Comparação das técnicas de cromatografia em camada delgada e ELISA na quantificação de aflatoxinas em amostras de milho

Comparison of thin layer chromatography and ELISA techniques in the quantification of aflatoxins in corn samples

Resumos

A comparação das técnicas de Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) e cromatografia em camada delgada (CCD) por quantificação visual e densitométrica foi utilizada na determinação de aflatoxina total, em amostras de milho naturalmente contaminadas. Os teores de aflatoxina total encontrados pelas técnicas de CCD e ELISA, apresentaram maior freqüência na faixa de 0-30 mig/kg e acima de 300 mig/kg. Os resultados das amostras apresentaram coeficiente de variação concentrados abaixo de 20, 30 e 40% para a técnica de ELISA e CCD com quantificação densitométrica e visual, respectivamente. Os coeficientes de correlação foram altamente significativos para as relações entre as quantificações visual e densitométrica (r = 0,9219; t = 26,36; p < 0,001), ELISA e visual (r = 0,8277; t = 17,58; p < 0,001), ELISA e densitometria (r = 0,7373; t = 13,01; p < 0,001), na determinação de aflatoxina total em todas as amostras de milho pesquisadas, confirmando haver equivalência das técnicas estudadas.

Aflatoxinas; cromatografia em camada delgada; ELISA; milho

Two methods, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and thin layer chromatography (TLC) by visual and densitometric, were compared for determination of aflatoxins in corn samples. The highest incidence of total aflatoxin detected by those methods were ranged from 0-30 mug/kg and above 300 mug/kg. For aflatoxins B2, G1, G2 the levels were ranged from 0-30mug/kg. The samples results showed variation coefficient below of 20, 30 and 40% for ELISA and CCD with densitometric and visual quantification, respectively. The correlation coefficients were highly significative for the relation between visual quantification and densitometric (r = 0,9219; t = 28,36; p<0,001), ELISA and visual quantification (r =0,8277; t = 17,58; p< 0,001), ELISA e quantification densitometric (r = 0,7373; t=13,01; p< 0,001), in the total aflatoxin detemination of all corn samples. confirming the equivalence of the studied methods.

Aflatoxin; Thin layer chromatography; ELISA; corn

COMPARAÇÃO DAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA E ELISA NA QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS EM AMOSTRAS DE MILHO¹

Marize Silva OLIVEIRA^2*; Guilherme PRADO²; Roberto Gonçalves JUNQUEIRA³

RESUMO

A comparação das técnicas de Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) e cromatografia em camada delgada (CCD) por quantificação visual e densitométrica foi utilizada na determinação de aflatoxina total, em amostras de milho naturalmente contaminadas. Os teores de aflatoxina total encontrados pelas técnicas de CCD e ELISA, apresentaram maior freqüência na faixa de 0-30 mg/kg e acima de 300 mg/kg. Os resultados das amostras apresentaram coeficiente de variação concentrados abaixo de 20, 30 e 40% para a técnica de ELISA e CCD com quantificação densitométrica e visual, respectivamente. Os coeficientes de correlação foram altamente significativos para as relações entre as quantificações visual e densitométrica (r = 0,9219; t = 26,36; p < 0,001), ELISA e visual (r = 0,8277; t = 17,58; p < 0,001), ELISA e densitometria (r = 0,7373; t = 13,01; p < 0,001), na determinação de aflatoxina total em todas as amostras de milho pesquisadas, confirmando haver equivalência das técnicas estudadas.

Palavras - chave: Aflatoxinas; cromatografia em camada delgada; ELISA; milho.

SUMMARY

COMPARISON OF THIN LAYER CHROMATOGRAPHY AND ELISA TECHNIQUES IN THE QUANTIFICATION OF AFLATOXINS IN CORN SAMPLES. Two methods, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and thin layer chromatography (TLC) by visual and densitometric, were compared for determination of aflatoxins in corn samples. The highest incidence of total aflatoxin detected by those methods were ranged from 0-30 mg/kg and above 300 mg/kg. For aflatoxins B₂, G₁, G₂ the levels were ranged from 0-30 mg/kg. The samples results showed variation coefficient below of 20, 30 and 40% for ELISA and CCD with densitometric and visual quantification, respectively. The correlation coefficients were highly significative for the relation between visual quantification and densitometric (r = 0,9219; t = 28,36; p<0,001), ELISA and visual quantification (r =0,8277; t = 17,58; p< 0,001), ELISA e quantification densitometric (r = 0,7373; t=13,01; p< 0,001), in the total aflatoxin detemination of all corn samples. confirming the equivalence of the studied methods.

Keywords: Aflatoxin; Thin layer chromatography; ELISA; corn.

1 - INTRODUÇÃO

Aflatoxinas são compostos naturais indesejáveis, produzidos por fungos, que infestam produtos agrícolas e representam risco à saúde pública, devido aos seus efeitos de carcinogenicidade, mutagenicidade, teratogenicidade e hepatotoxicidade [22].

Para um controle e monitoramento eficientes dos alimentos susceptíveis à contaminação, os laboratórios oficiais do Ministério da Saúde e da Agricultura devem dispor de técnicas analíticas com sensibilidade, especificidade, rapidez e facilidade de uso, além de exatidão e precisão [18,19]. Entretanto, a obtenção de resultados exatos para micotoxinas não é tarefa muito fácil. Existem vários fatores que dificultam este tipo de análise como, por exemplo, distribuição não uniforme das micotoxinas nos lotes contaminados, concentrações das micotoxinas serem extremamente baixas (da ordem de partes por bilhão), extratos usualmente estarem acompanhados de lípides e pigmentos interferentes, necessitando de uma fase de limpeza e a natureza variada das amostras, as quais requerem diferentes procedimentos na extração [12].

Na prática, as aflatoxinas têm sido detectadas por técnicas físico-químicas e biológicas [9,18]. Dentre as técnicas físico-químicas estão as cromatográficas (camada delgada, líquida de alta eficiência e gasosa) e instrumentais (fluorodensitometria e espectrofotometria). As técnicas biológicas incluem os bioensaios (cultura de tecidos, animais e microorganismos) e imunoensaios (radioimunoensaio, cromatografia de afinidade e "Enzyme Linked Immunosorbent Assay"- ELISA). Muitas destas técnicas são dispendiosas, demoradas, de execução complexa e requerem instrumentação sofisticada, nem sempre disponível na maioria dos laboratórios brasileiros.

O teste ELISA detecta e amplifica a reação antígeno-anticorpo pela ligação covalente entre enzima-anticorpo ou enzima-analito, cuja presença é subseqüentemente determinada pela adição de enzima no substrato. A quantidade de substrato convertido a um dado tempo é indicativo da concentração original do composto a ser analisado [2]. Diversos trabalhos vêm demonstrando as vantagens apresentadas pela técnica de ELISA [1,5,9,11,14], sendo destacados os seguintes aspectos:

1- Especificidade - com a utilização de anticorpos monoclonais de boa preparação é possível obter uma boa minimização nas reações cruzadas.

2- Sensibilidade - o sistema de amplificação enzimática pode assegurar à metodologia elevada sensibilidade, visto que limites de determinação inferiores a 0,5ng/g na amostra já foram relatados.

3- Rapidez - a análise pode ser efetuada em torno de 20-30 minutos. Entretanto, para a maioria dos alimentos, cuja etapa de preparo e extração prévia é obrigatória, aproximadamente 24 horas podem ser requeridas.

4- Facilidade de uso - o manuseio do teste de ELISA é de muita simplicidade, sendo efetuado em condições reduzidas de tempo e de trabalho.

5- Custos - em função da rapidez e facilidade de uso, o custo do teste de ELISA é considerado relativamente baixo, em comparação às técnicas convencionais. Apesar dos custos da produção de anticorpos serem elevados, uma pequena quantidade deste é utilizado em cada ensaio, fazendo com que o custo por teste seja significativamente reduzido.

Neste estudo, o objetivo foi comparar técnicas de quantificação de aflatoxinas: a cromatografia em camada delgada com quantificação visual e densitométrica e a técnica de ELISA, em amostras de milho naturalmente contaminadas. Esta comparação visa avaliar estas técnicas de quantificação, com base na sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade, variabilidade e facilidade de aplicação.

2 - MATERIAIS E MÉTODOS

Foram determinados o teor de aflatoxina total em 72 amostras de milho em grão (Zea mays L.), naturalmente contaminadas, enviadas pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA, em Sete Lagoas, MG, as quais foram colhidas a medida em que os grãos atingiram as umidades próximas de 11%, 16%, 17% 18%, 22% e 25% em base úmida. As amostras em grão foram previamente moídas, homogeneizadas e passadas em tamiz 20mesh. Posteriormente, fez-se o quarteamento até aproximadamente 500g. Para a cromatografia em camada delgada, as aflatoxinas foram extraídas e quantificadas pelo método de SOARES & RODRIGUEZ-AMAYA [21], utilizando entretanto, na separação cromatográfica, a fase móvel recomendada por GIMENO [10]. A quantificação visual foi feita sob luz ultra-violeta de comprimento de onda longo (366 m), em aparelho Chromatovue-Camag, sendo a intensidade das fluorescências das amostras comparadas com a intensidade das fluorescências dos padrões e os teores encontrados somados. A quantificação densitométrica foi feita em densitômetro Camag CCD-Scanner II, acoplado a integrador HP 3396, nas seguintes condições: lâmpada de mercúrio, excitação em 366nm e emissão em 400nm (filtro secundário K400), monocromador com largura da banda de 30nm, dimensão da fenda 0,3 x 4mm, velocidade da corrida 1 mm/seg. Os padrões de aflatoxina B₁, B₂, G₁, G₂ da Sigma Chemical Company foram preparados segundo AOAC [3] tanto para a quantificação visual como densitométrica. A confirmação da identidade das aflatoxinas foi feita segundo o método descrito por PRZYBYLSKY [17]. Para o teste imunológico foi utilizado o kit Veratox para determinação quantitativa de aflatoxina total (B₁+B₂+G₁+G₂) da Neogen Corporation. A extração e quantificação foram feitas segundo as instruções do fabricante e as amostras que continham teores acima da curva padrão do kit (0-50mg/kg) foram diluídas para que as leituras obtidas estivessem dentro desta faixa, como recomendado por PESTKA [16]. A extração das aflatoxinas foi feita adicionando-se 250ml de metanol 70% à 50g da amostra. Uma quantidade de 100ml deste extrato foi adicionada à 100 ml do conjugado nas cavidades de diluição, nas quais foram adicionadas também 100ml de cada padrão ao conjugado. Em seguida misturou-se o conteúdo de todas cavidades com uma pipeta multicanal, transferindo-se então, 100ml desta mistura (conjugado e extrato ou padrão), às cavidades sensibilizadas com anticorpos. Após incubação por 10 minutos, foram adicionados 100ml do substrato e 100ml da solução bloqueadora, onde a cor azul resultante desta solução, indica que a amostra é negativa e avermelhada é fortemente positiva. A determinação quantitativa foi feita em uma leitora de ELISA EL 301 Microwell com filtro de 650nm usando o ar como zero. Os controles de a flatoxinas de 0, 5, 15,50 mg/kg e as amostras foram testados em três repetições.

3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

NaTabela 1 estão registrados somente os valores de aflatoxina total das 48 amostras que obtiveram resultados positivos. Observa-se que muitos dos teores de aflatoxinas encontrados foram bastante elevados. Essas amostras de milho foram plantadas e colhidas com vários teores de umidade, especificamente para este estudo, não refletindo assim, a incidência de aflatoxinas do milho brasileiro, o qual é colhido normalmente com umidade inferior a 11%. Das 72 amostras de milho analisadas, 24 apresentaram resultados negativos pelos três métodos, demonstrando que não houve resultado falso positivo por ELISA, o qual também não apresentou nenhum resultado falso negativo. Para que os dados obtidos pela técnica de CCD - cromatografia em camada delgada pudessem ser comparados com os do ELISA, as quatro aflatoxinas de cada repetição foram somadas e a média dos valores encontrados com o respectivo desvio padrão são mostrados na mesma Tabela. A diferença entre os resultados encontrados, pode ser avaliada pelo fato das extrações e identificações das técnicas não serem as mesmas, bem como a variação natural de contaminação ocorrida nos grãos individualmente. Segundo SHOTWELL et al [20], é possível encontrar em amostras de milho contaminadas, grãos com níveis de 0 a 300 mg/kg de aflatoxina, demonstrando assim a variabilidade da sua distribuição no substrato.

A determinação do coeficiente de variação foi feita para avaliar a precisão dos ensaios. A Figura 1 representa a distribuição do CV em função da concentração de aflatoxina total. Para a técnica de ELISA, o CV concentrou abaixo de 20% e na quantificação densitométrica e visual, abaixo de 30 e 40%, respectivamente. BECKWITH & STOLOFF [4] descreveram que a precisão para procedimentos de comparação em técnicas de determinação de aflatoxinas não são melhores que ± 20% para uma única observação, sendo que em condições de operação insuficientes podem chegar a ± 28%. Em procedimentos densitométricos esta precisão pode melhorar para cerca de ± 9% em uma média de múltiplas observações. Segundo os mesmos autores, altos resultados de precisão são obtidos com níveis de aflatoxina B₁ acima de 80mg/kg. Os coeficientes de variação médio encontrados para as quantificações visual e densitométrica e a técnica de ELISA para concentrações até 500m g/kg foram 34,5%, 24,8%, e 12,0% respectivamente. Para concentrações de aflatoxina total acima de 500mg/kg os CV médio foram 25,3%, 26,3% e 30,6% para as quantificações visual e densitométrica e a técnica de ELISA, respectivamente, confirmando uma precisão satisfatória para as técnicas estudadas, principalmente na faixa permitida pelas legislações [6,7]. PARK et al [15] relataram um estudo em amostras de milho contaminadas com aflatoxina B₁ e analisadas usando o mesmo kit do presente trabalho, que no nível de 31mg/kg o CV encontrado foi de 19,4% para repetibilidade. Entretanto CHU et al [8]descreveram a possibilidade de uma variação de 20-30%.

A distribuição de freqüência dos teores de aflatoxina total foi empregada para avaliar a equivalência entre os resultados determinados pelas técnicas de ELISA e CCD com quantificação visual e densitométrica. Para todas as técnicas, os resultados concentraram-se em dois grandes grupos, sendo um no intervalo de 0-30mg/kg e o outro no intervalo dez vezes mais elevado (>300 mg/kg), o que pode ser justificado pelos níveis de umidade de 11 a 25% das amostras quando foram colhidas. Somados, estes grupos representam mais de 70% dos resultados encontrados para todas as determinações em cada técnica de quantificação.

O teste de independência entre as técnicas de determinação e as faixas de teores, demonstrou que não existem evidências suficientes para indicar a ausência de independência entre os critérios de classificação. Portanto, os dados são compatíveis com a hipótese de que, para qualquer técnica empregada, serão obtidas freqüências equivalentes dentro das mesmas faixas de teores de aflatoxina total. Tendo em vista as legislações brasileiras para aflatoxinas em alimentos reguladas pela Resolução nº 34/76 do Ministério da Saúde [7], que estabelece 30mg/kg para a soma das aflatoxinas B₁ e G₁ e pela Portaria nº 183 do Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária [6], que estabelece o limite máximo de 20mg/kg para a somatória das aflatoxinas B₁, B₂, G₁ e G₂ acompanhando o estabelecido pelos países do MERCOSUL [13], a técnica de ELISA pode ser utilizada como procedimento de triagem.

Os teores de aflatoxina encontrados pelas técnicas, foram comparados por meio da determinação dos coeficientes de correlação ( r ). O estudo utilizando os resultados de aflatoxina total das amostras com 3 repetições cada (N = 144) mostrou coeficientes de correlação altamente significativos quando se considera a relação entre as quantificações visual e densitométrica (r = 0,9219; t = 28,36; p < 0,001), e entre ELISA e quantificação visual (r = 0,8277; t = 17,58; p< 0,001). Foi verificado ainda, uma correlação significativa entre a técnica de ELISA e a quantificação densitométrica (r= 0,7373; t = 13,01; p < 0,001). Quando a estatística Z ( r ) foi empregada para comparar os diferentes valores de r obtidos, em nenhum dos contrastes aplicados foi encontrada diferença significativa. Portanto, r₁ = 0,9219 e r₂ = 0,7374 não diferem entre si a 5% de probabilidade e com base nesta comparação, não temos evidências para afirmar, que a quantificação densitométrica se correlaciona melhor com a quantificação visual de que com a técnica de ELISA.

A Figura 2 representa o diagrama de dispersão dos teores de aflatoxina total obtidos pelas três identificações e a correlação estatisticamente estimada. Para explicitar a interdependência entre as variáveis correlacionadas foi também representado em cada gráfico a reta de regressão. Pode-se verificar que a dispersão foi maior nas concentrações mais elevadas.

4 - CONCLUSÕES

Os teores de aflatoxina total, encontrados pelas técnicas de CCD e ELISA, apresentaram maior freqüência na faixa de 0-30mg/kg e acima de 300mg/kg.

Os resultados das amostras naturalmente contaminadas apresentaram coeficiente de variação concentrados abaixo de 20, 30 e 40% para a técnica de ELISA e CCD com quantificação densitométrica e visual, respectivamente.

Os coeficientes de correlação foram altamente significativos para as relações entre a quantificação visual e densitometrica, ELISA e quantificação visual, ELISA e quantificação densitometrica, na determinação de aflatoxina total em todas as amostras de milho pesquisadas. A técnica de ELISA pode ser usada como procedimento de triagem na determinação de aflatoxina total em amostras de milho, devido a sua sensibilidade, rapidez e facilidade de manuseio.

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 - AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro.

²Fundação Ezequiel Dias -Divisão de Bromatologia e Toxicologia –Núcleo de Micologia e Micotoxinas – Rua Conde Pereira Carneiro, 80 –Gameleira – Belo Horizonte/MG – 30510-010.

³Faculdade de Farmácia da UFMG -Departamento de Alimentos –Av. Olegário Maciel, 2360 –Belo Horizonte/MG –30180-112.

* A quem a correspondência deve ser enviada.

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Recebido para publicação em 28/03/00. Aceito para publicação em 18/12/00

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Maio 2001
• Data do Fascículo
  Dez 2000

Histórico

• Recebido
  28 Mar 2000
• Aceito
  18 Dez 2000