Determinação de resíduos de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina em tecidos de origem animal

Determination of nitrofurazone, furazolidone and nicarbazin residues in animal tissues

DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE NITROFURAZONA, FURAZOLIDONA E NICARBAZINA EM TECIDOS DE ORIGEM ANIMAL¹

Scheilla V. C. SOUZA²,^*, Gilsara SILVA², Maria Helena G. M.DINIZ², Eleonora V.SANTOS², Josefa A.LIMA², João C. TEODORO²

RESUMO

Foi padronizado e validado um método analítico para determinação de resíduos de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina em tecido muscular empregando-se extração com acetonitrila, purificação com cartuchos de sílica e C₁₈ e detecção e quantificação por CLAE/UV. Nos ensaios com amostras fortificadas entre 5 e 200mg/kg as recuperações médias obtidas variaram de 73,6 a 95,6% com valores de C.V. entre 4,8 e 26,4%. O limite de detecção e quantificação do método foi de 5mg/kg, para cada um dos três resíduos estudados.

Palavras-chave: nitrofurazona; furazolidona; nicarbazina; resíduos; tecido animal; cromatografia.

SUMMARY

DETERMINATION OF NITROFURAZONE, FURAZOLIDONE AND NICARBAZIN RESIDUES IN ANIMAL TISSUES. A method for determination of nitrofurazone, furazolidone and nicarbazin residues in muscle tissues was standardized and validated using acetonitrile extraction, clean-up with silica and C₁₈ cartridges and detection and quantification by HPLC/UV. In the assays using spiked samples in levels varying from 5 to 200mg/kg the average recovery values ranged from 73.6 to 95.6% with C.V. values between 4.8 and 26.4%. The limits of detection and quantification of this method was 5mg/kg for each studied residue.

keywords: nitrofurazone; furazolidone; nicarbazin; residues; tissue; chromatography; juice; sodium metabissulfite; nitrogen; shelf life.

1 ¾ INTRODUÇÃO

A furazolidona e a nitrofurazona são antimicrobianos sintéticos, de amplo espectro, com atividade antiprotozoária, pertencentes a um grupo de compostos denominados nitrofuranos [1, 2]. Estes são utilizados em avicultura e suinocultura no controle de salmonelose, colibacilose e coccidiose [3, 4, 5]. São também empregados como aditivos não nutricionais em rações, para promoção de crescimento e aumento da eficiência alimentar [3, 5].

Apresentam efeitos mutagênicos, carcinogênicos [3] e possibilidade de reações de hipersensibilidade em indivíduos sensíveis, sendo necessário uma rigorosa regulamentação do seu uso em animais destinados a produção de alimentos. No Brasil, foram estabelecidos para estes compostos limites de tolerância zero, em músculo de frango, sendo proibida sua utilização em animais produtores de alimentos [4]. O MERCOSUL propôs uma regulamentação para estas drogas que também estabelece limites máximos de resíduo zero [6]. A proibição da utilização destes compostos em animais destinados à alimentação humana vinculou a legislação à sensibilidade dos métodos analíticos adotados pelos organismos oficiais de regulamentação.

A nicarbazina é um coccidiostático empregado na avicultura, também utilizado como promotor de crescimento. Dissocia-se rapidamente in vivo em dois componentes: o 4-4-dinitrocarbanilida (DNC) e 2-hidroxi 4,6-dimetil 2-pirimidinol (HDP) [2]. O componente HDP apresenta uma biotransformação mais rápida que o DNC, sendo excretado na urina (95%), enquanto o DNC é eliminado, sobretudo, nas fezes [7]. Desta forma, o problema de resíduos de nicarbazina em alimentos de origem animal é representado praticamente pelo componente DNC, o qual persiste mais tempo no organismo do animal que o HPD [8].

Durante o processo de cozimento de carnes contendo resíduos de DNC ocorre a formação de derivados com atividade carcinogênica. Existem também relatos de efeitos crônicos em estudos com animais (ratos e cães que apresentaram NOEL de 50 e 60mg DNC/kg de peso corporal, respectivamente) [8]. Enquanto os limites e intervalos de segurança para nicarbazina em músculo de frango estão sendo ultimados pelo CODEX ALIMENTARIUS FAO/WHO, como uma prioridade, o Brasil adotou o limite máximo de resíduo de 200mg/kg [4].

Métodos analíticos para determinação de nitrofuranos e nicarbazina que empregam extração com solventes como acetato de etila [5, 9], acetonitrila [1] ou dimetilformamida [10, 11], seguida de purificação por extração em fase sólida [1, 5, 9, 11] e determinação por cromatografia líqüida de alta eficiência (CLAE) com detecção de ultra-violeta (UV) [1, 5, 9, 11, 12], têm sido amplamente utilizados e recomendados por organismos oficiais de regulamentação [4, 13].

Independente da técnica utilizada, o controle de resíduos de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina em alimentos requer métodos eficientes, principalmente no que diz respeito à sensibilidade, visando garantir a confiabilidade dos dados relativos à incidência de resíduos destes compostos, que subsidiam a formulação de políticas de saúde pública e adequação do país, do ponto de vista sanitário, às regras do comércio internacional de alimentos.

Este trabalho objetivou padronizar e validar um método multiresíduo [14,15,16], para determinação de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina (fração DNC) em músculo por CLAE/UV, baseado nos descritos por NAGATA & SAEKI [14], ESPANHA [15] e TARBIN & SHEARER [16], a ser adotado nas atividades de monitoramento do Laboratório regional de Apoio Animal LARA/MG para o Plano Nacional de Controle de Resíduos Biológicos em Produtos de Origem Animal (PNCRB) do Ministério da Agricultura e do Abastecimento.

2 ¾ MATERIAL E MÉTODOS

2.1 ¾ Padrões

Os padrões de nitrofurazona e furazolidona empregados foram da marca Sigma (St. Louis, MO). Para nicarbazina foi utilizado um produto comercial com 99% de pureza. As soluções estoques de nitrofurazona e furazolidona foram preparadas utilizando acetonitrila enquanto a solução estoque de nicarbazina foi preparada com dimetilformamida. Nas soluções intermediárias e de fortificação dos três resíduos foi utilizada acetonitrila. Posteriormente, as soluções foram devidamente acondicionadas, identificadas e armazenadas, sob temperatura de congelamento, devidamente protegidas da luz e vedadas, até o momento da análise.

2.2 ¾ Amostras

Foram utilizadas amostras de músculo de aves, previamente analisadas por outro método, já validado, e com resultados não detectados para nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina. As amostras foram fortificadas por adição de solução padrão das substâncias pesquisadas.

2.3 ¾ Procedimentos analíticos

2.3.1 ¾ Extração

Os resíduos de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina foram extraídos de 10g de amostra com 15mL de acetonitrila, após centrifugação a 2500rpm, por 5 minutos, a ¾20°C e filtração do extrato através de sulfato de sódio anidro (cerca de 20g).

2.3.2 ¾ Purificação

O extrato foi primeiramente purificado por partição líquido:líquido utilizando 3 porções de 10mL de hexano. A fase de acetonitrila foi evaporada e o resíduo dissolvido em 1mL de metanol, o qual foi aplicado em cartucho de sílica Waters de 6 mL/500mg. Os resíduos foram eluidos com 6mL de acetato de etila. Em seguida, o extrato purificado foi evaporado a cerca de 1mL e aplicado em um cartucho de C₁₈ Waters de 6mL/500mg (previamente ativado com 4mL de metanol e 4mL de acetato de etila). Os resíduos de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina foram novamente eluidos com 4mL acetato de etila.

2.3.3 ¾ Separação, detecção e quantificação

Os extratos purificados foram evaporados, solubilizados em 1mL de acetonitrila:ácido acético a 1% (50:50; v/v), filtrados em membrana Millipore de 0,45mm e analisados por CLAE (sistema de bomba quaternário, degaseificador de membrana, injetor automático e detector UV Termo Separation Products; aquisição, controle e processamento de dados por microcomputador IBM), sob as seguintes condições:

• detector ultra violeta, 360nm;

• coluna Lichrosorb C₁₈, 5mm, 250 x 4,6mm;

• tempo de separação de 8 minutos;

• fase móvel acetonitrila:ácido acético a 1%, em gradiente (tempo zero acetonitrila:ácido acético a 1% (50:50, v/v) e em 8 minutos acetonitrila a 100%);

• fluxo de 1mL/min;

• volume de injeção de 20mL.

2.4 ¾ Procedimentos de validação

2.4.1 ¾ Ensaios com padrões

Foram realizados ensaios com soluções padrões (pools) para determinação da linearidade sem interferência da matriz e do limite de detecção do equipamento [17,18]. As soluções empregadas foram de 0; 0,391; 0,781; 1,563; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200; 400 e 800ng/mL.

2.4.2 ¾ Ensaios com amostras fortificadas

Os níveis de contaminação avaliados nos ensaios com amostras fortificadas, em pelo menos cinco repetições, foram 2,5; 5; 10; 20; 40; 80 e 200mg/kg. A cada grupo de amostras fortificadas destinado à análise foi incluída uma amostra branca para confirmação da não detecção dos resíduos pesquisados.

Nestes ensaios foram avaliados linearidade com interferência da matriz, especificidade, exatidão, precisão, limites de detecção e quantificação do método [17,18].

2.4.3 ¾ Valores de referência

Foram adotados como referência para avaliação da exatidão e precisão os valores estabelecidos como aceitáveis pelo CODEX [19] e internalizadas pelo MERCOSUL [20] para métodos quantitativos (Tabela 1).

3 ¾ RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos ensaios com soluções padrões (0; 0,391; 0,781; 1,563; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200; 400 e 800ng/mL), foi demonstrada linearidade da resposta na faixa de 800 a 3,125ng/mL, com coeficientes de correlação superiores a 0,9997, conforme ilustrado na Figura 1. Não foi registrado pico de nicarbazina para a solução de 1,563ng/mL e nenhum dos três compostos foram detectados nas soluções de 0,391 e 0,781ng/mL.

O limite de detecção do equipamento, determinado como a menor massa da substância detectada, nas condições estabelecidas pelo método, com sinal, no mínimo, três vezes o valor do maior sinal de ruído no cromatograma [17,18], foi de 0,125ng, para cada um dos três resíduos, correspondente à massa injetada em 20mL da solução de 6,25ng/mL.

Especificidade e linearidade da resposta, considerando-se a interferência da matriz, foram observadas nos ensaios utilizando amostras fortificadas. Os picos de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina apresentaram resolução satisfatória, separados dos picos de interferentes. Houve concordância entre os tempos de retenção dos três compostos pesquisados nos cromatogramas obtidos para soluções padrões e amostras (Figura 2).

As porcentagens de recuperação médias e coeficientes de variação obtidos nos ensaios com amostras fortificadas, para cada nível estudado, estão descritos na Tabela 2. Foi verificada exatidão e precisão dentro dos intervalos descritos como aceitáveis (Tabela 1) [19,20] para os níveis 5; 10; 20; 40; 80 e 200mg/kg. Nesta faixa os valores médios de porcentagem de recuperação e coeficientes de variação apresentaram-se entre 73,6 a 95,6% e 4,8 e 26,4%, respectivamente. Os resíduos pesquisados não foram detectados em todas as amostras fortificadas com 2,5 mg/kg. Neste nível de fortificação não foram contemplados os valores estabelecidos como aceitáveis (Tabela 1) [19,20]. Portanto, o nível 5mg/kg foi estabelecido como limite de detecção e quantificação do método.

Os valores individuais de porcentagem de recuperação obtidos para a faixa de linearidade do método (5 a 200mg/kg) estão demonstrados na Figura 3. Pode-se observar que a dispersão entre os valores de porcentagem de recuperação, em um mesmo nível de fortificação, apresenta-se maior quanto menor o nível de fortificação estudado. Entretanto, em todos os casos os valores apresentaram-se dentro dos intervalos estabelecidos pelo CODEX [19] e MERCOSUL [20] (Tabela 1).

Foram considerados como pontos críticos do método o peso da amostra, o volume final de retomada do extrato purificado, o fluxo de eluição nos cartuchos, proteção quanto à exposição de luz direta e relação tempo/temperatura de evaporação.

4 ¾ CONCLUSÕES

O método padronizado e validado mostrou-se eficiente em termos de linearidade, especificidade, sensibilidade, exatidão e precisão, além de possuir limites de detecção e quantificação suficientemente baixos para ser adotado nas atividades de monitoramento de resíduos de nitrofurazona, furazolidona e nicarbazina em músculo.

5 ¾ REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

² Setor de Cromatografia, Laboratório Regional de Apoio Animal (LARA/MG), Ministério da Agricultura e do Abastecimento (MA), Tel. [phone], Fax [phone], e-mail [e-mail]

* A quem a correspondência deve ser enviada.

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Recebido para publicação em 04/02/00. Aceito para publicação em 18/04/01.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  31 Ago 2001
• Data do Fascículo
  Jan 2001

Histórico

• Aceito
  18 Abr 2001
• Recebido
  04 Fev 2000