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Estudo da atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do óleo da casca da castanha de caju (CNSL) dos clones de cajueiro-anão-precoce CCP-76 e CCP-09 em cinco estágios de maturação sobre microrganismos da cavidade bucal

Study of the antibacterial activity of anacardic acids from the cashew Anacardium occidentale nut shell oil of the clone of cashew-midget-precocious CCP-76 and and CCP-09 in five stages of maturation on oral microorganisms

Resumos

A atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do óleo da casca da castanha de caju (CNSL) Anacardium occidentale (Anacardiaceae) foi estudada sobre os microrganismos da cavidade bucal Streptococcus mutans ATCC 25175, Staphylococcus aureus ATCC 12598, Candida albicans ATCC 10231 e Candida utilis. Os ácidos anacárdicos obtidos dos extratos etílicos do CNSL apresentaram atividade antibacteriana contra os microganismos citados, porém a maior atividade inibitória ocorreu sobre a bactéria Gram positiva Streptococcus mutans, considerada predominante na cárie dentária. As cáries dentárias são uma das mais freqüentes doenças infecciosas nos países em desenvolvimento. Os elementos que influenciam na cárie dentária incluem o estado nutricional, a ingestão de açúcar e a presença da microbiota cariogênica.

Ácidos anacárdicos; óleo da casca da castanha de caju; atividade antibacteriana


The antimicrobial activity of the anacardic acids of the cashew nut shell oil Anacardium occidentale (Anacardiaceae) was studied on the oral microorganisms Streptococcus mutans ATCC 25175, Staphylococcus aureus ATCC 12598, Candida albicans ATCC 10231 and Candida utilis. The anacardic acids obtained from the ethyl extract of the cashew nut shell oil presented activity antibacterial against the mentioned microorganisms, but the most inhibitory activity occurred with the Gram positive bacteria Streptococcus mutans, which is known to be one of the main cause of tooth decay. The tooth decay is one of the most frequent infectious diseases in the countries in development. The elements that influence in the tooth decay include the nutritional state, the ingestion of sugar and the presence of the microflora cariogênica.

Anacardic acids; cashew nut shell oil; Anacardium occidentale; activity antimicrobial


ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS ÁCIDOS ANACÁRDICOS DO ÓLEO DA CASCA DA CASTANHA DE CAJU (CNSL) DOS CLONES DE CAJUEIRO-ANÃO-PRECOCE CCP-76 E CCP-09 EM CINCO ESTÁGIOS DE MATURAÇÃO SOBRE MICRORGANISMOS DA CAVIDADE BUCAL1 1 Recebido para publicação em 18/10/2000. Aceito para publicação em 07/02/2001

Carlos Alberto de A. LIMA2 1 Recebido para publicação em 18/10/2000. Aceito para publicação em 07/02/2001 , Gláucia Maria PASTORE3 1 Recebido para publicação em 18/10/2000. Aceito para publicação em 07/02/2001 , Eliza Dorotea Pozzobon de A. LIMA2 1 Recebido para publicação em 18/10/2000. Aceito para publicação em 07/02/2001 , * 1 Recebido para publicação em 18/10/2000. Aceito para publicação em 07/02/2001

RESUMO

A atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do óleo da casca da castanha de caju (CNSL) Anacardium occidentale (Anacardiaceae) foi estudada sobre os microrganismos da cavidade bucal Streptococcus mutans ATCC 25175, Staphylococcus aureus ATCC 12598, Candida albicans ATCC 10231 e Candida utilis. Os ácidos anacárdicos obtidos dos extratos etílicos do CNSL apresentaram atividade antibacteriana contra os microganismos citados, porém a maior atividade inibitória ocorreu sobre a bactéria Gram positiva Streptococcus mutans, considerada predominante na cárie dentária. As cáries dentárias são uma das mais freqüentes doenças infecciosas nos países em desenvolvimento. Os elementos que influenciam na cárie dentária incluem o estado nutricional, a ingestão de açúcar e a presença da microbiota cariogênica.

Palavras-chave: Ácidos anacárdicos; óleo da casca da castanha de caju; atividade antibacteriana

SUMMARY

STUDY OF THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ANACARDIC ACIDS FROM THE CASHEW Anacardium occidentale NUT SHELL OIL OF THE CLONE OF CASHEW-MIDGET-PRECOCIOUS CCP-76 AND AND CCP-09 IN FIVE STAGES OF MATURATION ON ORAL MICROORGANISMS1 1 Recebido para publicação em 18/10/2000. Aceito para publicação em 07/02/2001 . The antimicrobial activity of the anacardic acids of the cashew nut shell oil Anacardium occidentale (Anacardiaceae) was studied on the oral microorganisms Streptococcus mutans ATCC 25175, Staphylococcus aureus ATCC 12598, Candida albicans ATCC 10231 and Candida utilis. The anacardic acids obtained from the ethyl extract of the cashew nut shell oil presented activity antibacterial against the mentioned microorganisms, but the most inhibitory activity occurred with the Gram positive bacteria Streptococcus mutans, which is known to be one of the main cause of tooth decay. The tooth decay is one of the most frequent infectious diseases in the countries in development. The elements that influence in the tooth decay include the nutritional state, the ingestion of sugar and the presence of the microflora cariogênica.

Keywords: Anacardic acids, cashew nut shell oil, Anacardium occidentale, activity antimicrobial

1 – INTRODUÇÃO

Pesquisas em desenvolvimento por agentes antimicrobianos presentes em frutas e hortaliças tropicais têm mostrado a obtenção de compostos fenólicos antibacterianos formados de uma cadeia lateral alquil não isoprenóide tais como ácidos anacárdicos, cardois, metilcardois e cardanois obtidos do óleo da casca da castanha de caju Anacardium occidentale L. (Anacardiaceae) MUROI et al [9].

KUBO et al [7] compararam os ácidos anacárdicos 6-[8(Z),11(Z),14-pentadecatrienil]ácido salicílico, 6-[8(Z),11(Z),-pentadecadienil]ácido salicílico, 6-[8(Z)-pentadecenil]ácido salicílico e 6-n-pentadecil ácido salicílico com o ácido salicílico, verificaram que a adição de uma cadeia lateral não isoprenóide com 15 átomos de carbono proporcionou uma dramática mudança na atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos. Assim, o ácido salicílico o qual não possui uma cadeia lateral alquil exibiu fraca, porém ampla atividade antimicrobiana. Sendo assim, a atividade antimicrobiana do ácido salicílico não é potente para ser utilizada exclusivamente para controlar microrganismos específicos (tais como aqueles que causam cárie dentária ou acne), porém, é ampla para ser empregada na conservação dos cosméticos. Ao contrário, os ácidos anacárdicos exibiram geralmente um espectro de atividade principalmente, contra bactérias Gram positivas, de maneira que esta atividade foi dramaticamente superior quando comparada com o ácido salicílico. Por exemplo, a atividade do ácido anacárdico 6-[8(Z),11(Z),14-pentadecatrienil]ácido salicílico contra Streptococcus mutans e Staphylococcus aureus foi 2048 e 64 vezes, respectivamente, mais efetiva do que o ácido salicílico. Portanto, parece que a cadeia lateral alquil desempenha um papel importante em aumentar a atividade antimicrobiana.

O conhecimento de que muitos microrganismos podem ocasionar contaminação em alimentos e cosméticos, pesquisas estão sendo desenvolvidas a procura de novos agentes antimicrobianos. Estudos realizados sobre vários microrganismos incluindo

Streptococcus mutans o qual é reconhecido como uma das principais bactérias responsáveis pela cárie dentária, demonstraram que o aumento no número de duplas ligações na cadeia dos ácidos anacárdicos aumenta a atividade antibacteriana contra bacteria Gram positiva, particularmente

Streptococcus mutans HIMEJIMA & KUBO [4].

O objetivo do presente trabalho foi estudar a utilização dos ácidos anacárdicos obtidos do CNSL sobre microrganismos orais.

2 - MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 - Amostras

As amostras de castanha de cajueiro-anão-precoce foram obtidas da EMBRAPA/CNPAT, Fortaleza-Ceará. Os clones de cajueiro-anão-precoce de Pacajus (CCP) selecionados foram (CCP-76 e CCP-09). Foram coletadas amostras de castanha de caju inteiras em cinco estágios de maturação, da mesma planta, de acordo com o número de dias após a fecundação da flor [1]. O primeiro estágio foi coletado com doze dias e os estágios seguintes foram coletados com intervalos de doze dias até o sexagésimo dia, quando o fruto, a castanha, completa o amadurecimento (E1=12; E2=24; E3=36; E4=48 e E5=60).

Para cada amostra, constituída de cascas da castanha de caju, sem semente, e pedúnculo, escolhidas aleatoriamente, foram pesados em balança semi-analítica, 100g de casca dos clones de cajueiro-anão-precoce CCP-1001, CCP-76, CCP-09, CCP-06 e cajueiro comum. Em seguida, foram transferidas para Erlenmeyers de 500ml e exaustivamente extraídas com éter etílico (Merck) (4 x 5 horas), com intervalos de 5 horas, pelo método de SHOBHA et al [11] com modificações, no número e tempo de extrações, e adição de sulfato de sódio anidro para retirada de água residual. Após extração foi realizada a filtração do extrato lipídico em papel de filtro. Posteriormente, as amostras de óleo da casca da castanha de caju, foram concentradas em roto-evaporador à temperatura de 23-24ºC.

2.2 - Microrganismos.

Os microrganismos selecionados para a análise da atividade antimicrobiana foram Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Candida albicans e Candida utilis adquiridos da coleção da Fundação Tropical de Pesquisas e Tecnologia "André Tosello", e os seus meios foram descritos por HIMEJIMA et al [5]; KUBO & HIMEJIMA [7] e HIMEJIMA & KUBO [4].

2.3 - Análise da atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do CNSL .

Foi selecionado o extrato etílico do CCP-09 no quinto estágio de maturação para análise da atividade antimicrobiana através do teste espectrofotométrico e teste de antibiograma, tendo em vista este clone ter apresentado a maior concentração dos ácidos anacárdicos.

2.3.1 - Análise da atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do CNSL pelo método espectrofotométrico.

A análise da atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do CNSL foi realizada com bactéria e levedura pela técnica da diluição em caldo de acordo com TANIGUCHI & SATOMURA [13] e PELCZAR et al [10]. O crescimento de cada cultura foi monitorado através de dois métodos, medição da densidade ótica em 660nm e contagem de células/ml. As bactérias Streptococcus mutans e Staphylococcus aureus foram inoculadas em 9 tubos de ensaio contendo meio BHI (brain-heart-infusion). Com auxílio de uma alça de níquel cromo foi retirado uma alçada dos microrganismos e transferido para 3,0ml de água destilada e esterilizada. Em seguida, transferiu-se 30µl desta suspensão de células para os tubos com o meio de cultura esterilizado. Após inoculação foi adicionado o composto teste (ácidos anacárdicos), inicialmente, este composto foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (DMF), a concentração de DMF no meio foi 1%, a qual não afeta o crescimento dos microrganismos, de acordo com KUBO et al [7], e 30 µl da solução dos ácidos anacárdicos em suas respectivas concentrações foram adicionadas ao meio. Os tubos foram incubados por 24 horas a 37 °C. Decorrido o período de incubação foi realizada a leitura da turbidez (densidade ótica 660nm) segundo MUROI et al [9] e contagem do número de células/ml.

Para leveduras foi utilizado extrato de malte a 2,5%, a temperatura de incubação foi 30 °C. Os tubos foram incubados por 24 horas e a concentração mínima para inibir o crescimento das leveduras foi realizada através da leitura no espectrofotometro (densidade ótica 660nm) de acordo com KUBO et al [8], os outros passos foram realizados de acordo como descrito no ítem anterior.

2.3.2 - Análise da atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos utilizando discos de papel de filtro.

A análise da atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do CNSL em bactérias Gram positiva Streptococcus mutans foram realizadas de acordo com o método descrito por KIM et al [6]; SIVROPOULOU et al [12] e PELCZAR et al. [10]. Amostras de 30µl de culturas ativas do Streptococcus mutans foram inoculadas por espalhamento com auxílio da alça de Drigauski estéreis em placas de Petri contendo "brain heart agar". Os discos de papel de filtro impregnados com os ácidos anacárdicos foram transferidos para as placas de Petri inoculadas com os microrganismos. A atividade inibitória do crescimento a 37 °C, após 24 horas de incubação, foi determinada pela medição da zona de inibição (halo inibitório) após subtração do disco de papel de filtro.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 - Atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do extrato etílico do CNSL do clone CCP- 09 no quinto estágio de maturação, utilizando o teste espectrofotométrico

Os resultados da análise da atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do extrato etílico da amostra do clone CCP-09 no quinto estágio de maturação através do teste espectrofotométrico sobre Streptococcus mutans estão apresentados nas Figuras 1 , 2 e 7 . A amostra de ácidos anacárdicos selecionada demonstrou ter atividade antimicrobiana sobre o Streptococcus mutans através da diminuição da turbidez do meio com o aumento da concentração dos ácidos anacárdicos (Figuras 1 e 2), demonstrando, que houve uma inibição do crescimento microbiano, e portanto, uma diminuição no número de células/ml (Figura 7 ).







Segundo dados da literatura obtidos por MUROI & KUBO [9] os ácidos anacárdicos apresentam potente atividade antibacteriana sobre bactérias Gram positiva, principalmente Streptococcus mutans, maior do que em bactérias Gram negativas, de acordo com HIMEJIMA & KUBO [4]. Embora apenas uma linhagem de Streptococcus mutans tenha sido testada, é esperado que compostos ativos retenham atividade contra uma variedade de linhagens das espécies. Por outro lado, a possibilidade de resistência entre linhagens está sempre presente [9].

FARAG et al [2] relataram que parece existir um relacionamento entre as estruturas químicas dos compostos presentes no óleo e a atividade antimicrobiana. Geralmente, a extensão do efeito inibitório dos óleos poderia ser atribuída à presença de núcleos aromáticos contendo grupos funcionais polares. A larga aplicação dos compostos fenóis e clorofenóis como desinfetantes é muito conhecido. Pesquisas realizadas têm demonstrado que o grupo OH - (hidroxila) é muito reativo e facilmente forma pontes de hidrogênio com o sítio ativo das enzimas. Inibindo as atividades metabólicas dos microrganismo.

A Figura 3 demonstra a atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do CNSL no quinto estágio de maturação sobre a bactéria Staphylococcus aureus Gram positiva. Os ácidos anacárdicos apresentam uma menor atividade inibitória no crescimento sobre esta bactéria quando comparada com o Streptococcus mutans, verificando-se uma maior turbidez do meio líqüido quando comparado com as Figuras 1 e 2, portanto maior número de células/ml, como ilustra a Figura 7 . Estes resultados estão de acordo com os dados apresentados por HIMEJIMA & KUBO [4].

Os resultados da análise da atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos da amostra de óleo da casca da castanha de caju do clone de cajueiro-anão-precoce CCP-09 no quinto estágio de maturação sobre as leveduras Candida albicans, Candida utilis, estão apresentados, respectivamente, nas Figuras 4 e 5. A susceptibilidade dos microrganismos aos ácidos anacárdicos foi determinada pelo método da diluição em tubos. O tubo da extrema esquerda é o controle e não contém ácidos anacárdicos. Após a incubação os resultados apresentados conforme observação das fotografias demonstram que o meio de cultura ficou turvo, portanto, observou-se que ocorreu fraca inibição no crescimento das leveduras conforme contagem do número de células/ml Figura 7 .

GELLERMAN et al [3] relataram que os ácidos anacárdicos podem apresentar uma maior ou menor dificuldade em penetrar na membrana das células dos diferentes microrganismos, esta diferença talvez seja responsável pelo maior efeito inibitório sobre as bactérias Gram positivas Streptococcus mutans e Staphylococcus aureus quando comparados com as leveduras Candida albicans e Candida utilis.

3.2 - Atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do óleo da casca da castanha de caju do clone CCP- 09 no quinto estágio de maturação, utilizando o teste de antibiograma

A Figura 6 apresenta os resultados da análise da atividade antimicrobiana dos ácidos anacárdicos do CNSL do clone de cajueiro-anão-precoce CCP-09 quinto estágio de maturação sobre a bactéria Gram-positiva Streptococcus mutans utilizando o teste de antibiograma. A amostra de ácidos anacárdicos demonstra atividade antibacteriana pela formação de zona de inibição 3,5 mm para Streptococcus mutans.

4 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Parte trabalho de Dissertação de Tese de Doutorado em Ciência de Alimentos-UNICAMP

2 Laboratório de Tecnologia de Alimentos-DSER-CCA-UFPB. E-mail:epozzob@zaz.com.br

3 Laboratório de Bioquímica-Dept°. de Ciência de Alimentos-FEA-UNICAMP-Caixa Postal-6121 CEP 13081-970 - Barão Geraldo-Campinas-SP-Brasil.

*

A quem a correspondência deve ser enviada.

  • [1] ALMEIDA-DE, J. I. L.; BARROS, L. M.; LOPES, J. G. V.; ARAÚJO-DE, F.E. Estudo sobre o crescimento do fruto e pseudofruto do cajueiro (Anacardium occidentale L) do tipo anăo precoce. Revista Brasileira de Fruticultura, v.9, n.3, p.21-30, 1987.
  • [2] FARAG, R. S.; DAW, Z. Y.; HEWEDI, F. M.; EL-BAROTY, G .S. A. Antimicrobial activity of some egyptian spice essencial oils. Journal of Food Protection, v.52, n.9, p. 665-667, 1989.
  • [3] GELLERMAN, J. L; SCHLENK, H. Methods for isolation and determination of anacardic acids. Analytical Chemistry, v.40, n.4, p.739-743, 1968.
  • [4] HIMEJIMA, M.; KUBO, I. Antimicrobial agents from the cashew Anacardium occidentale (Anacardiaceae) nut shell oil. Journal Agriculture Food Chemistry, v.39, p.418-421, 1991.
  • [5] HIMEJIMA, M.; HOBSON, K.R.; OTAUKA, T.; WOOD, D.L.; KUBO, I. Antimicrobial terpenes from oleoresin of ponderosa pine tree Pinus ponderosa: a defense mechanism against microbial invasion. Journal Chem. Ecol, v.18, p.1809-1818, 1992.
  • [6] KIM, J.; MARSHALL, M. R.; WEI, C. Antibacterial activity of some essential oil components against five foodborne pathogens. Journal Agriculture Food Chemistry, v.43, n.11, p.2839-2845, 1995.
  • [7] KUBO, I.; HIMEJIMA, M. Anethole, a synergist of polygodial against filamentous microrganisms. Journal Agriculture Food Chemistry, v.39, p.2290-2292, 1991.
  • [8] KUBO, I.; MUROI, H.; HIMEJIMA, M. Structure-antibacterial activity relationships of anacardic acids. Journal Agriculture Food Chemistry, v.41, n.6, p.1016-1019, 1993.
  • [9] MUROI, H.; KUBO, A.; KUBO, I. Antimicrobial activity of cashew apple flavor compounds. Journal Agriculture Food Chemistry, v.41, n.7, p.1106-1109, 1993.
  • [10] PELCZAR, M.; REID, R.; CHAN, E.C.S. Controle por agentes químicos. In:PELCZAR, Microbiologia: 1981. Brasil: McGraw-Hill do Brasil, 1981. v.2, p.493-517.
  • [11] SHOBHA, S.V.; KRISHNASWAMY, P.R.; RAVINDRANATH, B. Phenolic lipid composition during development of cashew. Phytochemistry, v.31, n.7, p.2295-2297, 1992.
  • [12] SIVROPOULOU, A.; KOKKINI, S.; LANARAS, T.; ARSENAKIS, M. Antimicrobial activity of mint essential oils. Journal Agriculture Food Chemistry, v.43, n.9, p.2384-2388, 1995.
  • [13] TANIGUCHI, M.; SATOMURA, Y. Structure and Physiological activity of carbostyril compounds. Agriculture Biological Chemistry, v.36, n.12, p.2169-2175, 1972.,
  • 1
    Recebido para publicação em 18/10/2000. Aceito para publicação em 07/02/2001
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      10 Maio 2001
    • Data do Fascículo
      Dez 2000

    Histórico

    • Aceito
      07 Fev 2001
    • Recebido
      18 Out 2000
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