Eficiência de um kit de ELISA na detecção e quantificação de aflatoxina M1 em leite e investigação da ocorrência no estado de Minas Gerais

Efficiency of an ELISA kit on the detection and quantification of aflatoxin M1 in milk and it's occurrence in the State of Minas Gerais

Eficiência de um kit de ELISA na detecção e quantificação de aflatoxina M₁ em leite e investigação da ocorrência no estado de Minas Gerais¹

Scheilla V. C. SOUZA²,³, Eugênia A. VARGAS⁴, Roberto G. JUNQUEIRA³,^*

RESUMO

Procedimentos para validação intralaboratorial de kits de ELISA foram adotados na verificação da eficiência de um kit para detecção e quantificação de aflatoxina M₁ em leite. Foram realizados ensaios com soluções padrões fornecidas pelo kit, amostras artificialmente contaminadas e amostras naturalmente contaminadas. Os valores médios de recuperação obtidos para os padrões do kit apresentaram-se entre 85,6 e 114,8%, com valores de coeficiente de variação entre 11,6 e 23,1%. Nos ensaios com amostras artificialmente contaminadas, foi definida uma faixa ótima de trabalho para análises quantitativas entre 0,019 e 0,090µg/L. A presença de aflatoxina M₁ em 110 amostras de leite do estado de Minas Gerais foi investigada. Cinco das 27 amostras positivas na triagem por ELISA foram confirmadas por cromatografia em camada delgada.

Palavras-chave: leite, aflatoxina M₁, validação, ELISA.

SUMMARY

Efficiency of an ELISA kit on the detection and quantification of aflatoxin M₁ in milk and it's occurrence in the state of Minas Gerais. Procedures for intralaboratory validation of an ELISA kit were adopted to verify its efficiency in aflatoxin M₁ detection and quantification in milk. Assays were accomplished with standard solutions provided with the kit, spiked samples and naturally contaminated samples. The mean recovery values obtained for the kit standard solutions were between 85.6 and 114.8%, with coefficient of variation ranging from 11.6 to 23.1%. Working with spiked samples, a concentration range for quantitative analysis (0.019 to 0.090µg/L) was defined. The occurrence of aflatoxin M₁ in 110 milk samples from the State of Minas Gerais was investigated. Five of the 27 positive samples in the screening for ELISA were confirmed by thin layer chromatography.

Keywords: milk, aflatoxin M₁, validation, ELISA.

1 – INTRODUÇÃO

A aflatoxina M₁ é o principal metabólito hidroxilado da aflatoxina B₁ presente em leite de animais que ingeriram ração contaminada por B₁ [11]. Estas toxinas apresentam potencial carcinogênico e genotóxico e toxicidades semelhantes [24].

A possibilidade de contaminação do leite e de produtos lácteos com aflatoxina M₁ é uma questão de saúde pública, principalmente por serem produtos amplamente consumidos pelo homem e constituírem a base da alimentação infantil [3].

Pesquisas sobre os níveis de contaminação do leite existente no mercado com aflatoxina M₁ têm sido realizadas nos países mais desenvolvidos, objetivando a verificação da extensão da contaminação e uma maior conscientização. Frente aos resultados obtidos, cada país tem tentado definir limites máximos de tolerância [3], sendo considerados ainda fatores políticos e econômicos [31]. A União Européia adotou o limite de tolerância máximo de 0,05µg/L [4]. O regulamento técnico do MERCOSUL sobre limites máximos de aflatoxinas estabeleceu os níveis de 0,5µg/L e 5,0µg/kg para leite fluido e em pó, respectivamente [19], sendo estes os limites internalizados pelo Brasil [9].

Pesquisas sobre a incidência de aflatoxina M₁ em leite e produtos lácteos já foram realizadas no Brasil. PRADO et al. [23] verificaram contaminação em duas das 38 amostras de leite cru do Estado de Minas Gerais, não detectando aflatoxina M₁ em 60 amostras de leite em pó analisadas. MALLMANN et al. [17] obtiveram resultados positivos para 11 das 240 amostras de leite cru analisadas no Estado do Rio Grande do Sul. SABINO et al. [25] detectaram contaminação em uma das 100 amostras de leite pasteurizado e em nove das 50 amostras de leite cru analisadas no Estado de São Paulo. Entretanto, existe ainda uma lacuna de informações sobre a aflatoxina M₁, tanto em relação à metodologia quanto à sua ocorrência [28].

Como o leite existente no comércio é uma mistura de leites de diferentes procedências, os níveis de aflatoxina M₁ são, muitas vezes, inferiores aos limites de detecção dos métodos de análise utilizados [25, 31]. De acordo com VISCONTI et al. [33], a maioria dos resultados negativos obtidos em estudos sobre incidência de aflatoxina M₁ pode ser atribuída à baixa sensibilidade dos métodos analíticos empregados. Portanto, um controle eficiente da aflatoxina M₁ em leite requer métodos analíticos de elevada sensibilidade, especificidade, precisão e exatidão, além de rapidez e facilidade [7]. Segundo SYLOS & RODRIGUEZ AMAYA [28], estudos relativos à metodologias para determinação de micotoxinas em alimentos são necessários e urgentes, visando a confiabilidade dos resultados relativos à ocorrência.

Os métodos para determinação de aflatoxina M₁ em leite utilizam, em sua maioria, extração com clorofórmio e purificação cromatográfica. Tanto a cromatografia em camada delgada (CCD) como a cromatografia líqüida de alta eficiência (CLAE) constituem as técnicas oficiais e convencionais para separação, detecção e quantificação de aflatoxina M₁ em extratos de leite [32].

A década de 80 trouxe avanços em conhecimentos relativos a biotecnologia e aos métodos de automação para detecção de contaminantes em alimentos, destacando-se, no caso das micotoxinas, as técnicas imunoenzimáticas [22]. Estas técnicas, que constituem imunoensaios os quais envolvem interações entre micotoxinas e anticorpos específicos contra homólogos de micotoxinas, têm sido utilizadas principalmente em triagens para determinação destes contaminantes. Os dois tipos de imunoensaios mais utilizados em análises de micotoxinas são ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) e radioimunoensaios [12, 15].

Na determinação de aflatoxinas por ELISA pode-se contar com elevada sensibilidade [5] e, muitas vezes, não são necessárias as etapas de extração e purificação [2, 6], o que confere rapidez e simplicidade à técnica [22]. Existem, entretanto, desvantagens como o prazo de validade limitado e a possibilidade de resultados falso positivos devido às reações cruzadas [29], que podem ser minimizadas pela utilização de anticorpos monoclonais de boa preparação [22]. Para monitoramentos de rotina têm-se dado preferência a estas técnicas simplificadas em substituição às convencionais, que são mais complexas e demoradas [30].

De qualquer forma, independente da técnica analítica empregada no método, procedimentos de validação devem ser adotados, permitindo avaliar a eficiência de cada metodologia, conhecendo seu potencial aplicativo e limitações.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência de um kit comercial de ELISA na determinação e quantificação de aflatoxina M₁ em leite e investigar a ocorrência de contaminação por esta micotoxina em amostras de leite produzido no Estado de Minas Gerais.

2 – MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Kit de ELISA

O kit avaliado foi da marca Ridascreen^®, produzido pela empresa R-Biopharm, o qual foi mantido embalado, protegido da luz e sob refrigeração até a execução dos ensaios, observando o prazo de validade.

2.2 – Padrões

Os padrões de aflatoxina M₁ utilizados foram da marca Sigma (St. Louis, MO), mantidos sob temperatura de congelamento, devidamente protegidos da luz e vedados, até o momento do preparo das soluções. As soluções padrões foram preparadas e padronizadas conforme descrito pela AOAC [1].

2.3 – Amostras artificialmente contaminadas

Foram colhidas amostras de leite cru, aleatoriamente, após ordenhas manuais diárias, na fazenda experimental do Ministério da Agricultura e do Abastecimento/Escola de Veterinária da UFMG. Estas amostras foram artificialmente contaminadas com quantidades conhecidas de soluções padrões de aflatoxina M₁.

2.4 – Amostras do Estado de Minas Gerais

No período de 1996 a 1997, foram colhidas 110 amostras de leite do estado de Minas Gerais, sendo recebidas 48 em 1996 e 62 em 1997, incluindo leite tipos A (3), B (12), C (82), vitaminado (6), esterilizado (UHT) integral (5) e desnatado (2). A colheita foi realizada sob supervisão do Serviço de Inspeção Federal (SIF) do Ministério da Agricultura e do Abastecimento.

Para amostragem representativa do leite produzido no Estado de Minas Gerais utilizou-se a divisão territorial (oito mesorregiões) e produção leiteira publicados pela Fundação Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística – IBGE [13, 14].

2.5 – Experimental

Foram utilizados kits de um mesmo lote, sendo um para os ensaios iniciais de validação, empregando os padrões do kit e amostras artificialmente contaminadas, e três para análises das amostras do Estado de Minas Gerais.

Alíquotas de 10 mL das amostras de leite, devidamente homogeneizadas, foram pipetadas para centrifugação a 3,5 x g, por 10 minutos a 10^oC, objetivando remoção da camada de gordura. Os demais procedimentos analíticos foram realizados de acordo com indicações do fabricante, contidas no manual que acompanha o kit. As medidas de absorbância foram realizadas, contra branco de ar, empregando leitora Sigma Diagnostics EIA Multi-well Reader, com filtro de 450nm.

2.5.1 - Ensaios de recuperação

Foi feita uma curva de calibração aplicando-se cada um dos seis padrões enviados (0,0; 0,005; 0,010; 0,020; 0,040 e 0,080µg/L) em oito diferentes microcavidades. Os valores de absorbância obtidos para os padrões foram multiplicados por 100 e divididos pela média dos valores determinados para o padrão 0,0µg/L, calculando-se a porcentagem de absorção. A curva de calibração foi determinada por análise de regressão, relacionando o logaritmo natural da concentração (eixo das abcissas) com a porcentagem de absorção (eixo das ordenadas).

Ensaios de recuperação foram realizados utilizando amostras artificialmente contaminadas, em níveis dentro e acima do intervalo da curva fornecida pelo fabricante do kit (0,0097; 0,019; 0,050; 0,058; 0,070; 0,078; 0,090; 0,200 e 0,970µg/L). Cada amostra artificialmente contaminada foi aplicada em cinco diferentes microcavidades. Em paralelo foram analisados brancos da amostra de leite utilizada, em duplicata, para verificação da ausência de contaminação prévia.

Com base nos valores de concentração obtidos pela equação da curva, foram calculados os valores de recuperação e coeficiente de variação para os padrões do kit e amostras artificialmente contaminadas.

2.5.2 - Análise das amostras do Estado de Minas Gerais

As amostras de leite do Estado de Minas Gerais, o ensaio controle (constituído de um branco e uma amostra artificialmente contaminada) e os seis padrões do kit foram aplicados em duplicata.

As amostras que apresentaram resultados positivos na triagem tiveram seus resultados confirmados por uma metodologia de CCD, baseada nas metodologias descritas pela AOAC [1] e KAMIMURA [16], envolvendo extração com clorofórmio, purificação em cartuchos de florisil e quantificação densitométrica [26]. As amostras positivas por CCD foram analisadas por cromatografia bidimensional [1], para nova confirmação. Nestas análises confirmatórias também foi realizado um ensaio controle constituído de branco e amostra artificialmente contaminada.

2.5.3 - Valores de referência

Os valores adotados como referência para avaliação da exatidão e precisão foram os estabelecidos CODEX [28] e internalizados pelo MERCOSUL [18], descritos na Tabela 1.

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

A curva de calibração para aflatoxina M₁, representada na Figura 1, indica linearidade da resposta com coeficiente de correlação de 0,9494. Os valores médios de recuperação para cada padrão e os coeficientes de variação entre os resultados obtidos para um mesmo padrão aplicado em diferentes microcavidades estão descritos na Tabela 2. Os valores de recuperação médios apresentaram-se entre 85,6 e 114,8% e os de CV entre 11,6 e 23,1%, todos dentro dos intervalos estabelecidos como aceitáveis (Tabela 1). Na técnica de ELISA a precisão, determinada pelos coeficientes de variação, é dependente de fatores como erros indeterminados no procedimento analítico, preparo de reagentes, volumes aplicados, homogeneização e diferenças entre as microcavidades ou conjuntos, devidas à cobertura irregular com anticorpos [34].

O estudo com amostras artificialmente contaminadas permitiu verificar a sensibilidade e eficiência qualitativa do kit, já que todas as amostras artificialmente contaminadas apresentaram resultados positivos, mesmo aquelas com níveis correspondentes a 0,0097µg/L. Foram confirmadas as informações do fabricante de que o limite de detecção do método é menor que 0,010µg/L. De acordo com PARK et al. [21] o mínimo de quantificação para o ensaio de ELISA pode ser estimado assumindo uma variação de 0,1 unidades de absorbância abaixo do valor médio obtido para o padrão zero. Portanto, aplicando o valor de A₄₅₀ = 0,853 à curva de calibração, obteve-se o limite de quantificação teórico de 0,0063µg/L.

Nos ensaios com amostras artificialmente contaminadas nos níveis 0,0097; 0,019; 0,050; 0,058; 0,070; 0,078; 0,090; 0,200 e 0,970µg/L foi determinada a faixa de linearidade da resposta, considerando-se interferências da matriz, entre 0,019 e 0,090µg/L. Para os níveis de contaminação 0,0097; 0,200 e 0,970µg/L, os valores de recuperação obtidos foram 37,0; 35,9 e 7,5% respectivamente, fora dos valores considerados aceitáveis (Tabela 1) e significativamente menores (p < 0,05; teste de Duncan [32]) que os obtidos para os outros níveis estudados. Para 0,019; 0,050; 0,058; 0,070; 0,078 e 0,090µg/L os valores de recuperação apresentaram-se dentro dos intervalos estabelecidos como aceitáveis (Tabela 1), variando de 70,0 a 104,9% (Figura 2). Quando analisadas amostras contaminadas entre 0,200 e 0,970µg/L valores de recuperação muito baixos foram obtidos. Deve-se ressaltar que o limite máximo de tolerância estabelecido pelo MERCOSUL [6] encontra-se nesta faixa, o que demonstra a necessidade de confirmação, repetindo-se o teste de ELISA com amostras diluídas ou empregando-se outra técnica analítica, sempre que resultados positivos forem obtidos.

Das 110 amostras do Estado de Minas Gerais analisadas, 27 apresentaram resultados positivos por ELISA, correspondendo a 24,5% do total das amostras analisadas. Foram considerados positivos somente os resultados superiores ao limite de quantificação teórico, que foi de 0,0063µg/L. Somente 5 das 27 amostras que apresentaram resultados positivos na triagem foram confirmadas pelo método cromatográfico [26] e pela análise bidimensional (Tabela 3). A proporção de amostras destinadas à confirmação da partida analisada, 24,5%, indica especificidade para a aplicação do referido kit, entretanto, somente 18,5% das amostras positivas por ELISA tiveram seus resultados confirmados por CCD. A não detecção da contaminação nas outras amostras pode ser atribuída à diferença entre os limites de quantificação das duas técnicas e à reações cruzadas com outras aflatoxinas ou moléculas semelhantes. Esta possibilidade de resultados presuntivos positivos reafirmam a necessidade de confirmação dos resultados após execução do ensaio de ELISA.

Das cinco amostras positivas duas eram da mesorregião Noroeste, duas do Sul/Sudoeste/Campo das Vertentes e uma da Metropolitana de Belo Horizonte. Em relação ao tipo de leite, foram positivas duas do tipo C, duas de leite vitaminado e uma do tipo B. Estas cinco amostras apresentaram níveis de contaminação abaixo de 0,5µg/L, limite estabelecido pelo MERCOSUL [19], embora em quatro delas tenha sido verificada uma contaminação superior à permitida pela União Européia, 0,05µg/L [4]. Nos procedimentos de confirmação por CCD, os resultados de recuperação obtidos para o controle foram de 90,0 e 86,9% para as quantificações visual e densitométrica respectivamente, entretanto, os valores apresentados não foram corrigidos.

Não foram observadas diferenças significativas (p > 0,05; teste de t pareado) entre os resultados de recuperação obtidos para as técnicas de CCD quantificação densitométrica e ELISA (Tabela 3). SABINO et al. [27] observaram concordância entre as técnicas CCD e ELISA quanto à detecção de aflatoxina B₁. OLIVEIRA et al. [20] observaram correlação entre os resultados obtidos por CCD e ELISA na quantificação de aflatoxina B₁ em milho.

4 – CONCLUSÕES

O kit de ELISA para análise de aflatoxina M₁ em leite empregado demonstrou eficiência qualitativa, sensibilidade elevada e especificidade considerável, características satisfatórias e esperadas para este tipo técnica. A linearidade da resposta do kit foi observada pela avaliação dos valores de coeficientes de correlação obtidos para as curvas de calibração. Com base nos parâmetros de exatidão (recuperação) e precisão (coeficiente de variação) foi verificada eficiência quantitativa do kit na faixa de 0,019 a 0,090µg/L. Nos níveis de contaminação pesquisados entre 0,200 e 0,970µg/L esta eficiência não observada. Portanto, para avaliações quantitativas em amostras de contaminação desconhecida há necessidade de um procedimento confirmatório, sempre que resultados positivos forem obtidos. Das cento e dez amostras de leite analisadas no estado de Minas Gerais cinco apresentaram contaminação por aflatoxina M₁. Todas obtiveram níveis de contaminação inferiores ao determinado pelo MERCOSUL e quatro continham níveis de toxina superiores ao estabelecido pela União Européia.

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recebido para publicação em 07/05/99. Aceito para publicação em 26/01/2000.

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A quem a correspondência deve ser enviada.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Ago 2000
• Data do Fascículo
  Dez 1999

Histórico

• Aceito
  26 Jan 2000
• Recebido
  07 Maio 1999