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Teores de tiamina, riboflavina e piridoxina em leites bovinos comercializados na cidade de São Paulo

Thiamin, riboflavin and pyridoxin amounts in cow milk comercialized in the city of Sao Paulo

Resumos

A cromatografia líquida de alta eficiência foi empregada para determinar os teores de tiamina, riboflavina e piridoxina em leites em pó, pasteurizados e esterilizados. As vitaminas foram extraídas com ácido tricloroacético 5% (p/v), permanecendo sob vibração ultrassônica por 1 hora. Foram analisadas simultaneamente, empregando-se coluna C18, fase móvel constituída por água:acetonitrila:NH4OH, contendo 0,95g de ácido hexanossulfônico/L. O pH final da solução foi ajustado para 3,6 com fluxo foi de 1,5mL/min. A tiamina e a riboflavina foram detectadas na região do UV e a piridoxina por fluorescência. Os baixos teores de tiamina dificultaram sua quantificação, principalmente nos leites pasteurizados. O uso do detector de fluorescência contribuiu para a quantificação da piridoxina na maior parte dos leites analisados. A riboflavina, por sua vez, presente com teores mais abundantes, pode ser analisada em todas as amostras. A tiamina esteve com teores bem acima dos declarados em algumas marcas de leite em pó, estando a riboflavina com teores abaixo do informado em uma delas. Em algumas marcas de leite em pó e esterilizados, a piridoxina foi encontrada com teores bem abaixo do informado.

leite; tiamina; riboflavina; piridoxina; cromatografia líquida


High performance liquid cromatography was employed to analyze the amount of thiamin, riboflavin and piridoxin in dried, pasteurized and sterilized milks. The vitamins were extracted with tricloroacetic acid 5%, remaining under ultrassonic vibration for one hour. They were analysed simultaneously, through C18 column, mobile phase composed by water:acetonitrile:NH4OH, containing 0.95g of hexanossulfonic acid. The final pH was ajusted to 3.6, 1.5 mL flow. The thiamin and riboflavin were analysed by UV a detector and the pyridoxin by a fluorescence detector. The low values of thiamin made its quantitation difficult, mainly in pasteurized milk. The detector of fluorescence contributed to the detection of pyridoxin in most of the analysed milks. The riboflavin, in its turn, found in higher values, could be analysed in all samples. The thiamin was found in higher values than the values declared in the labels of some brands of dried milk and the riboflavin was found with values below the declared values in one brand. In some brands of dried and sterilized milk, pyridoxin was found with values below the declared values.

milk; thiamin; riboflavin; pyridoxin; liquid chromatography


TEORES DE TIAMINA, RIBOFLAVINA E PIRIDOXINA EM LEITES BOVINOS COMERCIALIZADOS NA CIDADE DE SÃO PAULO11 Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00 Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00

Rute BIANCHINI21 Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00 Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00 ,*1 Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00 Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00 ; Marilene De Vuono Carmargo PENTEADO21 Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00 Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00

RESUMO

A cromatografia líquida de alta eficiência foi empregada para determinar os teores de tiamina, riboflavina e piridoxina em leites em pó, pasteurizados e esterilizados. As vitaminas foram extraídas com ácido tricloroacético 5% (p/v), permanecendo sob vibração ultrassônica por 1 hora. Foram analisadas simultaneamente, empregando-se coluna C18, fase móvel constituída por água:acetonitrila:NH4OH, contendo 0,95g de ácido hexanossulfônico/L. O pH final da solução foi ajustado para 3,6 com fluxo foi de 1,5mL/min. A tiamina e a riboflavina foram detectadas na região do UV e a piridoxina por fluorescência. Os baixos teores de tiamina dificultaram sua quantificação, principalmente nos leites pasteurizados. O uso do detector de fluorescência contribuiu para a quantificação da piridoxina na maior parte dos leites analisados. A riboflavina, por sua vez, presente com teores mais abundantes, pode ser analisada em todas as amostras. A tiamina esteve com teores bem acima dos declarados em algumas marcas de leite em pó, estando a riboflavina com teores abaixo do informado em uma delas. Em algumas marcas de leite em pó e esterilizados, a piridoxina foi encontrada com teores bem abaixo do informado.

Palavras-chave: leite, tiamina, riboflavina, piridoxina, cromatografia líquida

SUMMARY

THIAMIN, RIBOFLAVIN AND PYRIDOXIN AMOUNTS IN COW MILK COMERCIALIZED IN THE CITY OF SAO PAULO. High performance liquid cromatography was employed to analyze the amount of thiamin, riboflavin and piridoxin in dried, pasteurized and sterilized milks. The vitamins were extracted with tricloroacetic acid 5%, remaining under ultrassonic vibration for one hour. They were analysed simultaneously, through C18 column, mobile phase composed by water:acetonitrile:NH4OH, containing 0.95g of hexanossulfonic acid. The final pH was ajusted to 3.6, 1.5 mL flow. The thiamin and riboflavin were analysed by UV a detector and the pyridoxin by a fluorescence detector. The low values of thiamin made its quantitation difficult, mainly in pasteurized milk. The detector of fluorescence contributed to the detection of pyridoxin in most of the analysed milks. The riboflavin, in its turn, found in higher values, could be analysed in all samples. The thiamin was found in higher values than the values declared in the labels of some brands of dried milk and the riboflavin was found with values below the declared values in one brand. In some brands of dried and sterilized milk, pyridoxin was found with values below the declared values.

Keywords: milk, thiamin, riboflavin, pyridoxin, liquid chromatography

1 – INTRODUÇÃO

O leite é um alimento de alto valor nutritivo, estando nos últimos anos cada vez mais presente na dieta do brasileiro, juntamente com alguns derivados como queijos e iogurtes [11, 12].

O leite apresenta uma composição vitamínica importante, contendo tanto vitaminas lipossolúveis quanto hidrossolúveis [2, 15]. Não são poucos os autores que já verificaram os teores destes nutrientes no leite [3, 5, 19], bem como analisaram possíveis mudanças ocorridas em função da época do ano [16], alimentação do animal [20], tratamento térmico [17] e estocagem [4].

Uma técnica vastamente empregada na análise de vitaminas é a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Uma das vantagens desta técnica é a determinação simultânea de várias vitaminas, dentre elas, as do complexo B [8, 18]

Neste trabalho, esta técnica foi empregada para determinar simultaneamente a tiamina, a riboflavina e a piridoxina em leites bovinos em pó, pasteurizados e esterilizados.

2 - MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 – Amostra

Para as análises foram utilizados leites pasteurizados (9 marcas), esterilizados (10 marcas) e em pó(10 marcas), comercializados na cidade de São Paulo, adquiridos no período de novembro de 1997 a maio de 1998. Foram analisados dois diferentes lotes de cada marca, em triplicata.

2.2 – Metodologia

2.2.1 - Extração

Para extração destas vitaminas foram testados o ácido sulfúrico 0,1N e 1N e o ácido tricloroacético (TCA) 5% (p/v). A aplicação do ácido sulfúrico 0,1N foi baseada nas condições descritas no trabalho de AGOSTINI [1].

Na análise dos leites pasteurizados e esterilizados, tomou-se a precaução de não se diluir muito o leite, em função da detecção das vitaminas. Assim, foram tomadas alíquotas de 9mL de leite fluido sendo adicionado 1mL de ácido tricloroacético 50% (p/v), proporcionando concentração final do ácido de 5%. Para se testar o ácido sulfúrico nas concentrações de 0,1N e 1N, foi tomada alíquota de 10mL de leite e foram adicionados 2mL de ácido sulfúrico 0,6N e 6N, respectivamente.

Para análise do leite em pó, foram pesados cerca de 20g do produto, sendo diluídos em água isenta de impurezas e microrganismos até completar o volume de 100mL em balão volumétrico. A seguir, procedeu-se como descrito para as amostras fluidas.

Após a adição do ácido as amostras permaneceram em banho ultra-sônico durante 60 minutos, conforme AGOSTINI [1]. As amostras foram então filtradas em papel de filtro comum e logo a seguir em membrana de 0,45mm, sendo injetadas no cromatógrafo através de injetor automático. O volume de injeção foi de 35mL.

2.2.2 - Condições cromatográficas

As vitaminas foram determinadas simultaneamente, estando os detectores UV/visível e de fluorescência ligados em série. A tiamina e a riboflavina foram analisadas no primeiro e a piridoxina no segundo.

A etapa cromatográfica ocorreu em coluna de fase reversa C18, 5mm, 25cmx4,6mm, 201-TP-54, Vydac. O sistema de eluição foi isocrático e a fase móvel empregada foi semelhante à descrita no trabalho de CHASE Jr. et al [9]. Os autores prepararam a seguinte solução: 0,95g de ácido hexanossulfônico foi dissolvido em 1 litro de água ultra-pura contendo 95mL de acetonitrila e 0,5mL de NH4OH. O pH final foi ajustado para 3,6 com ácido fosfórico. Desta solução, 950mL foram diluídos para 1 litro com água ultra-pura. No presente trabalho, foram testadas três concentrações de acetonitrila na fase móvel, 85, 90 e 100mL/L, além da mencionada pelos autores. Para a detecção das vitaminas foram empregados l = 245nm para a tiamina e l = 275nm para a riboflavina. Ambos conferidos através do detector de arranjo de diodos. Para a piridoxina, l de extinção= 295nm e l de emissão= 395nm, conforme CHASE Jr. et al [9].

A fase móvel foi desgaseificada com gás hélio durante 10 minutos.

2.2.3 - Identificação

A identificação foi feita pela comparação dos tempos de retenção dos padrões com os das amostras. Para a tiamina e riboflavina, foi verificada a similaridade entre os espectros de absorção das amostras e o dos respectivos padrões, conferida através do detector de arranjo de diodos. Quanto à piridoxina, foi adicionada solução padrão à amostra imediatamente antes da análise cromatográfica, após uma primeira corrida da amostra sem o padrão.

2.2.4 - Quantificação

A quantificação foi feita através de curva de padronização externa para cada composto.

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

A sobreposição dos perfis espectrais dos padrões de tiamina e riboflavina com os dos picos com os mesmos tempos de retenção na amostra, indicaram boas correlações: 0,9469 para a tiamina e 0,9991 para a riboflavina. Quanto à piridoxina, foi constatado aumento do pico correspondente quando da adição do padrão à amostra antes da injeção.

Quanto à fase móvel, observou-se inicialmente que o uso da concentração de acetonitrila ditada pelos autores, 95mL/L, não proporcionava uma completa separação destas vitaminas. Desta forma, sendo a acetonitrila um modificador orgânico, tentou-se verificar quais mudanças ocorreriam na separação destes compostos, a partir da alteração da sua concentração na fase móvel. A concentração de 85mL/L foi a que proporcionou uma melhora na resolução destas vitaminas, enquanto que as de 90 e 100mL/L provocaram uma menor separação. A mudança nos teores de acetonitrila não interferiram no tempo de retenção da piridoxina.

Os cromatogramas referentes à análise de tiamina, riboflavina e piridoxina no leite estão na Figura 1.


A vitamina B6 pode estar presente nos alimentos, inclusive no leite [3, 6, 13] como uma mistura de vitâmeros, a saber, a piridoxina ou piridoxol, o piridoxal e a piridoxamina. Cada uma possui a sua forma esterificada, somando um total de seis vitâmeros [7, 10, 14].

Em alguns leites analisados, predominantemente no leite em pó, verificou-se a presença de outro composto que eluiu juntamente com a piridoxina. Observando-se a Figura 2 pode-se constatar que há uma mistura. Embora a piridoxina seja o vitâmero predominante em leite,sabe-se da possibilidade deste se converter a piridoxamina após tratamento térmico [7]. Aqui levanta-se a hipótese então, de que as altas temperaturas empregadas para obtenção do leite em pó podem ter ocasionado tal conversão. Assim, é provável que se tenha uma mistura de vitâmeros nestes leites.


Quanto às condições de extração, verificou-se, primeiramente o emprego do ácido sulfúrico 0,1N. Entretanto, para as amostras aqui analisadas, esta concentração do ácido não foi suficiente para provocar precipitação das proteínas do leite. Avaliou-se então, o efeito do aumento da concentração para 1N. A despeito deste aumento, o filtrado apresentou leve turbidez. Sendo o TCA um ácido amplamente utilizado na precipitação de proteínas, buscou-se verificar sua eficiência na extração destas vitaminas em leite numa concentração de5% (p/v). Ao contrário dos demais, o TCA proporcionou um extrato límpido após a filtração.

Os resultados obtidos com o ácido sulfúrico 0,1N e TCA 5% estão apresentados na Tabela 1.

Na extração da riboflavina, pode-se verificar que os dois ácidos apresentaram praticamente a mesma eficiência. São interessantes, entretanto, as diferenças obtidas para a tiamina e piridoxina. O TCA foi muito mais efetivo na extração destas vitaminas, principalmente no caso da tiamina. Desta forma, o TCA foi escolhido para a extração das vitaminas em questão.

Os testes de recuperação das vitaminas foram realizados com leites pasteurizado e em pó são apresentados na Tabela 2.

Os teores das vitaminas hidrossolúveis estão nas Tabelas 3, 4 e 5 para leites em pó, pasteurizados e esterilizados, respectivamente.

Nos leites em pó encontrou-se maior ocorrência da provável mistura de vitâmeros de vitamina B6, ao contrário do que se verificou nos leites esterilizados, onde tal fato foi constatado em duas marcas (LI e ID), e nos pasteurizados, apenas em uma (FA). Assim, nestes leites a piridoxina não foi quantificada. É difícil afirmar a razão do ocorrido, mas como já foi mencionado anteriormente, o tratamento térmico pode proporcionar o surgimento da piridoxamina a partir da piridoxina.

A quantificação da tiamina não foi possível em algumas marcas de leite em pó e esterilizado e em qualquer marca de leite pasteurizado, pois esteve presente abaixo do limite de detecção do método (0,13mg/mL).

Embora a piridoxina seja normalmente encontrada com teores menores que a tiamina em leites, neste trabalho a quantificação daquela foi possível num número maior de amostras que a tiamina, com certeza por causa da alta sensibilidade do detector de fluorescência. Quanto à riboflavina, embora seja naturalmente fluorescente, os teores presentes eram suficientes para sua quantificação em UV.

Nos leites em pó analisados por INDYK et al [16], os teores variaram de 0,15 a 0,27mg/100g para a B1, de 1,5 a 2,3mg/100g para a B2, e de 0,13 a 0,23mg/100g para a B6. Os autores comentam em sua discussão, que a literatura não contém dados consistentes com relação às variações nos teores destas vitaminas em diferentes estações do ano. Uns afirmam que há aumento, outros que há diminuição e outros ainda que não há nenhuma mudança nos teores em função da época do ano.

No presente trabalho, teores de tiamina bem maiores que o informado no rótulo foram encontrados nas marcas NI, NC, NN e NS, sendo que nesta última chegou a ser 3,7 vezes maior.

Sendo os teores de piridoxina encontrados nas marcas de leite em pó NC, NN e NS bem maiores que nas demais marcas, sugere-se estas tenham recebido adição desta vitamina, embora a embalagem não apresente tal informação. No entanto, como são produtos destinados ao público infantil, esta possibilidade é ressaltada.

Para a riboflavina, o leite em pó da marca GR foi o único que apresentou teores abaixo do declarado, cerca de metade.

AGOSTINI [1], que determinou simultaneamente cinco vitaminas hidrossolúveis em leites e derivados, encontrou o teor de 0,4mg/100g para a piridoxina, em leite em pó integral enriquecido com esta vitamina. Os teores de riboflavina determinados pela autora foram compatíveis com os aqui determinados, variando de 1,24 a 1,44mg/100g.

Nos leites pasteurizados, os menores teores de riboflavina foram encontrados nas duas marcas de tipo A, principalmente na FA. Os maiores teores desta vitamina nestes leites foram determinados no tipo C da marca LT.

Para a piridoxina, os menores teores foram verificados nas duas marcas de leite tipo A. Os maiores teores foram do leite tipo B marca LB.

SIEBER et al [21], detectaram tiamina em leite pasteurizado com 0,02mg/100mL. Os teores de riboflavina, 0,16mg/100mL, estiveram dentro do intervalo aqui determinado. Quanto à vitamina B6, os autores quantificaram a piridoxamina e o piridoxal, com teores de 0,005 e 0,021mg/100mL, respectivamente, não mencionando a piridoxina.

Nos leites esterilizados aqui estudados, foi grande a variação encontrada nos teores de tiamina entre as diferentes marcas. A marca BN, embora não houvesse indicação de enriquecimento no rótulo, mostrou teores bem maiores que as demais. A diferença em relação à menor concentração (PT), chegou a 75 vezes. A marca ID foi adicionada de tiamina, estando com menos que o indicado no rótulo em um dos lotes.

A riboflavina apresentou variação muito menor entre as marcas, com diferença de 2,3 vezes entre o maior (PD) e o menor teor (EI). Na amostra enriquecida (ID), um dos lotes apresentou teor quase 50% maior que o informado na embalagem.

Das marcas que foram enriquecidas com B6, umas delas (PV), esteve com quase metade do indicado pelo fabricante em ambos os lotes e a outra (BN), apresentou teores de acordo.

Também com grande variação entre as amostras não enriquecidas, o maior teor de piridoxina (PV), foi cerca de 14,4 vezes o menor (LI).

No trabalho de AL-ZAWAWI e CALDEWLL [4] os teores de riboflavina em leites esterilizados foram de 0,16mg/100g. Sendo a densidade do leite um pouco maior que 1,0g/mL, pode-se dizer que este valor está de acordo com os determinados nas marcas aqui analisadas que apresentaram as maiores concentrações.

4 – CONCLUSÕES

Embora seja comum o emprego do ácido sulfúrico na extração das vitaminas do complexo B, o ácido tricloroacético 5% foi muito mais eficiente para tiamina e piridoxina.

Os teores relativamente baixos de tiamina em leites dificultou a sua quantificação nas maioria das amostras, o que indica que há necessidade de se realizar a transformação para tiocromo, com posterior detecção em fluorescência.

A riboflavina, estando presente com teores bem mais altos, pode ser quantificada por ultra-violeta.

A piridoxina, presente com teores baixos, pode ser quantificada graças à sensibilidade do detector de fluorescência.

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGRADECIMENTOS

À Dra. Maria Aparecida Lopes da Costa, pela contribuição na finalização do trabalho.

Às técnicas Inês Maria Henrique e Magda Rios, pelo apoio na parte experimental.

Ao CNPq, pela bolsa de estudos concedida à primeira autora.

2 Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.Av.Prof.Lineu Prestes, 580, Conjunto das Químicas-Bloco 14. CEP-05508-900-São Paulo-SP.

* A quem acorrespondência deve ser enviada.

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  • 1 Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00
    Recebido para publicação em 01/12/98.Aceito para publicação em08/02/00
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      10 Maio 2001
    • Data do Fascículo
      Dez 2000

    Histórico

    • Aceito
      08 Fev 2000
    • Recebido
      01 Dez 1998
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