Alterações estruturais in vivo dos isômeros todo-trans, 9-cis e 13-cis do beta-caroteno

In-vivo structural alterations of the all-trans, 9-cis and 13-cis of beta-carotene isomers

Resumos

Com o objetivo de verificar alterações estruturais nos isômeros todo-trans, 9- e 13-cis do beta-caroteno foi realizado um ensaio biológico baseado no modelo de esgotamento das reservas hepáticas de carotenóides em ratos. Animais depletados desses carotenóides receberam, durante quinze dias, os isômeros puros todo-trans, 9-cis e 13-cis do beta-caroteno. Ao final deste período, verificou-se a ocorrência de re-isomerização in vivo desses isômeros, a partir da quantificação dos mesmos depositados no fígado dos animais. Foi observada re-isomerização do 9-cis em todo-trans, do todo-trans em 9-cis, do 13-cis em 9-cis e todo-trans. O 13-cis foi mais susceptível à isomerização que o 9-cis, pois este último passou a todo-trans e nunca a 13-cis. Já o 13-cis, tanto pode se transformar em 9-cis quanto em todo-trans.

re-isomerização; beta-caroteno; isômeros; carotenóides

A biological assay was conducted in order to verify the possible structural interconversion of the 9-cis, 13-cis and all-trans beta-carotene isomers. The different beta-carotene isomers (either all-trans b-carotene, 9-cis beta-carotene or 13-cis b-carotene) were administered for fifteen days to rats that had been previously depleted of liver carotenoids. It was possible to verify the in vivo re-isomerization of the isomers. The 9-cis beta-carotene isomer can be converted into all-trans beta-carotene, the latter re-isomerized into 9-cis beta-carotene, and the 13-cis beta-carotene modified into 9-cis beta-carotene and all-trans beta-carotene. From these results it can be concluded that the 13-cis isomer was more susceptible to isomerization than was the 9-cis beta-carotene, because the latter could be isomerized into all-trans, but not into 13-cis beta-carotene, while the 13-cis can be either modified to 9-cis or to all-trans beta-carotene.

beta-carotene; isomers; re-isomerization; carotenoids

Alterações estruturais in vivo dos isômeros todo-trans, 9-cis e 13-cis do b-caroteno

In-vivo structural alterations of the all-trans, 9-cis and 13-cis of b-carotene isomers

Maria Aparecida Lopes da Costa^I; Claudia Isabel Ortega-Flores^I; Marilene de Vuono Camargo PenteadoII, ¹

^ICurso de Pós-Graduação em Ciências dos Alimentos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP-SP

^IIFaculdade de Ciências Farmacêuticas – USP-SP Depto. de Alimentos e Nutrição Expereimental. Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bl. 14. Cidade Universitária. CEP 05508-900. SãoPaulo. SP. E-mail: [e-mail]

RESUMO

Com o objetivo de verificar alterações estruturais nos isômeros todo-trans, 9- e 13-cis do b-caroteno foi realizado um ensaio biológico baseado no modelo de esgotamento das reservas hepáticas de carotenóides em ratos. Animais depletados desses carotenóides receberam, durante quinze dias, os isômeros puros todo-trans, 9-cis e 13-cis do b-caroteno. Ao final deste período, verificou-se a ocorrência de re-isomerização in vivo desses isômeros, a partir da quantificação dos mesmos depositados no fígado dos animais. Foi observada re-isomerização do 9-cis em todo-trans, do todo-trans em 9-cis, do 13-cis em 9-cis e todo-trans. O 13-cis foi mais susceptível à isomerização que o 9-cis, pois este último passou a todo-trans e nunca a 13-cis. Já o 13-cis, tanto pode se transformar em 9-cis quanto em todo-trans.

Palavras-chave: re-isomerização; b-caroteno; isômeros; carotenóides.

SUMMARY

A biological assay was conducted in order to verify the possible structural interconversion of the 9-cis, 13-cis and all-trans b-carotene isomers. The different b-carotene isomers (either all-trans b-carotene, 9-cis b-carotene or 13-cis b-carotene) were administered for fifteen days to rats that had been previously depleted of liver carotenoids. It was possible to verify the in vivo re-isomerization of the isomers. The 9-cis b-carotene isomer can be converted into all-trans b-carotene, the latter re-isomerized into 9-cis b-carotene, and the 13-cis b-carotene modified into 9-cis b-carotene and all-trans b-carotene. From these results it can be concluded that the 13-cis isomer was more susceptible to isomerization than was the 9-cis b-carotene, because the latter could be isomerized into all-trans, but not into 13-cis b-carotene, while the 13-cis can be either modified to 9-cis or to all-trans b-carotene.

Keywords: b-carotene; isomers; re-isomerization; carotenoids.

1 – INTRODUÇÃO

O b-caroteno existe naturalmente na configuração termodinamicamente mais estável e menos solúvel, a forma todo-trans. Contudo, a ocorrência natural de isômeros cis tem sido relatada com uma certa freqüência. Teoricamente, existiriam 272 possíveis isômeros do b-caroteno, porém, apenas 12 têm sido detectados [2].

SWEENEY e MARSH [26], trabalhando com hortaliças conseguiram separar o isômero todo-trans bem como seis isômeros cis do b-caroteno, a saber: neo b-caroteno U, neo b-caroteno V, neo b-caroteno B, neo b-caroteno C, neo b-caroteno D e neo b-caroteno E. Em muitas frutas e hortaliças, os únicos isômeros do b-caroteno presentes são o todo-trans, o neo b-caroteno U (9-cis) e o neo b-caroteno B (13-cis), sendo os dois primeiros os mais comumente encontrados [5, 8, 9, 17].

A isomerização cis-trans pode ocorrer durante o processamento e estocagem do alimento [7]. Devido ao seu sistema conjugado de duplas ligações, os carotenóides são estruturas altamente instáveis. O calor, a luz, os ácidos, o oxigênio e enzimas como lipoxigenase levam a alterações ou parcial destruição dos pigmentos. A exposição destes a tais agentes, resulta na formação de isômeros cis, epóxidos, diminuição da cor, perda da atividade pró-vitamínica A e quebra da cadeia [21].

Tendo em vista que a absorção dos lipídeos ocorre em função da formação das micelas, a solubilização dos carotenóides nas micelas lipídicas do intestino é um pré-requisito para a absorção desses pigmentos. A composição isomérica do b-caroteno afeta a quantidade de carotenóide incorporado às micelas lipídicas. O isômero 9-cis do b-caroteno parece aumentar a incorporação do isômero todo-trans às micelas lipídicas do intestino de ratos [13].

GAZIANO et al. [10], estudaram a absorção e a incorporação dos isômeros 9-cis e todo-trans do b-caroteno nas lipoproteínas no plasma de humanos, e observaram que existe uma preferencial absorção e transporte do todo-trans em comparação com o 9-cis.

STAHL et al. [22], detectaram o isômero 9-cis no soro de humanos, porém, em quantidades traço. O isômero 9-cis do b-caroteno é absorvido, imediatamente transferido e acumulado em tecidos, não sendo por isto encontrado no soro [23, 24].

Outros possíveis mecanismos podem explicar a ausência do isômero 9-cis no plasma, como por exemplo: a ineficiente captação intestinal do isômero 9-cis em contraste com o todo-trans; a rápida degradação do 9-cis no trato-gastrointestinal; a rápida remoção desse isômero do plasma; a rápida conversão deste isômero em vitamina A; ou a rápida transisomerização do 9-cis em todo-trans [28].

Nos estudos realizados por LEVIN, BEN-AMOTZ e MOKADY [14] e BEN-AMOTZ et al. [4], animais acumulam os isômeros do b-caroteno diferentemente. Para estes autores, ratos acumulam preferencialmente o isômero todo-trans, enquanto que os galináceos acumulam o 9-cis b-caroteno. A presença deste último na dieta, permite um maior acúmulo do todo-trans nos tecidos dos ratos. Tais fatos devem acontecer em função das propriedades físico-químicas dos isômeros cis diferirem das do isômero todo-trans, particularmente aquelas relacionadas com solubilidade e cristalização [6].

Outras diferenças existentes entre os isômeros cis e todo-trans estão relacionadas com as outras funções desempenhadas pelos carotenóides, como por exemplo, a atuação como antioxidantes, uma vez que aparentemente o isômero 9-cis seria um antioxidante mais eficiente que o todo-trans [3].

Tendo em vista o acima exposto o objetivo desse trabalho foi verificar a ocorrência de re-isomerização dos isômeros todo-trans, 9 e 13-cis do b-caroteno, in vivo.

2 – MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Delineamento experimental

No ensaio biológico, foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus, var. Albinos Rodentia mammalia), provenientes da colônia do Biotério da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

Inicialmente, os animais foram depletados de carotenóides, conforme descrito a seguir. Durante 22 dias quinze ratas adultas amamentaram de oito a dez filhotes, sendo que destes, em média 8 eram machos e os demais fêmeas. As mães receberam ração à base de caseína deficiente em carotenóides. Ao final deste período, os filhotes foram separados das mães, pesados e agrupados em quatro grupos com sete animais em cada grupo.

Para assegurar a eficácia da depleção, todos os animais de cada grupo foram alojados em gaiolas individuais com bebedouro de plástico ou vidro e permaneceram durante dezessete dias recebendo a mesma dieta sem carotenóides. Esta fase correspondeu ao período de esgotamento das reservas hepáticas de carotenóides.

Ao término deste período, um grupo de animais foi sacrificado e os fígados e sangue recolhidos para posterior análise. Este grupo foi denominado Grupo Um.

A partir deste momento, durante 15 dias os animais passaram a receber, por entubação gástrica a cada dois dias, os isômeros todo-trans, 9-cis e 13-cis do b-caroteno dissolvidos em 0,5mL de óleo de milho. Os grupos formados foram denominados de grupo b-caroteno todo-trans, 9-cis e 13-cis, respectivamente.

Os animais receberam 45mg/dia de b-caroteno todo-trans, 82mg/dia de isômero 9-cis do b-caroteno e 68mg/dia de isômero 13-cis do b-caroteno para os grupos b-caroteno todo-trans, 9-cis e 13-cis, respectivamente. Tais teores foram calculados de modo a suprir as necessidades recomendadas por REEVES et al. [19] para cada dois dias. No caso dos isômeros cis, os cálculos foram feitos levando-se em consideração as biopotências obtidas por SWEENEY e MARSH [25].

Ao final deste período todos os animais foram sacrificados e os fígados recolhidos para análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).

Durante todo experimento os animais receberam ad libitum água e ração sem carotenóides.

2.2 – Obtenção dos carotenóides fornecidos aos animais

Os isômeros de b-caroteno fornecidos aos animais foram extraídos de folhas de couve-flor (Brassica oleracea L.) no Laboratório de Análise de Alimentos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

Os procedimentos de extração e separação dos isômeros do b-caroteno foram feitos de acordo com o método de RODRIGUEZ et al. [20], com algumas modificações conforme descrito em COSTA e PENTEADO [9].

2.3 – Colheita e extração das amostras

Para se proceder a retirada do fígado, os animais foram anestesiados por inalação de éter etílico p. a. Os fígados foram retirados, lavados em solução salina 0,9% (p/v) resfriada, secos em papel de filtro, pesados, subdivididos em pedaços de até 3g, embalados em papel alumínio, congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -70°C até a análise.

2.4 – Análise de retinol, b-caroteno e isômeros no material biológico

Os procedimentos de saponificação e extração dos isômeros do b-caroteno presentes nos fígados foram baseados no trabalho de AL-ABDULALY e SIMPSON [1]. Tais procedimentos estão descritos resumidamente a seguir:

Em torno de 2 gramas de fígado foram pesados em tubo de ensaio e homogeneizados utilizando-se um triturador tipo Turrax, usando-se o mínimo possível de água. Em seguida, adicionou-se cerca de 30mL de KOH metanólico 30% (p/v). A mistura permaneceu durante uma noite, no escuro, sob nitrogênio e à temperatura ambiente.

Ao final desse período, a mistura foi transferida para um erlenmeyer contendo 50mL de éter etílico e agitado mecanicamente durante 15 minutos. Após este tempo, a mistura foi transferida para um funil de separação e a fase metanólica foi descartada. O álcali residual presente na fase etérea foi removido através de sucessivas lavagens com água destilada. Posteriormente, a solução foi transferida para erlenmeyer e a água remanescente foi retirada com a adição de sulfato de sódio anidro. O éter etílico contendo o b-caroteno extraído foi então transferido para um balão e evaporado em rota-evaporador, a vácuo.

Após a secura, o balão foi lavado com 2mL de éter etílico e a solução transferida para um tubo de ensaio. O éter etílico foi evaporado por nitrogênio e ao resíduo adicionou-se de 0,3 a 0,5mL de metanol, para determinação de b-caroteno e isômeros. Antes da injeção no CLAE as amostras foram filtradas com membrana de 0,45mm.

2.5 – Condições cromatográficas para análise dos isômeros de b-caroteno

O b-caroteno presente nos fígados foi determinado através de cromatografia líquida de fase reversa. A coluna de separação era C₁₈, contendo partículas de 5mm, com 4,6mm de diâmetro interno e 25cm de comprimento, marca Vydac 201 TP 54. A fase móvel era uma mistura de metanol:acetonitrila:água (88:9:3 v/v/v). O detector era UV/visível e o comprimento de onda máximo na quantificação dos isômeros era de 452nm. O fluxo das injeções da fase móvel foi de 2,0mL/min. e o volume de injeção foi de 20mL fixado pelo looping.

2.6 – Identificação e quantificação dos isômeros do b-caroteno

Os compostos foram identificados através da comparação entre os tempos de retenção dos seus picos e os tempos de retenção dos picos dos padrões correspondentes e dos seus espectros cromatográficos. A quantificação foi feita utilizando-se as respectivas curvas de calibração.

2.7 – Análise estatística

As análises dos resultados obtidos durante a fase de testes foram feitas utilizando-se o teste de Kruskall-Wallis, que equivale a ANOVA (One-Way Analysis of Variance) não paramétrica. Este é o teste indicado para se verificar a homogeneidade dos grupos em que o n<30, através da análise múltipla das variáveis.

Quando se verificava diferença estatisticamente significativa foi aplicado o teste de Mann-Whitney (não paramétrico). Todas as análises foram realizadas com nível de significância de 5% (p<0,05) [11].

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para se determinar os teores de retinol e b-caroteno hepático, foi analisado, sempre que possível apenas o lóbulo direito do animal. Este tipo de cuidado foi tomado para se evitar a análise de amostras muito heterogêneas. OLSON [16], encontrou uma distribuição não homogênea de retinol no fígado.

Na Tabela 1 estão as contribuições dos isômeros todo-trans, 9 e 13-cis no teor total de b-caroteno de fígado.

O isômero todo-trans foi o predominante nas amostras de fígado dos grupos que receberam b-caroteno como fonte de vitamina A. É interessante observar o aparecimento do isômero 9-cis, mesmo que em pequena porcentagem (4,1%), nos fígados de animais que haviam recebido apenas o isômero todo-trans, indicando claramente que houve uma isomerização do todo-trans em 9-cis. O inverso, ou seja, a re-isomerização do 9-cis em todo-trans, ocorreu em maior proporção, pois foi considerável a porcentagem de todo-trans (65,2% ) no fígado do grupo que recebeu apenas o 9-cis.

Tem sido levantada a possibilidade do isômero 9-cis primeiramente passar a todo-trans, e este ser posteriormente convertido em retinol, ao invés da conversão direta do isômero cis em retinol [12, 18].

YOU et al. [26], para estudarem a absorção e metabolismo do 9-cis b-caroteno, forneceram para 3 indivíduos 1,0mg de b-caroteno, com a seguinte proporção, 99,4% de 9-cis e 0,6% de todo-trans. Os resultados obtidos sugeriram que ocorreu uma transisomerização do 9-cis em todo-trans.

YOU et al. [29], estudaram o metabolismo de isômero 9-cis marcado com carbono 13 em humanos, e encontraram dados que sugerem que este isômero pode facilitar a absorção do todo-trans ou ser parcialmente isomerizado formando este último, porém, não pode ser extensivamente absorvido nem diretamente metabolizado em 9-cis retinol.

TAMAI et al. [27], acreditam que o isômero 9-cis do b-caroteno não é absorvido diretamente através do intestino, porém pode ser encontrado nas células. A explicação para isso seria a isomerização do todo-trans em 9-cis, que ocorreria durante e após a absorção. Porém, como pode-se constatar neste trabalho, esse isômero pode ser absorvido através do intestino, a menos que ele tenha sido re-isomerizado no trato-gastrointestinal antes de ser absorvido, e depois voltado à forma de 9-cis.

Nos fígados do grupo que recebeu 13-cis foi encontrada a mistura dos três isômeros, sendo que a porcentagem do isômero 9-cis encontrada foi maior que a do próprio 13-cis, indicando que houve re-isomerização.

Duas hipóteses são sugeridas: na primeira hipótese, o 13-cis b-caroteno sofreria isomerização, formando todo-trans e 9-cis, concomitantemente. Na segunda hipótese, o 13-cis b-caroteno passaria a todo-trans e este por sua vez se isomerizaria em 9-cis b-caroteno.

Acredita-se que a primeira hipótese é a mais viável, pois, parece que são necessários mais passos para que a segunda hipótese aconteça. Além disso, a porcentagem de 9-cis b-caroteno formada oriunda do 13-cis é alta (Tabela 1). Se a segunda hipótese ocorresse, encontrar-se-ia uma menor porcentagem de 9-cis no grupo que recebeu 13-cis. De acordo com os resultados obtidos com o grupo que recebeu 100% de todo-trans, menos de 5% do todo-trans se converteu em 9-cis. Assim, parece pouco provável que o 13-cis b-caroteno passe a todo-trans e que este passe a 9-cis. Entretanto, as duas hipóteses podem ocorrer ao mesmo tempo.

NAGAO e OLSON [15], também observaram após a administração dos isômeros cis do b-caroteno a ratos a formação de diferentes isômeros de retinaldeído. Quando a fonte era o isômero b-caroteno todo-trans, 72% do retinaldeído formado era todo-trans, 25% era 13-cis e 3% era 9-cis. Quando era fornecido o isômero 9-cis b-caroteno, 64% do retinaldeído formado era todo-trans e 22% era 9-cis e não apareceu o 13-cis retinaldeído. Quando a fonte era o 13-cis b-caroteno, as proporções eram de 74%, 18% e 7% de todo-trans, 13-cis e 9-cis retinaldeído, respectivamente. Para estes autores, o caminho de conversão do isômero 9-cis do b-caroteno em 9-cis e todo-trans retinaldeído é direto. Sobre a conversão do 13-cis, estes autores sugerem dois caminhos: 1) 13-cis b-caroteno passa a 13-cis retinaldeído que por sua vez passa a retinaldeído todo-trans, e 2) 13-cis b-caroteno passa a b-caroteno todo-trans que passa a todo-trans retinaldeído que passa a 13-cis retinaldeído. Como a proporção de 13-cis retinaldeído formado a partir do b-caroteno todo-trans era maior do que a partir do 13-cis b-caroteno, os autores acreditam o segundo caminho é o mais conveniente.

Aparentemente, o isômero 13-cis é mais susceptível à isomerização que o 9-cis, pois nos fígados dos grupos que receberam 9-cis puro, não foi detectado o 13-cis, e nos grupos que receberam 13-cis foi detectado o isômero 9-cis.

A metodologia empregada nesse estudo não permitiu verificar em qual fase do metabolismo ocorreu isomerização nem se a absorção do b-caroteno foi influenciada pelas formas cis da molécula, porém parece que tal fato ocorreu em algum momento.

Conforme observado anteriormente, a isomerização aconteceu de modo mais acentuado nos grupos que receberam o isômero 13-cis.

4 – CONCLUSÕES

Os resultados obtidos no presente trabalho permitem concluir que o isômero todo-trans do b-caroteno foi a principal forma isomérica encontrada no fígado de ratos que receberam carotenóides como fonte de vitamina A. Ocorreu re-isomerização do 9-cis em todo-trans, do todo-trans em 9-cis, do 13-cis em 9-cis e todo-trans. O 13-cis b-caroteno é mais susceptível à isomerização que o 9-cis b-caroteno, pois este último passa a todo-trans e nunca a 13-cis, já o 13-cis tanto pode se transformar em 9-cis quanto em todo-trans.

Os isômeros b-caroteno todo-trans, 9-cis e 13-cis, administrados por via intragástrica, sofrem alterações estruturais durante o seu metabolismo.

5 – AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES pelo suporte financeiro.

6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS²

Recebido para publicação em 19/06/2000. Aceito para publicação em 08/03/2002.

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• [29] YOU, C.-S., PARKER, R. S., GOODMAN, K., BRENNA, J. T., CANFIELD, W. Metabolism of [¹³C] 9-cis-b-carotene in humans. FASEB J., Bethesda, v. 8, n. 4, p. A422, 1994.

1

A quem a correspondência deve ser enviada.

2

De acordo com a norma NBR 6023/89 preconizada pela ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS (ABNT). As abreviaturas dos títulos dos periódicos seguem o CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE SOURCE INDEX (CASSI) 1996.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Mar 2004
• Data do Fascículo
  Dez 2002

Histórico

• Recebido
  19 Jun 2000
• Aceito
  08 Mar 2002