CONFIRMAÇÃO DA IDENTIDADE DA alfa-CRIPTOXANTINA E INCIDÊNCIA DE CAROTENÓIDES MINORITÁRIOS PROVITAMÍNICOS A EM VERDURAS FOLHOSAS VERDES

CONFIRMATION OF THE IDENTITY OF alpha-CRYPTOXANTHIN AND INCIDENCE OF MINOR PROVITAMIN A CAROTENOIDS IN GREEN LEAFY VEGETABLES

Resumos

Numerosos trabalhos comprovaram que os carotenóides principais de folhas verdes são invariavelmente luteína, beta-caroteno, violaxantina e neoxantina. No entanto, há discordância em torno dos carotenóides minoritários. Portanto, a espectrometria de massas por impacto de elétrons e cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos foram utilizados para confirmar a identidade de carotenóides minoritários com atividade provitamínica A em verduras folhosas brasileiras. Os carotenóides pró-vitamínicos A, incluindo os isômeros cis e trans de beta-caroteno, foram separados em coluna de C18 polimérica, Vydac 201TP54, com metanol/água (98:2) como fase móvel. Os espectros UV-visível e de massas confirmaram o carotenóide monoidroxilado como sendo alfa-criptoxantina e não beta-criptoxantina como aponta a literatura internacional. Todas as onze folhas analisadas (agrião, alface crespa, alface lisa, almeirão, caruru, chicória, couve, espinafre, rúcula, salsinha e taioba) apresentaram alfa-criptoxantina, 13-cis-beta-caroteno e 9-cis-beta-caroteno, enquanto que alfa-caroteno foi encontrado em apenas quatro folhas (caruru, couve, salsinha e taioba).

carotenóides; espectrometria de massas; cromatografia líquida de alta eficiência; verduras folhosas verdes

The main carotenoids from green leafy vegetables have been consistently found to be lutein, beta-carotene, violaxanthin and neoxanthin. However, there is a controversy about the identity of minor carotenoids. Therefore, electron impact mass spectrometry and high performance liquid chromatography with a diode array detector were used in order to confirm the identity of the minor provitamin A carotenoids in Brazilian green leaves. The provitamin A carotenoids, including the cis and trans isomers of beta-carotene, were separated on a polymeric C18 column, Vydac 201TP54, with MeOH/H2O (98:2) as mobile phase. The UV-visible and mass spectra confirmed that the monohydroxy carotenoid present in Brazilian green leafy vegetable to be alpha-cryptoxanthin, and not beta-cryptoxanthin as reported in the international literature. All eleven green leaves analyzed (water-cress, unheaded lettuce, lettuce, wild chicory, "caruru", common chicory, kale, spinach, endive, roquette, parsley, and "taioba") had alpha-cryptoxanthin, 9-cis and 13-cis- beta-carotene, whereas alpha-carotene was found in only four of these leaves ("caruru", kale, salsinha and "taioba").

carotenoids; mass spectrometry; high performance liquid chromatography; green leafy vegetables

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Adriana Z. MERCADANTE^2*, Délia RODRIGUEZ-AMAYA²

RESUMO

Numerosos trabalhos comprovaram que os carotenóides principais de folhas verdes são invariavelmente luteína, b-caroteno, violaxantina e neoxantina. No entanto, há discordância em torno dos carotenóides minoritários. Portanto, a espectrometria de massas por impacto de elétrons e cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos foram utilizados para confirmar a identidade de carotenóides minoritários com atividade provitamínica A em verduras folhosas brasileiras. Os carotenóides pró-vitamínicos A, incluindo os isômeros cis e trans de b-caroteno, foram separados em coluna de C₁₈ polimérica, Vydac 201TP54, com metanol/água (98:2) como fase móvel. Os espectros UV-visível e de massas confirmaram o carotenóide monoidroxilado como sendo a-criptoxantina e não b-criptoxantina como aponta a literatura internacional. Todas as onze folhas analisadas (agrião, alface crespa, alface lisa, almeirão, caruru, chicória, couve, espinafre, rúcula, salsinha e taioba) apresentaram a-criptoxantina, 13-cis-b-caroteno e 9-cis-b-caroteno, enquanto que a-caroteno foi encontrado em apenas quatro folhas (caruru, couve, salsinha e taioba).

Palavras-chave: carotenóides; espectrometria de massas; cromatografia líquida de alta eficiência; verduras folhosas verdes.

SUMMARY

CONFIRMATION OF THE IDENTITY OF a-CRYPTOXANTHIN AND INCIDENCE OF MINOR PROVITAMIN A CAROTENOIDS IN GREEN LEAFY VEGETABLES. The main carotenoids from green leafy vegetables have been consistently found to be lutein, b-carotene, violaxanthin and neoxanthin. However, there is a controversy about the identity of minor carotenoids. Therefore, electron impact mass spectrometry and high performance liquid chromatography with a diode array detector were used in order to confirm the identity of the minor provitamin A carotenoids in Brazilian green leaves. The provitamin A carotenoids, including the cis and trans isomers of b-carotene, were separated on a polymeric C₁₈ column, Vydac 201TP54, with MeOH/H₂O (98:2) as mobile phase. The UV-visible and mass spectra confirmed that the monohydroxy carotenoid present in Brazilian green leafy vegetable to be a-cryptoxanthin, and not b-cryptoxanthin as reported in the international literature. All eleven green leaves analyzed (water-cress, unheaded lettuce, lettuce, wild chicory, "caruru", common chicory, kale, spinach, endive, roquette, parsley, and "taioba") had a-cryptoxanthin, 9-cis and 13-cis- b-carotene, whereas a-carotene was found in only four of these leaves ("caruru", kale, salsinha and "taioba").

Keywords: carotenoids; mass spectrometry; high performance liquid chromatography; green leafy vegetables.

1 ¾ INTRODUÇÃO

Segundo GOODWIN [18], os tecidos de plantas verdes superiores possuem quatro carotenóides principais: b-caroteno, luteína, violaxantina e neoxantina. Esta afirmação foi comprovada em numerosos trabalhos. No entanto, há discordância, em torno dos carotenóides minoritários. Os pigmentos que são esporadicamente relatados, em pequenas quantidades, são: cis-isômeros de b-caroteno, a-caroteno, b-criptoxantina, zeaxantina, anteraxantina e 5,6-epóxi-luteína.

ROUCHAUD et al [36] e o grupo de RODRIGUEZ-AMAYA [24, 25, 34] foram os únicos pesquisadores que encontraram a-criptoxantina ao invés de b-criptoxantina em folhas verdes. Nos trabalhos citados acima, a identificação foi baseada no espectro de absorção na região visível (l_max e forma), nas propriedades cromatográficas e nos três últimos estudos [24, 25, 34], também na reação de metilação que indicou a posição alílica da hidroxila. Como existem três possíveis carotenóides monoidroxilados (Figura 1), ainda existe na literatura internacional uma confusão sobre a identidade do carotenóide monoidroxilado presente em folhas verdes, sendo que na maioria dos trabalhos foi escolhido um ou outro sem a devida comprovação.

A introdução da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) na área de carotenóides em alimentos permitiu a separação de um maior número de compostos, incluindo diversos isômeros geométricos, tornando ainda mais difícil a identificação conclusiva destes compostos. Desta forma, um grande número de trabalhos na literatura tem apresentado identificações equivocadas.

Um conjunto de parâmetros é utilizado para a identificação dos carotenóides: (a) espectro de absorção no UV-visível, (b) ordem de eluição na coluna cromatográfica, (c) co-cromatografia com amostras autênticas e (d) espectro de massas [23]. O uso do detector de arranjo de diodos (DAD) permite a obtenção "on line" dos espectros de absorção. A espectrometria de massas (EM) é uma técnica altamente recomendada para a confirmação da identidade de carotenóides e para a elucidação da estrutura de carotenóides desconhecidos, pois quase sempre fornece a massa molecular e alguns dos fragmentos obtidos por impacto de elétrons são indicativos dos grupos terminais. A EM foi largamente utilizada para a elucidação ou confirmação das estruturas de carotenóides em fungos, algas e bactérias. O seu maior uso para carotenóides em alimentos é um acontecimento mais recente [26, 27, 28, 29, 30, 31, 32].

No presente trabalho, os parâmetros mencionados acima foram utilizados para confirmar a identidade dos carotenóides minoritários provitamínicos A em folhas verdes.

2 ¾ MATERIAL E MÉTODOS

2.1 ¾ Amostras

As seguintes verduras folhosas foram compradas no comércio de Campinas e imediatamente levadas ao laboratório para análise: alfaces crespa e lisa (Lactuca sativa), caruru (Amaranthus viridis), couve (Brassica oleracea var. acephala), taioba (Xanthosoma spp.), agrião (Nastrutium officinale), salsinha (Petroselium hortense), rúcula (Eruca sativa), almeirão (Chicorium intybus), chicória (Chicorium endivia) e espinafre (Spinacea oleracea). Cada maço de folha foi triturado separadamente em multiprocessador e retirada a quantidade necessária de amostra para análise por CLAE (aproximadamente 5g).

A a-criptoxantina foi extraída de dois maços de caruru (aproximadamente 100g), pois esta folha foi a que apresentou o maior teor de a-criptoxantina dentre as várias folhas previamente analisadas no Brasil [24, 25, 34].

2.2 ¾ Etapas pré-cromatográficas

As etapas de extração e saponificação foram executadas de acordo com o método de RODRIGUEZ-AMAYA et al [35]. Apesar da saponificação não ter sido necessária para a separação dos carotenóides de folhas [24, 25], esta etapa foi incluída no presente trabalho com o intuito de eliminar lipídeos e clorofila a fim de facilitar o posterior isolamento e visualização dos carotenóides minoritários.

2.3 ¾ Isolamento da a-criptoxantina

Para prevenir a contaminação dos carotenóides desde a extração até o isolamento final, não foram usadas garrafas e pissetas plásticas, e a água destilada foi recolhida em recipiente de vidro [3, 6]. Além disso, todos os solventes grau P.A. foram destilados, e os peróxidos removidos do éter etílico (EE) pela adição de ferro reduzido antes da destilação. O EE, assim purificado, foi utilizado dentro de cinco dias.

Após extração dos carotenóides de caruru, o extrato saponificado foi aplicado em uma coluna de vidro, empacotada à vácuo com MgO/Hyflosupercel (1:2) até a altura de cerca de 10cm. Uma pequena quantidade de sulfato de sódio anidro foi adicionada ao topo da coluna para reter a água que ainda estivesse presente na amostra. A coluna foi molhada com éter de petróleo (EP) e, após aplicação da amostra, desenvolvida com proporções crescentes de EE em EP. A banda contendo a-criptoxantina foi eluída com 10 a 30% de EE em EP.

Após evaporação do solvente, a fração contendo a-criptoxantina foi acondicionada em ampola âmbar, selada sob atmosfera de N₂ e transportada, sem refrigeração, à Inglaterra. O carotenóide foi purificado por cromatografia em camada delgada de sílica, com EP:EE (3:2) como fase móvel. A banda principal, apresentando cor amarela e R_f 0,7, foi raspada e o carotenóide rapidamente extraído com EE, em funil de vidro sinterizado sob vácuo.

Imediatamente antes da EM, a a-criptoxantina foi re-purificada através de uma mini-coluna de alumina (grau III). Utilizou-se como fase móvel 10% de EE em EP para retirada de possíveis compostos menos polares que ainda estivessem presentes, e a a-criptoxantina foi eluída com 25 a 50% de EE em EP.

2.4 ¾ Espectrometria de massas

Utilizou-se um espectrômetro de massas marca VG (VG Biotech., UK) modelo Quattro Triple Quadrupole. O carotenóide foi introduzido diretamente por sonda na câmara de ionização a 240°C. Empregou-se ionização por impacto de elétrons, com energia de 70eV.

A interpretação do espectro de massas foi baseada nas fragmentações características, disponíveis na literatura [14, 15, 16].

2.5 ¾ Cromatografia líquida de alta eficiência

Utilizou-se um cromatógrafo líquido Varian, com sistema ternário de bombeamento de solvente, modelo 9010, e válvula injetora "Rheodyne" com alça de amostra de 10mL de capacidade. O DAD da Waters, modelo 994, foi acoplado a um integrador-registrador Varian, modelo 4400. Os carotenóides foram separados em coluna polimérica de C₁₈, marca Vydac 201TP54 (5mm, 250 x 4,6mm), utilizando como fase móvel metanol/água (98:2) com vazão de 1,5mL/min [17]. Os cromatogramas foram obtidos a 445nm e os espectros entre 300 e 600nm.

Os comprimentos de onda de absorção máxima (l_max) e grau de estrutura fina (%III/II) dos espectros na região do visível foram comparados com os da literatura [5, 13] fornecendo uma primeira indicação da identidade dos carotenóides.

Para co-cromatografia foram utilizados padrões de b-caroteno e b-criptoxantina (Hoffmann-La Roche), e a-caroteno isolado de cenoura.

Todos os solventes utilizados, de grau cromatográfico, foram previamente filtrados à vácuo, com membrana para solvente orgânico de 0,45mm e, a seguir, desgaseificados em ultra-som. A água utilizada foi obtida pelo sistema de purificação e filtração Milli-Q (Millipore). Todas as amostras foram previamente filtradas em membrana de 0,45mm.

3 ¾ RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 ¾ Confirmação da identidade e incidência de a-criptoxantina

O espectro de absorção no visível, fornecido pelo DAD, da a-criptoxantina apresentou l_max (420, 445, 472nm) e estrutura fina similares aos do a-caroteno (Figura 2), fornecendo uma primeira identificação.

O espectro de massas da a-criptoxantina (Figura 3) mostrou o íon molecular a m/z 552 (0,4%) e o fragmento característico de eliminação de água a m/z 534 (0,7%), indicando a presença de uma hidroxila na molécula. A maior intensidade do pico de 534 unidades de massa em relação ao do íon molecular ([M] ⁺/[M-18] ⁺ de 0,59) indicou que a hidroxila se encontrava em posição alílica. BRITTON & YOUNG [6] também reportaram valor abaixo de 1,0 para a razão citada acima para a-criptoxantina isolada de tecidos fotossintéticos. Devido à baixa concentração deste carotenóide, os picos de eliminação de tolueno e xileno da cadeia poliênica não foram observados (Figura 3).

Todas as verduras folhosas analisadas neste estudo apresentaram a-criptoxantina ao invés de b-criptoxantina (Figura 4).

Esta é a primeira comprovação definitiva da presença de a-criptoxantina em plantas superiores. Até então, acreditava-se que o derivado monoidroxilado do a-caroteno era zeinoxantina em plantas superiores, e a-criptoxantina em alga vermelha [20].

3.2 Incidência de a-caroteno

Das 11 verduras folhosas verdes analisadas neste estudo, a-caroteno foi encontrado somente em 4 delas (caruru, couve, salsinha e taioba), como exemplificado na Figura 4.

Além do espectro obtido pelo DAD (Figura 2), foi realizada co-cromatografia com a-caroteno isolado de cenoura (Figura 5).

Dos inúmeros estudos encontrados na literatura sobre composição de carotenóides em folhas, verifica-se que, para a mesma folha, há diferentes relatos quanto à presença de a-caroteno, mesmo entre aqueles que empregaram o mesmo método de separação. A Tabela 1 apresenta esses trabalhos para quatro folhas, nos quais utilizou-se CLAE para a separação dos carotenóides. Dos sete estudos com espinafre, a-caroteno foi encontrado, em traços, apenas em um deles. Em couve e salsinha não foi detectado a-caroteno. Entretanto, em alface, a situação é dividida, já que três dos seis estudos apresentaram a-caroteno com teores variando de traços a 5,15mg/100g de amostra.

Como o a-caroteno esteve presente em pequenas quantidades, quando detectado, esta disparidade nos resultados pode ser explicada pelos diferentes níveis de detecção dos métodos e/ou pelo comprovado efeito das diferentes espécies e cultivares, do clima e do solo sobre o teor de carotenóides e presença dos minoritários em folhas [24]. Os resultados obtidos no presente trabalho indicam ser a segunda explicação a mais provável, uma vez que as condições analíticas empregadas foram as mesmas para as 11 folhas estudadas.

Por outro lado, ALMEIDA-MURADIAN et al [2] relataram a presença de altos teores de a-caroteno em folhas de cenoura, chegando a 29% do total de carotenos em uma das cultivares. Esta alta porcentagem de a-caroteno, nunca relatada anteriormente por outros autores, aproxima-se mais da porcentagem deste carotenóide na raiz. Os autores separaram a- e b-caroteno por CLAE em fase reversa, mas a quantificação destes dois carotenos foi executada após separação em coluna de MgO:hyflosupercel.

3.3 ¾ Incidência de cis isômeros de b-caroteno

Os carotenóides geralmente ocorrem na natureza na sua forma mais estável, que é a configuração trans. Os cis isômeros também podem existir naturalmente, em pequenas quantidades, e como possuem menor biopotência, a sua quantificação em separado vem sendo discutida.

No presente trabalho foi utilizado uma coluna C₁₈ polimérica (Vydac 201TP54) capaz de separar os isômeros cis de b-caroteno [8]. A identificação foi baseada nos espectros de absorção fornecidos pelo DAD (Figura 6), pois os isômeros cis apresentam l_max ligeiramente mais baixos e decréscimo no grau de estrutura fina do que a forma trans, aparecimento do pico cis na região ultravioleta e comparação da ordem de eluição na coluna com os trabalhos de BUSHWAY [8] e de GODOY & RODRIGUEZ-AMAYA [17] que utilizaram exatamente as mesmas condições cromatográficas empregadas neste estudo. Neste último trabalho [17] a identidade dos isômeros cis foi confirmada por co-cromatografia com padrões isolados por cromatografia em coluna aberta de hidróxido de cálcio, pois já havia sido demonstrado através de ressonância magnética nuclear de próton e carbono 13 a identidade dos isômeros de b-caroteno separados neste mesmo tipo de coluna [38].

Todas as verduras folhosas verdes analisadas no presente estudo apresentaram 9-cis- e 13-cis-b-caroteno (Figura 4), confirmando os registros da literatura [11, 12, 17, 33]. KHACHIK et al [22] relataram a presença de 15-cis-b-caroteno em quatro vegetais verdes, entretanto, estes mesmos autores reconheceram, mais tarde, que se tratava na verdade de uma mistura de 13-cis- e 15-cis-b-caroteno.

4 ¾ CONCLUSÕES

• A identidade do carotenóide monoidroxilado das verduras folhosas verdes foi confirmada inequivocadamente como sendo a-criptoxantina.

• Todas as onze verduras folhosas verdes analisadas apresentaram os seguintes carotenóides minoritários próvitamínicos A: a-criptoxantina, 9-cis e 13-cis-b-caroteno.

• Somente caruru, couve, salsinha e taioba apresentaram a-caroteno.

5 ¾ REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 ¾ AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o auxílio financeiro do MCT/FINEP/PRONEX.

² Professora do Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP, Caixa Postal 6121, Campinas, 13083-970. E-mail: [e-mail]

* A quem a correspondência deve ser enviada.

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¹

Recebido para publicação em 25/01/00. Aceito para publicação em 18/05/01.Parte da Tese de Doutorado da 1

^a

autora, realizada junto ao Curso de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da FEA/UNICAMP

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Abr 2002
• Data do Fascículo
  Ago 2001

Histórico

• Aceito
  18 Maio 2001
• Recebido
  25 Fev 2001