólise de lípideos (ácidos graxos, mono e diacilgliceróis) ou a composição de ésteres graxos produzidos por síntese enzimática. A principal aplicação da especificidade por ácidos graxos (tipoespecificidade) é a produção de concentrados de ácidos graxos polinsaturados de óleos naturais (no caso de reações de hidrólise) ou ésteres graxos polinsaturados de gorduras derivadas (no caso de reações de síntese) [1].

Para minimizar a degradação térmica e o consumo de energia, o uso de lipase (triacilglicerol hidrolase, EC.3.1.1.3) como catalisador da hidrólise constitui uma alternativa ao processo químico para a produção de ácidos graxos [13].

O processo de hidrólise enzimática necessita de dois requisitos para a operação: a formação de uma interface lipídeo/água e a absorção da enzima nesta interface. Assim, quanto maior a interface, maior será a quantidade de enzima adsorvida, acarretando velocidades de hidrólise mais elevadas [24].

LINFIELD et al. [21] estudaram a hidrólise de sebo e óleos de coco e oliva utilizando lipases de Candida rugosa, Aspergillus niger e Rhizopus arrhizus. A reação em emulsão foi conduzida em sistemas de frascos agitados, obtendo-se altos valores de conversão (97-99% em 72h).

Em outro trabalho, LINFIELD et al. [22], utilizando os mesmos óleos e lipase de Candida rugosa , abordaram a influência do pH, da temperatura e de aditivos sobre a atividade enzimática, determinando também a quantidade mínima de enzima necessária para se alcançar 95 e 98% de hidrólise em 72h.

MUKATAKA et al. [25] testaram diferentes solventes para o processo de hidrólise de óleos em sistema com emulsão, verificando que o isoctano foi o mais adequado.

A hidrólise do óleo de palma foi estudada por KHOR et al. [19]. Estes autores empregaram três diferentes tipos de lipase: de Candida rugosa, de lipase de germe de trigo e pancreática de porco. Dentre as 3 lipases, a que apresentou melhores resutados foi a de Candida rugosa, com atividade ótima a 37°C e pH = 7,5.

PARK et al. [27] estudaram a hidrólise de óleo de soja com diferentes tipos de lipase, onde o principal objetivo era comparar as atividades das enzimas em sistemas isolados e em sistemas combinados com dois tipos diferentes de lipases. Após 10h de reação, os autores verificaram que os sistemas de lipases combinadas (98,0 e 99,5% de hidrólise) demonstraram-se superiores aos sistemas com apenas uma lipase (7,2 e 44,4% de hidrólise).

WANG et al. [34] analisaram a hidrólise de óleo de oliva catalisada por lipase de Candida rugosa em sistema com emulsão. Os autores não empregaram nenhum tipo de emulsificante, sendo a emulsificação realizada apenas com agitação mecânica. Foi verificado que as taxas de hidrólise com e sem emulisificante foram similares.

BILYK et al. [5] estudaram a hidrólise de diferentes óleos vegetais e animais por lipases de Candida rugosa, de Rhizomucor michei, e de pâncreas suíno, em sistemas tendo hexano como solvente. Após a reação, estes autores recuperaram a lipase por filtração e reempregaram-na no sistema, não verificando perda significativa de atividade, o que possibilitou a sua reutilização por várias vezes.

FU et al. [9] estudaram a hidrólise do óleo de oliva, óleo de soja, óleo de palma, óleo de coco e óleos hidrogenados com lipase de Aspergillus sp. A lipase tinha alta atividade específica (60000U/g) e não mostrava especificidade por posição. A lipase provou ser mais efetiva na catálise que a Lipolase de A. oryzae, com ótima atividade a 37°C e pH 6,5 a 7. A enzima foi ativada por íons cálcio mas inativada por solventes orgânicos como o isopropanol e propanona. Todos os substratos analisados podem ser hidrolisados aos ácidos graxos correspondentes com a enzima em concentração de 5 a 30U/meq, com rendimento de 90 a 99%, em tempo de reação de 2 a 24h. A lipase era estável, possibilitando a sua reutilização para hidrólise.

GHOSH e BHATTACHARYYA [10] estudaram a hidrólise enzimática de óleos comerciais de alta acidez como de coco, soja, mostarda, girassol e arroz com a intenção de produzir ácidos graxos. Acilgliceróis neutros de óleos de alta acidez foram hidrolisados por lipase de Candida cylindracea quase completamente dentro de 48h. O óleo de coco, com acidez inicial de 69,2% em ácido laúrico, foi hidrolisado à temperatura de 35° C por 48 horas, atingindo acidez final de 80%.

A metodologia de Superfície de Resposta, introduzida por BOX & WILSON em 1951, consiste em um conjunto de técnicas usadas em estudos experimentais relacionando uma ou mais varíaveis independentes a uma variável dependente [6].

Os planejamentos experimentais, com o propósito de determinar o ponto de resposta ótima, usando o menor número possível de observações, permitem estabelecer a melhor combinação de fatores [30].

RAMAMURTHI et al. [29] estudaram a aplicação desta metodologia na metilação enzimática dos ácidos graxos livres do destilado proveniente da desodorização do óleo de canola, catalisado por lipase não específica. Obteve-se conversão acima de 96,5% dos ácidos graxos em ésteres metílicos, sem a ajuda de vácuo ou agentes removedores de água. Os efeitos como temperatura, quantidade de reagentes (metanol: ácidos graxos no destilado de desodorizador) e concentração enzimática foram estudados.

HAAS et al. [16] estudaram a aplicação da metodologia de Superfície de Resposta na hidrólise de fosfatidilcolina usando lipase comercial imobilizada (Lipozyme) em meio orgânico. Essa metodologia foi empregada para examinar os efeitos na hidrólise devidos à polaridade do solvente, quantidade de água, temperatura, duração de incubação e quantidade de substrato e catalisador. A polaridade do solvente mostrou efeito no grau de hidrólise. A atividade enzimática foi mínima a 370C. O aumento da quantidade de água estimulou a atividade enzimática em solventes mais polares que o hexano, enquanto que os solventes menos polares a água inibiram a atividade.

O objetivo do trabalho foi verificar a ação da lipase comercial FAP no processo de hidrólise parcial de gordura de babaçu, empregando a metodologia da superfície de resposta.

 

2 – MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 – Materiais

A gordura vegetal de babaçu utilizada foi obtida no comércio, na forma refinada (Refinações de Óleos Brasil).

A enzima comercial LIPASE FAP, foi fornecida pela AMANO Internacional Enzyme Co. Segundo informação do fabricante, a atividade enzimática corresponde a 150.000U/g. Uma unidade representa a quantidade de enzima que libera 1 micromol de ácido graxo por minuto, nas condições do teste. Esta enzima é produzida de uma cultura submersa única de Rhizopus e possui alta atividade lipolítica.

2.2 – Acidez

A acidez foi determinada por via titulométrica, utilizando-se solução de NaOH 0,1N, segundo as normas da AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY [2], método Ca 5a-40. O resultado é expresso em porcentagem de ácido graxo livre, tomando como base o peso molecular médio dos ácidos graxos da gordura de babaçu.

2.3 – Metilação de Ácidos Graxos

Os ácidos graxos foram transformados em ésteres metílicos, segundo HARTMAN & LAGO [17], visando a análise por cromatografia em fase gasosa.

2.4 – Cromatografia em Fase Gasosa

Ésteres metílicos foram analisados em cromatógrafo a gás CG-modelo 37-D, equipado com detector de ionização de chama e integrador eletrônico mod. CG-300. Foi utilizada coluna em aço inoxidável (fase estacionária de succinato de dietilelenoglicol - DEGS a 17% sobre suporte de chromosorb W 80-100 mesh, ativado com ácido clorídrico) à temperatura de 192°C. A composição qualitativa foi determinada por comparação dos tempos de retenção dos picos com os respectivos padrões de ácidos graxos. A composição quantitativa foi realizada por normalização de área, sendo expressa como porcentagem em massa.

2.5 – Índice de Iodo

O índice de iodo foi calculado a partir da composição em ácidos graxos segundo as normas da American Oil Chemists’ Society [2], método Cd 1c-85. O resultado é expresso em gramas de iodo/100g de gordura. A equação utilizada foi a seguinte:

Índice de iodo = (% ácido octadecenóico x 0,860) + (% ácido octadecadienóico x 1,732) + (% ácido octadecatrienóico x 2,616)

2.6 – Índice de Saponificação

O índice de saponificação foi calculado a partir da composição em ácidos graxos, em função da definição do índice, que corresponde ao número de miligramas de hidróxido de potássio necessárias para saponificar 1g de óleo ou gordura. A equação utilizada foi a seguinte [31].

Índice de Saponificação = 56000/ PM médio + 12,67

onde: PMmédio = peso molecular médio dos ácidos graxos

2.7 – Índice de Peróxido

O índice de peróxido foi determinado segundo as normas da American Oil Chemists` Society [2], método Cd 8-53. O resultado é expresso em meq O2/1000g de gordura.

2.8 – Planejamento estatístico dos ensaios experimentais

Neste trabalho, o efeito das variáveis independentes: concentração enzimática (U/mL) e tempo de reação (h) e suas interações foi estudado na resposta: % hidrólise.

A Tabela 1 mostra que os ensaios foram realizados segundo um projeto ortogonal de segunda ordem, de acordo com BOX et al. [6] constituído de 12 ensaios, 8 axiais e 4 centrais, para estimar o erro experimental.

 

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No preparo dos dados para o tratamento estatístico, os valores de concentração enzimática e tempo de reação foram codificados mediante a uma relação linear variando de -1,414 a +1,414, obedecendo as Equações 1 E 2:

X1=( t-16)/10,6 (1)

X1= valor codificado da variável tempo (h)

X2=(Conc-165)/114,6 (2)

X2= valor codificado da variável concentração enzimática (U/mL)

A relação entre as variáveis independentes e a resposta não é conhecida. Portanto uma equação polinomial de segunda ordem foi usada para estabelecer um modelo matemático preditivo, cuja equação geral é [6]:

Y= bo + b1x1 + b2x2+ b11x12+ b22x22+ b12x1x2+ E (3)

onde:

Y= é a função resposta genérica
x= são as variáveis codificadas, obtidas a partir das variáveis originais
b= são os coeficientes estimados pelos métodos dos mínimos quadrados
E= é o erro experimental

2.9 – Hidrólise enzimática

As reações de hidrólise foram realizadas em um balão de 3 bocas de 1000mL, onde foram adicionados 100g de gordura de babaçu e 500mL de água destilada. Essa mistura foi agitada mecanicamente durante 10min e adicionou-se 100mL de solução de lipase. A temperatura do sistema foi mantida a 40°C (em banho de água).

Após a reação de hidrólise, transferiu-se a mistura para um funil de separação, onde ocorreu a separação da fase gordurosa por decantação.

A fase gordurosa foi filtrada em funil de vidro contendo papel filtro, por três vezes, para a obtenção de uma gordura hidrolisada límpida e livre de umidade.

O cálculo da atividade enzimática foi realizado utilizando-se a seguinte equação:

Atividade = [(A-B) x Fc x 1000 x N]/(q x C) (4)

onde:

A = volume (mL) da amostra
B = volume (mL) do branco
Fc = fator de correção
1000 = 1mL, 1N à 1000 micromoles
N = normalidade
q = tempo (min )
C = concentração (g/mL)

 

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tabela 2 indica a composição em ácidos graxos, acidez, índice de peróxido, índice de iodo calculado, índice de saponificação calculado, índice de estabilidade calculado e o total de ácidos graxos insaturados e saturados da gordura de babaçu utilizada como matéria prima.

 

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Em relação à composição em ácidos graxos, com exceção ao ácido laúrico, todos os outros ácidos graxos se encontram dentro dos limites fixados pelo Codex Alimentarius [32] para a gordura de babaçu. O ácido laúrico apresentou 34%, um valor abaixo do limite, que está entre 40 a 55%.

Contudo, resultados de literatura mostram consideráveis variações nos teores dos diversos ácidos graxos da gordura de babaçu, especialmente do ácido laúrico [3, 11].

O índice de iodo calculado obtido foi igual a 20,1g de iodo/100g de gordura, sendo superior ao valor fixado pela legislação brasileira, que é de 12 a 18g de iodo/100g de gordura. O índice de saponificação calculado obtido foi igual a 243,2mg KOH/g de gordura, sendo inferior aos limites fixados pela legislação brasileira, que estão entre 245 e 256mg KOH/g de gordura [7].

Em relação à acidez, a gordura de babaçu apresentou 0,1% em ácido oléico e encontra-se dentro do limite fixado pela legislação, que é de, no máximo, 0,3% em ácido oléico, para óleos e ou gorduras refinados. Isso mostra que na matéria prima empregada não há praticamente ácidos graxos livres.

O índice de peróxido mede o oxigênio ativo presente no óleo ou gordura. Segundo a legislação, o limite para óleos e ou gorduras refinados, é de 10 meq O2/1000g de gordura. A gordura de babaçu apresentou 0,8 meqO2/1000g de gordura, evidenciando o bom estado de conservação da matéria-prima.

Todas as reações de hidrólise foram realizadas à temperatura de 40° C. Contudo, LINFIELD et al. [21] mostraram que a velocidade de hidrólise de sebo, gordura de coco e óleo de oliva, pela lipase de Candida rugosae, não era afetada pela variação de temperatura na faixa de 26 a 46° C.

As reações foram realizadas sem o uso de solução tampão. Esta não apresenta efeito decisivo na hidrólise e, em escala industrial, esta reação pode ser conduzida em meio aquoso [13]. A principal virtude do tampão parece estar na geração de resultados mais reprodutíveis, o que é importante quando se trata de métodos analíticos de atividade enzimática de lipases [18, 21, 22, 23]. Outro fator importante para essa determinação é o tempo de reação. Dados referentes ao início do processo tendem a ser um pouco erráticos porque o controle de tempo é crítico e a ação enzimática poderia continuar um pouco antes da lipase ser desnaturada quimicamente ou pelo calor. Dados referentes às fases finais da hidrólise também podem desviar da linearidade, porque os mono e diacilgliceróis, bons agentes emulsificantes para triacilgliceróis e ácidos graxos, foram consumidos em tal extensão que o sistema não é mais uma emulsão e, portanto, a área interfacial é grandemente reduzida [21, 22, 23].

A Tabela 3 indica a atividade enzimática obtida na hidrólise parcial da gordura de babaçu. Empregando 165U/mL de lipase e tempo de reação de 31h obteve-se a maior taxa de hidrólise (41,44%). A maior atividade lipolítica específica foi 22.740U/g, obtida em concentração enzimática de 165U/mL e 1h de reação. Este valor corresponde a 15% daquele informado pelo fabricante para a atividade enzimática. A menor atividade lipolítica específica foi 566U/g, para concentração enzimática de 279,6U/mL e 26,6h de reação. GIOIELLI et al. [13], trabalhando com a mesma lipase (F-AP, Amano Pharmaceutical Co.) na hidrólise de gordura de babaçu, obtiveram atividades enzimáticas específicas variando entre 6.300 e 107.000U/g, em função do tempo de reação, concentração enzimática e presença ou não de tampão.

 

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Para cada reação de hidrólise enzimática parcial da gordura de babaçu os dados obtidos foram tratados estatisticamente, sendo submetidos à regressão múltipla com a finalidade de propor um modelo polinomial que represente cada sistema na região estudada.

Os valores finais médios encontrados experimentalmente para a acidez, apresentados na Tabela 4, variaram de 6,52 a 41,44%.

 

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Os coeficientes não significativos foram eliminados (p>0,05), obtendo-se a seguinte equação ajustada:

Y= 38,461 + 4,08x1 + 8,39x2 - 6,51x22 (5)

O resultado do ajuste do modelo mostrou ser a % de hidrólise dependente dos termos lineares tempo de reação (x1), concentração de enzima (x2) e do termo quadrático concentração de enzima (x22). O coeficiente quadrático b11 da variável x1 e a interação entre as variáveis mostraram-se não significativos estatisticamente.

A variação de resposta (R2) indica o coeficiente de determinação da regressão efetuada. O valor obtido mostra que 87,8% dos pontos se ajustam ao modelo, demonstrando ser bom o ajustamento do modelo aos dados experimentais.

Assim, o modelo preditivo descrito anteriormente (Equação 4) pode ser usado para estimar os valores de % de hidrólise, em função das variáveis estudadas. Os valores ajustados pelo modelo podem ser vistos na Tabela 4 e situam-se dentro do intervalo de confiança calculado.

As superfícies de resposta e linhas de contorno gerados através do modelo (Equação 4) mostram a representação tri e bi-direcional, respectivamente, da relação entre a variável resposta (% hidrólise) e as variáveis independentes codificadas, tempo de reação e concentração de enzima (Figuras 1 e 2).

 

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Não foi possível obter o ponto ótimo, ou seja, a maior % de hidrólise, no menor tempo de reação, com a menor concentração de enzima. Isto ocorreu porque o planejamento experimental não cobriu esta faixa, que corresponderia a maiores tempos de reação.

Considerando a Figura 2, para tempo de reação de 16h (codificado por X1=0) e 40% de hidrólise, é necessário empregar solução enzimática nas concentrações de 193,7U/mL (codificado por X2=0,25) ou 285,3U/mL (codificado por X2=1,05). Portanto, a metodologia de superfície de resposta fornece, para este exemplo, duas possibilidades de realizar a reação obtendo o mesmo resultado. Portanto, opta-se pela condição mais vantajosa, ou seja, a menor concentração da solução enzimática.

 

4 – CONCLUSÕES

Em relação à composição da gordura de babaçu, com exceção ao ácido laúrico, todos os outros ácidos graxos se encontraram dentro dos limites fixados pelo Codex Alimentarius. O ácido laúrico apresentou 34%, um valor abaixo do limite, que está entre 40 a 55%.

Empregando 165U/mL de lipase e tempo de reação de 31h obteve-se a maior taxa de hidrólise (41,44%). A maior atividade lipolítica específica foi de 22.740U/g, obtida em concentração enzimática de 165U/mL e 1h de reação.

Os valores médios encontrados experimentalmente para a acidez variaram de 6,52 a 41,44%. O resultado do modelo mostrou ser a % de hidrólise dependente dos termos lineares tempo de reação (x1), concentração enzimática (x2) e do termo quadrático concentração de enzima (x22), segundo a seguinte equação:

Y= 38,461 + 4,08x1 + 8,39x2 - 6,51x22

O coeficiente quadrático b11 da variável x1 e a interação entre as variáveis mostraram-se não significativos estatisticamente. O nível de significância e o erro padrão para a % de hidrólise foram p=0,01 e 4,818, respectivamente. A variação de resposta (R2) mostrou que 87,8% dos pontos obtidos se ajustaram ao modelo, demonstrando ser bom o ajustamento do modelo aos dados experimentais.

Não foi possível obter o ponto ótimo, ou seja, a maior % de hidrólise, no menor tempo de reação, com a menor concentração de enzima. Isto ocorreu porque o planejamento experimental não cobriu esta faixa, que corresponderia a maiores tempos de reação.

 

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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6 – AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelas bolsas concedidas aos autores.

 

 

1 Recebido para publicação em 05/01/99. Aceito para publicação em 16/08/99.

2 Professora da Universidade de Mogi das Cruzes.

3 Professores do Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP. Caixa Postal Caixa Postal 66083, CEP 05315-970, São Paulo-SP.

* A quem a correspondência deve ser enviada.

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