Ocorrência de aflatoxina M1 em leite consumido na cidade de Belo Horizonte - Minas Gerais / Brasil - agosto/98 à abril/99

Occurrence of aflatoxin M1 in milk consumed in the city of Belo Horizonte - Minas Gerais / Brasil - August/98 to April/99

Ocorrência de aflatoxina M₁ em leite consumido na cidade de Belo Horizonte - Minas Gerais / Brasil - agosto/98 à abril/99¹

Guilherme PRADO²,^*, Marize Silva OLIVEIRA², Fabiana Moreira ABRANTES³, Luciana Gonçalves SANTOS³, Carina Rodrigues SOARES⁴, Thaís VELOSO³

RESUMO

Foi verificada a incidência de aflatoxina M₁ (AFM₁) em 61 amostras de leite coletadas em Belo Horizonte / Minas Gerais – Brasil, no período de Agosto/ 98 – Abril/ 99. A quantificação foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) usando coluna de imunoafinidade como técnica de purificação. O limite de quantificação observado foi 6ng/L. As recuperações médias e coeficientes de variação foram superiores a 88,9% e inferiores a 22,4%, respectivamente. AFM₁ foi encontrada em 50 (82%) das amostras analisadas, mas em níveis inferiores a 500ng/L, que é o limite máximo permitido no Brasil.

Palavras-chave: aflatoxina M₁, leite, cromatografia líquida de alta eficiência, coluna de imunoafinidade.

SUMMARY

Occurrence of aflatoxin M₁ in milk consumed in the city of Belo Horizonte - Minas Gerais / Brasil - August/98 to April/99. Sixty one samples of fluid and powder milk from Belo Horizonte / Minas Gerais – Brasil, period of August 98/April 99, were examined for aflatoxin M₁. The quantification was done by high performance liquid chromatography using an immunoaffinity column for cleanup. The limit of quantification (LOQ) was 6 ng/L. Average recoveries and coefficients of variation were higher than 88,9% and lower than 22,4%, respectively. AFM₁ was found in 50 (82%) of the analyzed samples, but at levels lower than 500 ng/L, which is the maximum limit permitted in Brazil.

Keywords: aflatoxin M₁, milk, high performance liquid chromatography, immunoaffinity column.

1 – INTRODUÇÃO

Aflatoxinas são produtos do metabolismo secundário de fungos filamentosos (Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus), que podem contaminar os alimentos destinados ao consumo humano e animal, sendo a aflatoxina B₁ a de maior toxicidade [29].

Aflatoxina M₁ (AFM₁) é um produto de biotransformação hidroxilado, encontrado no leite de animais e mulheres lactantes que consumiram produtos contaminados com aflatoxina B₁, apresentando também atividade carcinogênica e mutagênica [2, 3, 15, 20, 28]. Em um trabalho conduzido por EL-NEZAMI et al. [3] foi verificada a exposição de crianças à AFM₁ e mães lactantes à aflatoxina B₁. Análise de leite de 73 mulheres originárias de Victória (Austrália) e 11 da Tailândia, revelou positividade para AFM₁ em uma concentração média de 71ng/L e 664ng/L, respectivamente.

Uma vez que a pasteurização ou processamento não destrói a AFM₁, e o consumo de leite principalmente pela população infantil é muito significativa, por ser um nutriente primário, é prudente que se verifique a incidência de AFM₁ nesse alimento [8, 13, 14, 16, 19, 22].

Como a relação entre a ingestão de aflatoxina e a excreção de AFM₁ no leite é muito variável (média de 1,5%), e em níveis da ordem de partes por trilhão [5, 18, 23], há necessidade da análise direta da AFM₁ no leite utilizando-se métodos analíticos de maior sensibilidade como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), usando coluna de imunoafinidade como técnica de purificação [6, 25, 27].

No Brasil, a tolerância para AFM₁ em leite, derivados e produtos lácteos foi fixada em 500ng/L [12]. Em alguns países da Europa (França, Alemanha, Bélgica, Suíça) e Japão, o limite máximo é de 50ng/L e 10ng/L, respectivamente [4], exigindo, dessa forma, um controle de qualidade cada vez mais rigoroso pelas indústrias alimentícias.

O objetivo deste trabalho foi verificar os níveis de AFM₁ em leite consumido em Belo Horizonte / MG no período de Agosto/98 – Abril/99.

2 – MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Amostras

Foram analisadas 61 amostras de leite colhidas em Belo Horizonte (MG), no período de agosto de 1998 a abril de 1999, sendo: leite pasteurizado tipo C – 18 amostras, leite esterilizado – 32 amostras e leite em pó - 11 amostras.

2.2 – Preparo da amostra

2.2.1 - Produtos em pó

A 10g de leite em pó, pesado em Erlenmeyer de 250mL, adicionou-se em pequenas porções ± 80mL de água a 50°C. Após agitação mecânica (30 minutos) e ultrasom (15 minutos), transferiu-se para balão volumétrico de 100mL e completou-se o volume com água desionizada. Seguiu-se centrifugação por 30 minutos a 4000RPM e filtração em papel Whatman nº 4. Recolheu-se, no mínimo, 60mL do leite reconstituído.

2.2.2 - Produtos líquidos

O leite integral ou desnatado foi passado diretamente através da coluna de imunoafinidade. Entretanto, algumas amostras mais gordurosas foram aquecidas a ± 37°C, centrifugadas por 15 minutos a 4000RPM e filtradas em papel Whatman nº 4 . Foi recolhido da mesma forma 60 mL de leite.

2.3 – Padrão de aflatoxina M₁

Foi utilizado padrão da marca Sigma (St. Louis, MO), dissolvido em benzeno : acetonitrila (9:1) e padronizado conforme descrito na AOAC [1].

Para elaboração da curva de calibração, preparou-se, no momento das análises uma solução intermediária (SI) em clorofórmio, de concentração de 0,1mg/mL de AFM₁. Transferiu-se então, 250mL de SI para um balão volumétrico âmbar de 5mL e concentrou-se em atmosfera de nitrogênio. Dissolveu-se o resíduo em 5mL da fase móvel de injeção água : acetonitrila (70:30) e agitou-se em ultrasom por 1 minuto, obtendo-se solução de trabalho (ST). A partir desta, foram preparadas as soluções 0,25, 0,50, 1,00 e 2,00ng/mL de AFM₁ na fase móvel de injeção anteriormente descrita. Todas essas soluções foram passadas em uma unidade de filtração com membrana de PTFE de 13mm de diâmetro e 0,45m m de poro, sendo recebidas em frascos âmbar.

2.4 – Colunas de imunoafinidade

Foram utilizadas as colunas AFM₁ G1007 da Vicam Inc. (USA), dentro do prazo de validade estabelecido e conservadas a 2-8°C até 30 minutos antes da análise, sendo adaptadas a uma seringa de vidro e conectadas a um sistema de vácuo.

2.5 – Determinação de aflatoxina M₁

O método utilizado foi o descrito por TUINSTRA et al. [27]. A AFM₁ foi extraída do leite após passagem da amostra em uma coluna de imunoafinidade. A coluna contém anticorpos monoclonais específicos que formam com a AFM₁ um conjugado antígeno-anticorpo. Todos os outros componentes do leite foram lavados da coluna com água. A AFM₁ foi então eluída com acetonitrila. Para verificar a eficiência da metodologia utilizada, foram realizadas adições em leite para se obter níveis de AFM₁ inferiores e superiores a 50ng/L.

2.5.1 - Procedimento

Transferiu-se aos poucos 50mL de leite, preparado como descrito no ítem 2.2, para a seringa de vidro permitindo sua passagem pela coluna em um fluxo de 2-3mL/minuto. Após a eluição da amostra, lavou-se a coluna com 10mL de água desionizada e deixou-se secar completamente. Após a coluna ser desconectada do sistema de vácuo, passou-se 4mL de acetonitrila, que ficou em contato com a coluna por 2-3 minutos para garantir uma completa remoção da AFM₁, e recolheu-se o eluato em um frasco âmbar de 5mL. Seguiu-se evaporação a 50°C, sob atmosfera de nitrogênio, e resuspensão imediata em 1mL da fase móvel de injeção. Agitou-se em ultrasom por 1 minuto e filtrou-se na membrana PTFE de 0,45mm de poro.

Injetou-se, então, 100mL da amostra (duplicatas) e 100mL de cada solução padrão de AFM₁ (2 repetições). A partir do cálculo da área do pico da AFM₁ do extrato da amostra e das soluções padrões, foi calculado o teor de AFM₁ na amostra.

2.5.2 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

A separação e quantificação da AFM₁ foi conduzida em um sistema de cromatografia Shimadzu com detector de fluorescência (excitação: 366mm e emissão: 428mm) e com coluna Shim-pack CLC-ODS RP-18, 5mm 4,6 x 250mm, precedida de pré-coluna Shim-pack G-ODS 5mm 4 x 10mm. A coluna foi eluída isocraticamente com água:isopropanol:acetonitrila (80:12:8) a um fluxo de 1mL/min. Nestas condições o tempo de retenção foi aproximadamente 9,5 minutos. Todos os solventes utilizados foram os recomendados para cromatografia líquida e a água foi purificada pelo sistema de ultrafiltração (Barnstead). Durante toda a análise foi borbulhado gás hélio na fase móvel.

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados de recuperação e coeficiente de variação obtidos a partir da fortificação, em triplicata, de leite com padrão de AFM₁ e utilizando o método descrito em 2.5, estão apresentados na Tabela 1.

Pode-se observar que os valores de recuperação e coeficiente de variação foram de 88,9 a 104,9% e 1,9 a 22,4%, respectivamente, na faixa de concentração de 17 a 85ng/mL de AFM₁, demonstrando a eficiência do método. Valores semelhantes de recuperação e coeficiente de variação foram encontrados por TUINSTRA et al. [27] e estão dentro de uma faixa normalmente relatada em trabalhos de quantificação de micotoxinas [7, 17, 21, 24]. O limite de quantificação encontrado foi de 6ng/L, revelando a alta sensibilidade da metodologia utilizada.

Os níveis de AFM₁ encontrados nas amostras de leite estão apresentados na Tabela 2. Observa-se que das 61 amostras analisadas, 50 (82%) apresentaram AFM₁ (6-77 ng/L). Entretanto, todas estão dentro da norma aceita no Brasil, que é 500ng/L [12], e somente 3 estariam com níveis de AFM₁ acima de 50ng/L, que é a tolerância exigida por alguns países da Europa [4]. Na Grécia, MARKAKI & MELISSARI [11] verificaram que em 81 amostras de leite pasteurizado a AFM₁ foi detectada em 72 (89%). Nenhuma apresentava AFM₁ superior a 50ng/L. Entretanto, na Tailândia, de 270 amostras de leite (cru, pasteurizado, esterilizado e em pó), 48 (18%), apresentaram valores de AFM₁ maiores que 500ng/L [9].

Estudos conduzidos em Minas Gerais por SOUZA [24], em 1996/1997, e PRADO et al. [16] em 1994, revelaram AFM₁ somente em 5 (38-79ng/L) das 110 e 2 (650-1300ng/L) das 98 amostras de leite analisadas, respectivamente. Essa baixa positividade encontrada para AFM₁, quando comparada aos dados deste trabalho, pode ser explicada pela técnica utilizada naquelas duas pesquisas, ou seja, a cromatografia em camada delgada por comparação visual, que apresenta menor sensibilidade quando comparada à CLAE.

OLIVEIRA et al. [14] detectaram, por ELISA, AFM₁ em 33 de 300 amostras de leite em pó consumido no estado de São Paulo, em níveis de 100-1000ng/L. Em Campinas (São Paulo), SYLOS et al. [26], e em Santa Maria (Rio Grande do Sul), MALLMAN et al. [10], encontraram AFM₁ em 4 das 52 (73-370 ng/L) e 14 das 275 (190-2920ng/L) amostras de leite analisadas, respectivamente.

4 – CONCLUSÕES

Os resultados encontrados para AFM₁ em leite consumido em Belo Horizonte/MG revelaram baixo nível de contaminação. Entretanto, há necessidade de um monitoramento por um período de 1-2 anos para confirmar essa tendência.

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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6 – AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Ministério da Saúde e CNPq pelo apoio financeiro.

¹

Recebido para publicação em 26/05/99. Aceito para publicação em 01/12/99.

²

Fundação Ezequiel Dias – Núcleo de Micologia e Micotoxinas – Rua Conde Pereira Carneiro, 80 – Gameleira – Belo Horizonte / MG – 30510-010.

³

Bolsistas do CNPq.

⁴

Farmacêutica – Estagiária da Faculdade de Farmácia/UFMG.

*

A quem a correspondência deve ser enviada.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Ago 2000
• Data do Fascículo
  Dez 1999

Histórico

• Recebido
  26 Maio 1999
• Aceito
  01 Dez 1999