Substâncias voláteis em mel floral e mel de melato

Volatile substances in floral honey and honeydew honey

Substâncias voláteis em mel floral e mel de melato¹

Gisélia CAMPOS²,^*, Giancarlo U. NAPPI³, Délio S. RASLAN⁴, Rodinei

AUGUSTI

⁴

RESUMO

Embora pareça existir um "flavor" característico de mel, a grande variedade de flores disponíveis para a abelha, possibilita uma grande diversidade de flavor e aroma, indicando a presença de vários componentes voláteis. Alguns destes dependem da fisiologia da abelha, dos procedimentos após a colheita e no mel de melato há também a interferência de insetos sugadores e das formigas. Várias substâncias voláteis já foram identificadas, sendo algumas características de determinados méis uniflorais. Com o objetivo de encontrar uma substância volátil característica do mel de melato, seis amostras deste tipo de mel e seis amostras de mel floral foram analisadas usando extração por arraste de gás hidrogênio e cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas. Ácido acético foi encontrado em quatro amostras de mel de melato e em uma amostra de mel floral porém, com menor abundância.

Palavras-chave:

substâncias voláteis; aroma; mel.

SUMMARY

Volatile substances in floral honey and honeydew honey. Although honey seems to possess a characteristic flavor, variety of flowers avaiable to bees gives differents flavors and aromas, indicating the presence of various volatile compounds. Some of these also depends on the phisiology of the bee, the processing after harvest and in honeydew honey there is the interference of sucking insects and ants. Many volatile substances have already been identified and some of them are specific of typical unifloral honeys. With the purpose of finding a characteristic volatile substance of honeydew honey, six samples of this kind and six floral honeys were analysed by extraction using hidrogen steam and gas chromathography with mass spectrometry. Acetic acid has been found in four honeydew honey and in one floral honey, but with less abundance.

Keywords:

volatile compounds; aroma; honey.

1 – INTRODUÇÃO

Embora pareça existir um "flavor" característico de mel, a grande variedade de flores disponíveis para a abelha, possibilita uma grande diversidade de "flavor" e aroma. Além disto, vários outros fatores podem contribuir para o "flavor" do mel como a própria fisiologia da abelha, procedimentos após a colheita em relação ao aquecimento, estocagem etc. Para o mel de melato são acrescidos outros fatores interferentes nas substâncias voláteis como a passagem pelo organismo do inseto sugador e a participação das formigas que se alimentam de melato sugando diretamente do inseto, estimulando-o a produzir mais e mantendo limpas as colônias dos afídeos.

Atualmente encontrar marcadores confiáveis para determinar a origem do mel é prioridade na pesquisa da apicultura industrial. Em relação ao mel unifloral, a análise química das substâncias voláteis que são responsáveis pelo "flavor" e aroma do mel, pode fornecer uma verdadeira "impressão digital". Porém, para esta caracterização ser mais completa, deve incluir também os compostos não voláteis, polares, aromáticos, ácidos e neutros.

A caracterização de um mel unifloral, em alguns casos já pode ser feita pela determinação dos voláteis. O mel de laranjeira é assim classificado se apresentar no mínimo 0,5% de antranilato de metila. O mel de Tília spp, apresenta o composto 8-p-menteno-1,2 diol; o mel de Calluna vulgaris, o ácido fenil lático, e o mel de Brassica napus var. oleifera, o ácido fenilpropiônico. No mel de eucalipto, entre várias substâncias, estão a acetoina (3-hidroxi-2-butano-na), octano, nonano e 2,5-hexanodiol [2, 4].

Já em 1979, GRADDON et al. [9] conseguiu detectar cerca de 160 compostos voláteis em mel, classificados em compostos oxigenados e hidrocarbonetos. Entre estes estavam os hidrocarbonetos de C₂₃ a C₃₁ sendo porém, provenientes da cera. Vários estavam presentes em todas as amostras como acetoína, hidroxiacetona, hidroximetilfurfural e álcool benzílico.

Conforme BELITZ [1] os ésteres do ácido fenil acético possuem o odor e "flavor" típicos do mel.

Na análise dos voláteis a maior parte dos picos não pode ser usada como marcadores confiáveis porque estão presentes em outros tipos de mel. Contudo, a busca de substâncias características é sempre de grande valor, para servir de subsídio para a confirmação da origem do mel. Portanto, a pesquisa de substâncias voláteis características do mel de melato significa um avanço muito grande, pois através destas, pode ser possível além de caracterizá-lo, diferenciá-lo do mel floral.

Em relação aos métodos de extração de voláteis são citados vários, como os de armadilha com carvão ativado [7], tenax [8], porapak [14]. Há a extração direta com solvente [9], "headspace" e os que utilizam processos combinados de destilação por arraste e extração por solvente [3]. Extraídos os componentes químicos voláteis, estes são injetados no cromatógrafo a gás acoplado ao espectrômetro de massas.

2 – MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Material

Amostras de mel floral e de melato provenientes de Minas Gerais e de Santa Catarina. A maior parte das amostras foi adquirida diretamente do apicultor e algumas adquiridas da Associação dos Produtores de Mel de Minas Gerais.

Reagentes: éter etílico, acetona, cloreto de cálcio anidro, carvão ativado, sulfato de sódio anidro, lã de vidro (grau PA), gás hidrogênio e nitrogênio líquido.

Rotaevaporador, frascos para "headspace", coluna de vidro do tipo capilar, tubo de vidro de dupla saída, banho-maria, bexiga de borracha com mangueira, pinça, vials com septo de silicone, agitador magnético, ultra-som, centrífuga, microsseringa, recipiente de EPS (poliestireno expansível) com tampa, mangueiras de silicone, suportes de metal, garras, bolhômetro.

2.2 – Métodos de Extração

2.2.1 - Extração por "Headspace"

Pesou-se 3g de mel em um frasco de reação com capacidade de 5mL, adicionou-se 1mL de água, agitou-se e aqueceu-se a 70°C por vários períodos de tempo que variaram de 10 a 30 minutos. Os voláteis foram coletados diretamente dos frascos através de uma microsseringa e injetados no cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama [2].

2.2.2 - Extração direta com éter

20g de mel foram colocados em erlenmeyer de 125mL e adicionados de 20mL de éter etílico. Os voláteis foram extraídos por 20 minutos sob agitação magnética e após decantação o extrato foi concentrado no rotaevaporador [9].

2.2.3 - Extração direta com acetona

5g de mel foram colocados em erlenmeyer de 5mL de capacidade e deixados em contato com 5mL de acetona durante 24 horas. Em seguida, foram submetidos a agitação por ultra som por 30 minutos. Os erlenmeyers foram colocados em banho de gelo e 1mL do sobrenadante foi transferido para um frasco lacrado, mantido em freezer até o momento da análise cromatográfica. Como teste inicial foi feita análise no cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama, com temperatura da coluna de 30°C/3 minutos com aumento de 10°C/min até 280°C.

2.2.4 - Extração dos voláteis através de armadilha em tubo capilar de carvão ativado

Pesou-se 5g de mel em tubo de vidro acoplado de um lado a um sistema de corrente de nitrogênio e do outro a uma armadilha que consistiu de uma coluna de vidro capilar, com cerca de 4cm de comprimento empacotada com 2mg de carvão ativado e selada nas extremidades com lã de vidro. Os voláteis foram extraídos por arraste por cerca de 7 horas. Decorrido este tempo, a armadilha contendo os voláteis foi colocada em um frasco de reação de vidro de 3mL de capacidade e triturada com bastão de vidro. Adicionou-se 2mL de éter e foi feita agitação magnética por 30 minutos. Uma alíquota do extrato foi injetada no cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama [7].

2.2.5 - Extração por arraste de gás hidrogênio

20g de mel juntamente com 15g de sulfato de sódio anidro, foram colocados em um tubo de vidro acoplado a uma coluna contendo 15g de cloreto de cálcio anidro. Através deste sistema mantido em banho-maria a 50-55°C, foi feito o arraste dos voláteis com gás hidrogênio a um fluxo de 12mL/min, por 3 horas. Os voláteis foram recolhidos em um frasco mergulhado em nitrogênio líquido para condensação dos mesmos. Após a extração os frascos foram lacrados com rolha de silicone e mantidos em freezer. Parte das amostras preparadas, tiveram seu extrato dissolvido em 10mL de acetona para homogeneização antes da análise cromatográfica. Os extratos das outras amostras foram centrifugados a 20G por 5 minutos, sem adição de solvente, pouco antes da aplicação no cromatógrafo a gás [13].

2.3 – Análise por cromatografia gasosa

Os extratos obtidos pelos métodos acima descritos foram inicialmente injetados no cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama, para o estabelecimento das condições de análise. Posteriormente, os mesmos extratos foram injetados no cromatógrafo a gás acoplado ao espectrômetro de massas.

Cromatógrafo a gás Intralab 3400, detetor de ionização de chama, acoplado a integrador Varian 3400 e coluna SE-54 – fase: 5% fenil, 95% dimetilpolisiloxana.

Condições de análise: temperatura do injetor 180°C, do detetor 220°C e coluna com temperatura inicial de 35°C/3 minutos até 180°C. Foram injetados 5mL dos extratos obtidos pelos métodos de extração descritos.

Em função dos resultados obtidos com os métodos de extração testados, foi escolhido o método de extração por arraste de gás hidrogênio. Foram analisadas 6 amostras de mel floral e 6 de mel de melato, sendo 4 amostras em duplicata. Estas mesmas amostras foram submetidas, em duplicata, ao processo de extração direta com acetona. Os extratos obtidos foram armazenados no freezer até o momento da análise cromatográfica.

Cromatógrafo a gás HP 5890 série II acoplado ao espectrômetro de massas 5989 A série II, coluna HP1 (100% dimetilpolisiloxana) 25m de comprimento e 0,2mm de diâmetro interno e filme 0,33µm de espessura.

Condições de análise: temperatura da fonte 250°C, do quadrupolo 100°C, temperatura do injetor 180°C, do detetor 250°C e coluna com temperatura inicial de 35°C com aumento de 3°C/min até 200°C/1min.

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foi verificado que o método de extração por "headspace" é rápido e simples mas forneceu poucos picos, indicando haver necessidade de melhorar a extração. BOUSETA et al. [2] obtiveram melhores resultados, porém o sistema era acoplado diretamente ao cromatógrafo a gás.

A extração direta com éter, forneceu maior quantidade de picos do que o "headspace". Isto era esperado, porque o éter extrai outros tipos de substâncias presentes que não os voláteis, como por exemplo, alcanos de maior peso molecular. Porém, a etapa de concentração do extrato pelo rotavapor, pode ocasionar perda de voláteis.

O teste inicial da análise cromatográfica dos voláteis obtidos pela extração direta com acetona, mostrou vários picos nas regiões de temperatura de 30 graus e também nas de 280°C, revelando a presença de compostos mais pesados. Porém, foi escolhida para região de trabalho, de 35 a 180°C na qual estão os compostos mais voláteis. As duplicatas deste método de extração forneceram resultados reprodutíveis em relação ao perfil cromatográfico, ocorrendo às vezes, diminuição na área dos picos. Este método, foi preferido ao do éter devido a alta volatilidade deste, o que dificulta a sua manipulação, além disso a acetona dissolve uma maior variedade de compostos do que o éter [10] e, finalmente porque envolve menos etapas na execução.

A extração por arraste e captura em armadilha de carvão ativado também forneceu poucos picos. Como o carvão ativado é citado na literatura como excelente armadilha de voláteis, provavelmente os voláteis foram extraídos, mas não foram totalmente dessorvidos. Este método citado por CLARK & CRONIN [7], foi desenvolvido em um sistema diretamente acoplado ao cromatógrafo à gás, o que certamente contribui muito para aumentar a eficiência do mesmo.

Os cromatogramas obtidos pelo método de extração por arraste de gás hidrogênio, mostraram vários picos, sendo que a injeção do extrato puro sem solvente, forneceu picos de áreas maiores, porque os compostos estavam em maior concentração. Além disto, não houve perda de informação relativa aos compostos mais leves (tempos de retenção pequenos) durante a análise por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas, porque não houve necessidade do tempo de espera de 3 minutos para descartar o solvente (ao se obter um cromatograma com detector de espectrometria de massas há a necessidade de um tempo de espera em torno de 3 minutos para que o solvente, que normalmente elui antes deste tempo, não danifique a fonte de íons).

Para a análise de 6 amostras de mel floral e 6 amostras de mel de melato, classificadas de acordo com KIRKWOOD e WHITE [6] foi utilizado o método de extração por arraste com gás hidrogênio.

Comparando-se os tempos de retenção dos compostos extraídos das 6 amostras de mel de melato e das 6 amostras de mel floral (Tabela 1) foi observado que, 4 amostras de mel de melato apresentaram picos na região entre 11 e 12 minutos. Em relação ao mel floral, somente duas apresentaram pico nesta região. Observando os espectros de massas, verificou-se a presença constante nesta região, de um composto com peso molecular 60, com maior abundância nas amostras de mel de melato (Figura 1). O mesmo só apareceu em uma amostra floral (amostra 14) e com abundância menor.

Comparando-se os espectros de massas de vários compostos de peso molecular 60, com o espectro da amostra de mel de melato (Figura 1), podemos concluir que o composto em questão é o ácido acético, cujo espectro de referência se encontra na Figura 2.

A pesquisa de substâncias voláteis em méis uniflorais como de Banksia sp., Eucalyptus sp., Bursaria sp., Trifolium sp. [9], Castanea sp. [5], Leptospermum sp. [15], Calluna sp., Robinia sp. e mel multifloral de Trifolium sp [11], Thymus sp., Salix sp. [12], não determinou a presença de ácido acético. Em 84 amostras de méis uniflorais, dentre estes Lavandula sp., Rosmarinus sp. e Citrus sp., Bouseta et al. [2] determinaram a presença de dois compostos com peso molecular 60. Os mesmos foram identificados através de cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas como metilformato e propanol. De acordo com Shimoda et al. [14] o ácido acético foi detectado no mel de Rhus succedanea.

A presença do ácido acético parece ser um indicativo da presença de melato, no entanto seria necessário analisar um número maior de amostras para se verificar a freqüência com que este composto está presente no mel de melato e ausente no mel floral. Isto possibilitaria um estudo estatístico mais completo e conclusivo.

Nas 12 amostras de mel analisadas (floral e mel de melato), foram encontrados compostos voláteis com razão m/z que sugerem a presença de compostos relatados na literatura (Tabela 2).

4 – CONCLUSÕES

O método de determinação de voláteis por arraste de gás hidrogênio e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas mostrou-se rápido e eficiente.

A determinação de voláteis no mel mostrou que o ácido acético é um indicativo da presença de melato. Contudo, sugere-se um estudo mais aprofundado, com uma amostragem maior para verificar se este é um composto característico do mel de melato.

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 – AGRADECIMENTOS

À FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais) pelo suporte financeiro.

À Vany e Rosângela do Departamento de Química – ICEX.

² Fundação Ezequiel Dias, Divisão de Bromatologia e Toxicologia, Serviço de Química Bromatológica, Rua Conde Pereira Carneiro 80, Gameleira CEP 30.510-010 – Belo Horizonte-MG. [e-mail]

³ Farmacêutico-Industrial, bolsista FAPEMIG – Fundação Ezequiel Dias.

⁴ Departamento de Química ICEX Universidade Federal de Minas Gerais, BH-MG.

* A quem a correspondência deve ser enviada.

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• [3] BOUSETA, A. & COLLINS, S. Optimized Likens-Nickerson Methodology for Quantifying Honey Flavors. J. Agric. Food Chem, v. 43, p. 1890-1897, 1995.
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¹ Recebido para publicação em 19/01/99. Aceito para publicação em 10/01/00.

Recebido para publicação em 19/01/99. Aceito para publicação em 10/01/00.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Jan 2001
• Data do Fascículo
  Abr 2000

Histórico

• Aceito
  10 Jan 2000
• Recebido
  19 Jan 1999