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Food Science and Technology (Campinas)

versión On-line ISSN 1678-457X

Ciênc. Tecnol. Aliment. v.19 n.3 Campinas set./dic. 1999

http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20611999000300008 

Inibição da síntese da ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em maçãs frigoconservadas em atmosfera controlada1

 

Paulo Dejalma ZIMMER2, Jaqueline Dettmann BIERHALS3, Jorge Adolfo SILVA2, Cesar Valmor ROMBALDI4,*

 

 


RESUMO

Foi estudada a expressão da ACC oxidase em maçãs, cv. Jonagold, colhidas no estádio pré-climatérico e armazenadas sob refrigeração em atmosfera normal (0oC, 95% UR - AN) e controlada (0oC, 95% UR, 1,5% O2 e 2,5% CO2 - AC), durante 180 dias. Na instalação do experimento, aos 90 e aos 120 dias, foram coletadas amostras para a determinação da firmeza de polpa, da acidez total titulável, dos sólidos solúveis totais, da produção de etileno, da atividade ACC oxidase e para a detecção imunoquímica das isoformas desta enzima. A dosagem da atividade ACC oxidase foi realizada por cromatografia gasosa a partir de extrato protéico solúvel acrescido de 250µM de ACC, 10µL de sulfato ferroso e 30µL de ascorbato de sódio. Para a detecção imunoquímica utilizou-se a técnica "western blot", com anticorpos policlonais anti-ACC oxidase de maçã, após separação das proteínas em eletroforese e isoeletrofocalização. Não foi detectada ACC oxidase em maçãs pré-climatéricas. Porém, após 120 horas em condições ambientais, houve a síntese dessa enzima e um incremento na produção de etileno. A refrigeração não exerceu controle na síntese da ACC oxidase e produção de etileno, resultando em significativas perdas físico-químicas nas frutas armazenadas em AN. Já a utilização de AC permitiu controlar a via de biossíntese do etileno, pela inibição da síntese da ACC oxidase, mantendo o material com boa qualidade para o consumo in natura. A adição de ACC e dos cofatores aumentou a atividade ACC oxidase e alterou o pI da ACC oxidase.

Palavras-chave: maturação, isoformas, frigoconservação.


SUMMARY

Inhibition of (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) oxydase synthesis in apple fruits by controlled atmosphere storage. This experiment was carried out to evaluate the inhibition of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) oxidase in apple fruits by controled atmosphere. Jonagold apples were stored in normal atmosphere (NA) and controlled atmosphere (CA) storage. The fruits were harvested at the preclimateric stage and stored for 120 days at 0oC and 95±5% RH with O2 set to 1,5% and CO2 set to 2,5% (CA) or without gas control (NA). At 90 and 120 days after harvesting, samples were collected to study the ethylene production by gas chromatography, ACC oxidase activity by gas chromatography and immunoblotting protein characterization by western blot, using specific polyclonal antibodies against ACC oxidase from apple fruit. Nevertheless, ACC oxidase was detected and the ethylene production was increased for those fruits stored by 120 hours under room temperature. Apples stored in NA did not control the ethylene production and ACC oxidase synthesis. However, apples stored in CA had the ethylene biosynthesis controlled and showed an ACC oxidase synthesis inhibited. In climacteric apples, the ACC oxidase activity increased by ACC, Fe+2 and ascorbat addition in the enzymatic extract. Protein analysis by isoelectricfocusing showed three proteins with pIs 5.95, 5.87 and 5.78. Those with smallers pIs were detected in the presence of substrate and cofactors.

Keywords: ripening, isoforms, apple storage.


 

 

1 – INTRODUÇÃO

O processo de deterioração de frutas é variado e tem, de maneira geral, como causas principais, o próprio processo de senescência, as injúrias físicas e mecânicas, os danos causados por microorganismos e por outros seres, as alterações puramente químicas e os distúrbios fisiológicos [1, 15, 25].

A velocidade e a intensidade com que estas alterações ocorrem são dependentes das características genotípicas [7, 14], das condições edafoclimáticas e de cultivo [14], da colheita e do armazenamento [5, 6].

As ações implementadas visando prolongar o período de conservação das frutas in natura estão baseadas na redução da atividade metabólica do produto e de organismos associados.

Para a conservação de maçãs, a refrigeração, em atmosfera convencional ou normal (AN) e em atmosfera controlada (AC), tem sido o método mais empregado [5, 6, 7, 14].

Estudos recentes [5, 6] têm mostrado que, em AN, o período de conservação de maçãs das principais cultivares plantadas no Rio Grande do Sul e Santa Catarina é de 4-5 meses e preconizam o uso da AC para prolongar este período.

A AC permite, pela redução da concentração de O2 e aumento da concentração de CO2, reduzir a atividade respiratória, o crescimento de fungos e os distúrbios fisiológicos [5]. Além disso, ela permite reduzir significativamente a produção e a ação do etileno [7, 14, 25]. Este fitoregulador desempenha papel fundamental na regulação do processo deteriorativo intrínseco [16]. Sua via de biossíntese compreende a conversão da S-adenosil-metionina (SAM) em ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano (ACC) sob a ação da ACC sintase, e a conversão do ACC em etileno, CO2 e HCN (ácido cianídrico), pela ACC oxidase. O ACC, precursor imediato do etileno, pode ser malonilado, sob a ação da enzima N-malonil transferase (NMT), e ser então transportado para os vacúolos [1, 15, 24].

As duas enzimas-chave na via de biossíntese do etileno são a ACC sintase e a ACC oxidase [8, 15]. A primeira foi isolada, purificada, seqüenciada e vários clones e genes foram caracterizados em várias espécies vegetais [1, 15]. A ACC oxidase só foi purificada em 1992 [10, 11], graças às descobertas de VERVERIDES & JOHN [31] que verificaram que esta enzima era dependente de ferro, ascorbato e CO2. A partir daí, várias enzimas e cDNAs, incluindo as do tomate [4, 26, 28], do melão [2, 3, 19], da maçã [11, 12, 13, 17, 21], da pêra [20] e de flores [30] foram isoladas.

A descrição destes clones possibilitou o estudo da regulação de genes da enzima. BOUZAYEN et al. [4] isolaram e caracterizaram a família gênica da ACC oxidase em tomate. Estes autores isolaram três genes denominados efe1, efe2, e efe3, apresentando homologia de seqüência de 85%. A análise da seqüência primária das proteínas destes genes permitiu calcular os respectivos pontos isoelétricos (pIs): efe1 (4,99), efe2 (6,14) e efe3 (5,09). A partir daí, TANG et al. [30], caracterizaram três genes da ACC oxidase em flores de petúnia (ph-aco1, ph-aco2 e ph-aco3) sem, no entanto, calcularem os respectivos pIs. LASSERE et al. [19] realizaram o mesmo trabalho em melão e isolaram os genes cm-aco1 (pI 4,97), cm-aco2 (pI 5,59) e cm-aco3 (pI 4,97).

O estudo da expressão diferencial destes genes mostrou que apenas um deles é responsável pela maturação de tomates e de melão, respectivamente, efe1 e cm-aco1. PICTON et al. [26] verificaram que em tomates verde-imaturos e verde-maduros não havia presença de mRNA correspondentes ao efe1. Entretanto, nestes estádios de maturação foi detectada uma proteína ACC oxidase com atividade in vivo [8, 28] e in vitro [27]. As causas desta contorvérsia não foram demonstradas.

O controle da produção de etileno pode ser obtido através da atenuação da síntese e/ou da atividade das enzimas SAM, ACCS e/ou ACCO ou indução da enzima NMT [15].

As frutas mantidas sob refrigeração têm baixa produção de etileno, mas aceleram o metabolismo deste fitoregulador logo que são removidas das câmaras frias. Em conseqüência, observam-se intensas reduções de firmeza de polpa e aumento da atividade respiratória [32].

Quando associa-se à refrigeração, o controle da concentração de gases (¯ O2 e ­CO2), a redução da produção de etileno é mais pronunciada. As causas desta diminuição ainda não foram demonstradas.

Nesse contexto, o trabalho teve por objetivo estudar o efeito da atmosfera controlada na síntese, atividade e expressão de isoformas da ACC oxidase em maçãs da cv. Jonagold.

 

2 – MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 – Material vegetal

Foram utilizadas maçãs (Malus domestica Borkh), cv. Jonagold, colhidas em pomares comerciais da empresa RASIP-SA, em Vacaria-RS, safras 95/96 e 96/97. A colheita das frutas foi realizada em dois estádios de maturação: 1) verde-imaturo e 2) verde-maduro ou pré-climatérico. As frutas verde-imaturas foram avaliadas na colheita e 120 horas após. Já as maçãs colhidas no estádio pré-climatérico foram pré-resfriadas e armazenadas em AN a 0° C e 95% de umidade relativa (UR), e em AC a 0° C, 95% UR, 1,5% O2 e 2,5% de CO2, durante 4 meses.

2.2 – Análises físicas, químicas e imunoquímicas

Na instalação do experimento, aos 90 dias e aos 120 dias de armazenamento, coletaram-se 3 amostras de 10 frutas cada para a determinação da firmeza da polpa, sólidos solúveis totais (SST), acidez total titulável (ATT), produção de etileno e atividade ACC oxidase. Estas análises foram efetuadas 24 horas e 120 horas após a retirada das frutas das câmaras frias. Também, realizou-se "western blot" para monitorar a síntese da ACC oxidase e suas isoformas.

A firmeza de polpa foi determinada com o auxílio de um penetrômetro manual, com ponteira de 11mm, e os resultados foram expressos em Newton (N).

Os sólidos solúveis totais foram determinados através de refratômetro e os resultados foram expressos em ºBrix.

A acidez total titulável foi realizada por titulometria de neutralização e os resultados foram expressos em meq. de NaOH.100mL de suco-1.

A produção de etileno foi determinada por cromatrografia gasosa e os resultados foram expressos em nL de etileno.h-1.g-1. Neste caso, as amostras de aproximadamente 1,5 Kg, foram incubadas em frascos de 5L, hermeticamente fechados, durante 1 hora. Passado este período, foi coletado 1mL da atmosfera gasosa para a dosagem de etileno.

A atividade ACC oxidase in vitro foi determinada baseando-se nas condições preconizadas por DUPPILE et al. [12]. Para cada ensaio, 1g de maçã foi congelado em nitrogênio líquido, desintegrado mecanicamente e homogeneizado em 2mL de tampão Tris-HCl 100mM, pH 7,4, contendo 10% (v/v) de glicerol, 30mM de ascorbato de sódio, 1% (m/v) de polivinilpirrolidona e 5mM de ditiotritol. O material foi mantido sob agitação durante 30 minutos a 4° C e, em seguida, centrifugado a 45.000g durante 30 minutos. O sobrenadante foi submetido a uma dessalinização em coluna P-D10 previamente equilibrada com Tris-HCl 100mM, pH 7,4. O eluído, doravante denominado extrato solúvel, foi utilizado para a determinação da atividade ACC oxidase. A dosagem propriamente dita, foi realizada avaliando a produção de etileno obtida após 30 minutos de incubação, a 26° C, do extrato solúvel, acrescido de 250mM de ACC, ou de 250mM de ACC e 10mM de sulfato ferroso, ou de 250mM de ACC, 10mM de sulfato ferroso e 30 mM ascorbato de Na. Como controle foi utilizado extrato protéico solúvel sem adição do substrato e dos cofatores.

Para a avaliação da síntese da ACC oxidase e a presença de isoformas, utilizou-se a técnica de "western blot", que compreende as etapas de extração, separação eletroforética, eletrotransferência e imunodetecção.

A extração das proteínas para SDS-PAGE (sodium dodecil sulphate – polyacrilamide gel electrophoresis) seguiu as recomendações descritas por MEYER et al. [22]. Para a isoeletrofocalização adaptou-se a metodologia de LELIÈVRE et al. [20], de maneira que as proteínas foram dissolvidas em uma solução contendo 9M de uréia, 5 % (v/v) de b-mercaptoetanol, 2 % (v/v) de Nonidet P-40 e 5 % (v/v) de anfolinas (pI 3,0-10,0) e depositadas na extremidade do gel correspondente ao ânodo. As soluções nas câmaras correspondentes ao cátodo e ao ânodo foram, respectivamente, H3PO4 25mM e NaOH 50mM. A isoeletrofocalização foi realizada aplicando-se, progressivamente, 150V durante os primeiros 30 minutos e 200V por 150 minutos. Em seguida, o gel de isoeletrofocalização foi incubado durante 20 minutos em tampão LAEMMLI [18], como etapa preparatória para a SDS-PAGE.

Para a determinação do gradiente de pH, as pistas foram fracionadas em pedaços de 0,5cm de comprimento, e incubadas durante 1 hora em 1mL de KCl 10 mM. A massa molecular dos diferentes polipeptídeos foi determinada utilizando-se marcadores de um kit da Bio Rad.

A eletrotransferência das proteínas para membranas de nitrocelulose (Bio Rad) 45m m foi realizada durante 1 hora a 130 V, num tampão Tris 25mM – Glicina 192mM, pH 8,3, contendo 20% (v/v) de metanol. A imunodetecção foi realizada seguindo as recomendações de ROMBALDI et al. [22] adaptadas para maçã por CHAVES et al. [8].

2.3 – Delineamento experimental

O experimento foi realizado segundo um delineamento experimental inteiramente casualizado, segundo um esquema fatorial 3 x 3 x 2 (sistemas de armazenamento x período de armazenamento x período para a análise pós-armazenamento), com 3 repetições de 10 frutas cada.

 

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Expressão da ACC oxidase e produção de etileno

Em maçãs verde-imaturas não foi detectada a presença da ACC oxidase (Figura 1-1), mesmo quando essas maçãs foram mantidas em condições ambientais não controladas durante 120 horas (Figura 1-2). Nessas mesmas condições, a produção de etileno foi muito baixa, nunca ultrapassando 0,5 nL.g-1.h-1 (Tabela 1), citado como nível máximo para materiais classificados como fracamente produtores de etileno [1].

 

 

 

 

Em maçãs colhidas no estádio pré-climatérico também não foi detectada ACC oxidase (Figura 1-3). Porém, quando elas foram mantidas durante 120 horas em condições ambientais, houve síntese e acúmulo da proteína (Figura 1-4). Nesse mesmo período observou-se um aumento na produção de etileno de 4 para 13nL.g-1.h-1 (Tabela 1). Isso se deve, provavelmente, ao fato de a operação de colheita constituir-se em um estresse indutor e ao sistema autocatalítico de produção de etileno já estar ativo [8, 29].

Em maçãs colhidas no estádio pré-climatérico e armazenadas durante 90 dias em AN (Figura 1-5), a ACC oxidase estava presente. A manutenção dessas frutas durante 120 horas em condições ambientais, induziu a síntese da ACC oxidase, evidenciada pela maior intensidade da reação imunoquímica (Figura 1-6). Correlacionado a essa variação, houve um incremento na produção de etileno passando de 28 para 37nL.g-1.h-1 (Tabela 1). Esse comportamento indica que somente a refrigeração não é suficiente para controlar a síntese da ACC oxidase, nem para reduzir a produção de etileno. Além disso, as baixas temperaturas mostraram-se como agente indutor da síntese dessa enzima quando as frutas foram retiradas da câmara fria.

LELIÈVRE et al. [20] observaram que as baixas temperaturas (0 a 4° C) durante o armazenamento de pêras, cv. Passe Crassane, estimulam a produção autocatalítica do etileno, agindo como sinal indutor dos genes das enzimas ACC sintase e ACC oxidase. Além disso, eles demonstraram que as frutas dessa cultivar necessitam de um período de, no mínimo, 12 semanas de estocagem a baixas temperaturas para que o processo de maturação ocorra normalmente. Entretanto, citam que, dependendo da espécie e do cultivar, bem como do período de estocagem, o efeito das baixas temperaturas pode ser variado, agindo às vezes como agente indutor, às vezes como inibidor ou às vezes sem nenhuma interferência no processo de maturação/senescência.

Quando estendeu-se o período de frigoconservação para 120 dias em AN (Figura 1-9), houve um importante acúmulo de ACC oxidase. A manutenção das maçãs durante 120 horas em condições ambientais não controladas (Figura 1-10) acentuou esse fenômeno, sem, no entanto, ter-se observado um marcante aumento na produção de etileno (Tabela 1). Nessa fase, as frutas apresentavam características de senescência avançada.

O uso de AC foi mais eficiente no controle da síntese da ACC oxidase (Figura 1-7 e 1-11) do que a AN (Figura 1-5 e 1-9). Segundo KADER, ZAGORY & KERBEL [14], a redução da concentração de O2 e o aumento da concentração de CO2, nas condições de AC, proporcionam uma redução da taxa respiratória, da atividade clorofilase, da síntese de carotenos e de compostos antociânicos e da produção e da ação do etileno. DUPILLE et al. [12] demonstraram que a baixa produção de etileno em maçãs, cv. Golden Delicius, armazenadas em AC, não é devida à deficiência de ACC nas células vegetais. Os resultados apresentados (Figura 1) demonstram que esse comportamento está relacionado com a inibição da síntese da ACC oxidase, já que nenhuma quantidade dessa proteína foi detectada em maçãs frigoconservadas em atmosfera controlada durante 90 (Figura 1-7) e 120 dias (Figura 1-11).

A manutenção das maçãs em condições ambientais não controladas por 120 horas, após 90 dias (Figura 1-8) e 120 dias (Figura 1-12) de armazenamento em AC, induziu a síntese da ACC oxidase. Como conseqüência, a produção de etileno também aumentou, passando de 10 para 86,5nL.g-1.h-1 em frutas estocadas durante 90 dias em atmosfera controlada e de 13 para 90nL.g-1.h-1 (Tabela 1) naquelas frutas armazenadas durante 120 dias nas mesmas condições.

3.2 – Parâmetros de qualidade

O estudo das características físico-químicas das frutas mostrou que as maiores variações da firmeza de polpa, da ATT e dos SST foram detectadas em maçãs armazenadas em AN (Tabela 1). Aos 90 dias de estocagem em AN, as maçãs apresentavam valores de firmeza de polpa limitantes para o consumo in natura. Isso se agravou quando as maçãs foram retiradas da câmara fria e mantidas em condições ambientais por 120 horas. Além disso, as frutas apresentavam-se num estádio de senescência avançado, caracterizado pelo declínio da produção de etileno. Embora trabalhando com outra cultivar, BRACKMAN & SAQUET [5] e BRACKMAN, ARGENTA & MAZARO [6] também observaram comportamento similar.

Tendência semelhante foi observada em maçãs armazenadas em AC, embora esse sistema tenha proporcionado uma melhor preservação da firmeza da polpa, da ATT e dos SST das maçãs. A remoção destas frutas da câmara de estocagem resultou num importante incremento na produção de etileno. Essas alterações estão associadas à aceleração do processo de maturação/senescência, estimulado pelo aumento da temperatura e da concentração de O2 e pela diminuição da concentração de CO2. O etileno é citado como o principal responsável pela aceleração do metabolismo de materiais climatéricos [24] e o incremento na sua produção como a causa indutora dessas alterações [14]. Do ponto de vista metabólico, o aumento da síntese desse fitoregulador, tanto em frutos armazenados em AN quanto em AC, indica que houve preservação da integridade biológica das células [7, 20]. Do ponto de vista tecnológico, isso implica na utilização de meios para controlar a produção e/ou a ação do etileno após a remoção do material das câmaras de estocagem.

3.3 – Propriedades bioquímicas da ACC oxidase

A análise dos resultados apresentados na Figura 2 mostra que a adição de 250m M de ACC ao extrato solúvel aproximadamente quadruplicou a atividade ACC oxidase, passando de 30 (± 3) para 140 (± 7) nL.mg-1.h-1, indicando que a produção de etileno nessas frutas ainda é limitada pela concentração de substrato. A suplementação do meio com os cofatores sulfato de ferro na concentração de 10 mM e de ascorbato de sódio na concentração de 30 mM permitiu um aumento na atividade ACC oxidase de 140 (± 7) para 260 (± 5) nL.mg-1.h-1 e de 260 (± 5) para 300 (± 4) nL.mg-1.h1, respectivamente. DONG, FERNANDEZ-MACULET & YANG [10], DUPILLE et al. [11], JOHN & DOPNING [13] e VERVERIDES & JOHN [31] também demonstraram que esses cofatores aumentam a atividade ACC oxidase.

 

 

JOHN & DOPNING [13] citam que na reação de oxidação do ACC em etileno há formação de radicais peróxidos, potenciais catalisadores de reação de proteólise, podendo gerar peptídeos de menor peso molecular. A detecção de bandas protéicas de menor peso molecular também já havia sido relatada por KUAI & DILLEY [17]. No entanto isto não foi verificado nos extratos protéicos de maçãs Jonagold analisados (Figura 2A, pistas 1 a 4) onde, em todos os tratamentos, foi detectada uma única banda protéica, de peso molecular em torno de 37 kDa.

Entretanto, a adição de substrato e de cofatores afetou o pI desta proteína (Figura 2B). A adição de ACC ao extrato solúvel (Figura 2B, pista 2) proporcionou o surgimento de uma segunda banda protéica, de pI 5,87. Com a adição de Fe+2 ou ascorbato de sódio (Figura 2B, pistas 3 e 4, respectivamente), detectou-se uma terceira banda protéica de pI 5,78.

O estudo da estrutura primária das proteínas dos genes da ACC oxidase de tomate [4] e de melão [19] indica a existência de três isoformas, resultantes da expressão diferencial dos genes.

Já os estudos realizados com a ACC oxidase de maçã, cv. Jonagold, indicam que há uma única proteína de 37kDa e de pI5,95. O surgimento de isoformas de pI5,87 e 5,78 se deve à presença do substrato (ACC) e dos cofatores. CHOU & FASMAN [9] citam que alterações das regiões expostas das proteínas, provocadas pela interação com substrato e cofatores, podem alterar o balanço de cargas, gerando moléculas com pI distintos. Portanto, neste caso, a presença de isoformas não se deve à expressão de diferentes genes da ACC oxidase.

 

4 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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5 – AGRADECIMENTOS

À Capes e ao CNPq pela concessão de bolsas, à FAPERGS e ao Pólo de Alimentos pelo suporte financeiro, à RASIP-SA pelo fornecimento do material vegetal e ao Laboratoire Éthylène et Maturation des Fruits do ENSAT de Toulouse/França, pelo auxílio técnico.

 

 

1Recebido para publicação em 27/10/98. Aceito para publicação em 08/10/99. Abreviaturas: ACC: Ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano; AC: atmosfera controlada; AN: atmosfera normal; SDS-PAGE: sodium dodecil sulphate – polyacrilamide gel electrophoresis.

2Engo Agro, MSc., Doutorando no Centro de Biotecnologia/UFPEL

3Engo Agro MSc. em Ciência e Tecnologia Agroindustrial

4Professor Adjunto, Dr., DCTA/FAEM/UFPEL, CP 354. Laboratório de Biotecnologia de Frutas e Hortaliças - Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial. Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel - Universidade Federal de Pelotas. End.: DCTA/FAEM/UFPEL, Cx.P. 354, Campus Universitário, Tel.: (0532) 75-7258. E-mail: cesarvrf@ufpel.tche.br. 96010-900 - Pelotas – RS – Brasil.

* A quem a correspondência deve ser enviada.