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Food Science and Technology (Campinas)

versão On-line ISSN 1678-457X

Ciênc. Tecnol. Aliment. v.23 n.2 Campinas maio/ago. 2003

http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20612003000200016 

Caracterização preliminar de bacteriocinas produzidas por seis cepas de bactérias láticas isoladas de produtos cárneos embalados a vácuo

 

Preliminary characterization of bacteriocins produced by six lactic acid bacteria strains isolated from vacuum-packaged meat products

 

 

Elaine C. P. de Martinis*; Priscila R. Santarosa; Flávia Z. Freitas

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo. Av. do Café s/n, CEP 14040-90, Ribeirão Preto, SP, Brasil. Fone: 55166024267. Fax: 5516 6331936. E-mail: edemart@fcfrp.usp.br

 

 


RESUMO

No presente trabalho, foram estudadas as bacteriocinas produzidas por seis linhagens bacterianas: duas culturas Lactobacillus sake, duas de Lactobacillus curvatus, uma de Leuconostoc mesenteroides, uma de Leuconostoc sp 12. As atividades inibitórias foram quantificadas pelo método da diluição crítica, utilizando-se os indicadores Lactobacillus sake ATCC 15521 e Listeria monocytogenes. As bacteriocinas produzidas foram caracterizadas também quanto à sensibilidade a enzimas, faixa de temperatura na produção, termoestabilidade, estabilidade em diferentes pHs e modo de ação (bactericida ou bacteriostático) frente a Listeria monocytogenes. Nenhuma bacteriocina foi destruída pela pepsina, mas todas foram sensíveis à proteinase K, tripsina e a-amilase (exceto a bacteriocina produzida por Leuconostoc sp 12, que foi insensível a a-amilase). Lactobacillus sake 1, Leuconostoc mesenteroides 11 e Lactobacillus sake 16 apresentaram atividade antilisterial, sendo a maior inibição observada para Lactobacillus sake 1 e Leuconostoc mesenteroides 11 (12.800UA/mL). Lactobacillus sake 1 e Lactobacillus curvatus 5 produziram as bacteriocinas mais termoestáveis. Lactobacillus sake 1 produziu a bacteriocina com maior estabilidade a variações de pH. Todas as bactérias láticas produziram bacteriocina entre 4ºC e 30ºC, sendo esta propriedade muito interessante para futuras aplicações em produtos cárneos refrigerados.

Palavras-chave: bacteriocinas; bactérias láticas; caracterização; Listeria monocytogenes.


SUMMARY

In this work, the bacteriocins produced by six bacterial strains were studied (Lactobacillus sake 1, Lactobacillus curvatus 5, Leuconostoc mesenteroides 11, Leuconostoc sp 12, Lactobacillus curvatus 14 and Lactobacillus sake 16). Title of inhibitory activity was determined by critical dilution assay, using Lactobacillus sake ATCC 15521 and Listeria monocytogenes as indicator microorganisms. The inhibitory compounds were also characterized with respect to stability to the action of enzymes, thermostability, stability in several pHs and mode of action (bactericide or bacteriostatic) towards Listeria monocytogenes. No bacteriocin was destroyed by pepsin, but all of them were destroyed by proteinase K, trypsin and a-amylase (except that a-amylase did not inactivate the bacteriocin produced by Leuconostoc sp 12). Lactobacillus sake 1, Leuconostoc mesenteroides 11 and Lactobacillus sake 16 exerted antilisterial activity. The more active strains against Listeria monocytogenes were Lactobacillus sake 1 and Leuconostoc mesenteroides 11 (12.800 AU/ml). Bacteriocins produced by Lactobacillus sake 1 and Lactobacillus curvatus 5 presented the highest thermal stability. The bacteriocin of Lactobacillus sake 1 was the most stable to pH variations. All LAB produced bacteriocin in the range of temperature from 4ºC to 30ºC and this property is of great interest for future applications in refrigerated meat products.

Keywords: bacteriocins; lactic acid bacteria; characterization; Listeria monocytogenes.


 

 

1 - INTRODUÇÃO

As bactérias láticas (LAB) despertam interesse devido ao seu potencial de utilização no biocontrole em alimentos. Elas podem exercer atividade inibitória frente a outras bactérias devido à competição direta por nutrientes e pela produção de compostos antagonísticos como ácidos orgânicos, diacetil, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas [3, 4, 10, 21].

Até o momento, a nisina é a única bacteriocina permitida para uso em cerca de 50 países [5], incluindo o Brasil onde ela é aprovada para uso em todos os tipos de queijos, e também aplicada na superfície externa de salsichas de diferentes tipos [1, 2, 16].

Entretanto, seu uso em carnes pode ser limitado por interações com esse tipo de alimento [8, 25], e até inativação pela enzima glutationa S-transferase de músculo bovino [23].

Neste trabalho, foram caracterizadas algumas propriedades de bacteriocinas de bactérias láticas.

 

2 - MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 - Linhagens bacterianas

Foram estudadas seis linhagens de bactérias láticas isoladas a partir de produtos cárneos brasileiros [7]. A origem e a identificação das referidas cepas estão mostradas na Tabela 1.

 

 

As culturas de bactérias láticas bacteriocinogênicas foram mantidas como culturas-estoque a -70ºC em caldo De Man Rogosa Sharpe (MRS) adicionado de 20% de glicerol.

Foi utilizada uma linhagem de Listeria monocytogenes isolada de peito de frango.

2.2 - Perfil de sensibilidade a enzimas

Para esta determinação, as bactérias láticas foram cultivadas em caldo MRS a 25ºC por 24 horas e avaliadas conforme LEWUS, KAISER, MONTVILLE [17], empregando-se soluções enzimáticas esterilizadas numa concentração de 10mg/mL. Foram utilizadas as enzimas pepsina A (Sigma, de mucosa de estômago suíno), proteinase K (Sigma, de Tritirachium album), tripsina (Sigma, de pâncreas bovino) e a-amilase (Sigma, tipo XII-A de Bacillus licheniformis).

2.3 - Quantificação da atividade bacteriocinogênica

A quantificação da atividade bacteriocinogênica foi realizada pelo ensaio da diluição crítica, conforme preconizado por MAYR-HARTING, HEDGES, BERKELEY [20]. Foi utilizado o sobrenadante das bactérias após desenvolvimento em caldo MRS (0,5 e 2,0% de glicose) a 25ºC por 24 horas, utilizando como microrganismos indicadores Lactobacillus sake ATCC 15521 e Listeria monocytogenes.

2.4 - Determinação do efeito da temperatura de incubação na produção de bacteriocinas

A avaliação da temperatura de produção de bacteriocinas foi realizada com modificações da técnica "spot-on-the-lawn" descrita por LEWUS, KAISER, MONTVILLE [17]. As culturas estoques das bactérias láticas foram inoculadas em caldo MRS a 30°C por 24 horas. Dois microlitros das culturas foram depositados na superfície de placas de Ágar Soja Tripticase adicionado de 0,6% de extrato de levedura (Oxoid) e as placas foram mantidas a 4, 10, 15 e 30°C por quatro dias sob anaerobiose. Decorrido o período de incubação, as placas foram recobertas com 8mL de caldo BHI (infusão de cérebro-coração, Oxoid) contendo 1% de ágar bacteriológico (Oxoid), inoculado com 105-106 células de Lactobacillus sake ATCC 15521. As placas foram reincubadas a 30°C por 18 a 24 horas, em anaerobiose. O raio de cada halo de inibição foi medido (em mm) a partir da borda da cultura produtora até a borda do halo.

2.5 - Estabilidade térmica

As culturas foram reativadas em caldo MRS a 30°C e foram centrifugadas a 7.500rpm por 15 minutos, a 4°C, em centrífuga refrigerada (marca Beckman, modelo Avanti J-25). O sobrenadante de cada cultura foi neutralizado com NaOH 10 N e esterilizado por filtração em membrana com poros de 0,22mm com baixa capacidade de ligação de proteínas (GVWP Durapore, Millipore). Os tubos de ensaio foram aquecidos a 60°C por 0, 10, 15, 30 e 60 minutos e a 100°C por 0, 5, 10, 15 e 20 minutos. Decorridos os tempos selecionados, os tubos foram imediatamente mergulhados em banho de gelo. A quantificação da atividade bacteriocinogênica nos sobrenadantes assim preparados foi realizada pelo ensaio da diluição crítica, conforme preconizado por MAYR-HARTING, HEDGES, BERKELEY [20], utilizando Lactobacillus sake ATCC 15521 como microrganismo indicador.

2.6 - Estabilidade em diferentes pHs

O pH de sobrenadantes obtidos a partir das bactérias láticas cultivadas em caldo MRS a 25ºC por 24 horas foram ajustados para pH 2,0, 4,0, 8,0 e 10,0 utilizando-se HCl 10 N ou NaOH 10 N e esterilizados por filtração em membrana com poros de 0,22mm com baixa capacidade de ligação de proteínas (GVWP Durapore, Millipore). Os sobrenadantes esterilizados foram mantidos a 10ºC por 24 horas e foi determinado o título da preparação em Unidades Arbitrárias por mL, segundo MAYR-HARTING, HEDGES, BERKELEY [20], empregando-se Lactobacillus sake ATCC 15521 como indicador.

2.7 - Determinação da atividade bactericidida ou bacteriostática frente a L. monocytogenes

Neste ensaio, foram utilizadas apenas as bactérias láticas com atividade antilisterial reconhecida de acordo com trabalho anterior [7]: Lactobacillus sake 1 e 16; Leuconostoc mesenteroides 11. Foi utilizada a técnica de difusão em poços, de acordo com HARRIS et al [9], com modificações. As culturas foram reativadas em caldo MRS a 25°C por 24 horas. Este caldo foi centrifugado, neutralizado e esterilizado por filtração em membrana (0,22mm, GVWP Durapore, Millipore) para quantificação da atividade bactericida ou bacteriostática segundo LEWUS, KAISER, MONTVILLE [17]. A observação de halos inalterados após a destruição das bacteriocinas pela a-quimiotripsina, seria indicativa de ação bactericida. A reversão da inibição devido à ação da enzima indicaria modo de ação bacteriostático.

 

3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para as LABs 5 e 14, a adição de glicose a 2% influenciou positivamente a produção de bacteriocinas quando comparada ao caldo MRS contendo 0,5% de glicose. No entanto, as demais cepas demonstraram a mesma atividade para ambos os níveis de glicose testados (Figura 1). RIËTTE et al [22], postularam que a influência positiva do teor de glicose na produção de bacteriocinas pode ser devido à ocorrência de um maior aumento da massa celular e a produção de bacteriocinas ocorrer na fase logarítmica do crescimento das culturas.

 

 

Quando Lactobacillus sake ATCC 15521 foi utilizado como indicador, a maior atividade foi observada para Lactobacillus curvatus 5 e 14, com atividade da ordem de 3.200UA/mL (Figura 1).

Os resultados dos ensaios de diluição crítica mostrados na Figura 1 também revelaram que a atividade de L. sake 1, Leuconostoc mesenteroides 11 e L. sake 16 era maior frente a L. monocytogenes do que frente a L. sake ATCC 15521. As cepas Lactobacillus sake 1 e Leuconostoc mesenteroides 11 apresentaram um título de 12.800 UA/mL (Figura 1). Essa diferença de sensibilidade para algumas bactérias láticas e L. monocytogenes também foi observada por MATHIEU et al [19], quando analisaram o espectro de inibição de Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides FR 52.

Os resultados da Tabela 2 referem-se à sensibilidade dos inibidores produzidos frente a enzimas. Segundo LEWUS, SUN, MONTVILLE [18], o estudo da sensibilidade a enzimas, pode fornecer noções sobre a estrutura da molécula de bacteriocina. Em nosso trabalho, verificamos que os inibidores produzidos pelas seis cepas de bactérias láticas foram sensíveis a proteinase K, a tripsina e a a-amilase, com exceção do inibidor produzido por Leuconostoc sp 12, que foi insensível a a-amilase. Para nenhum dos inibidores, entretanto, foi observada sensibilidade frente à pepsina.

 

 

Segundo KEPPLER, GEISEN, HOLZAPFEL [14] a sensibilidade à a-amilase, indica a presença de molécula(s) de carboidrato(s) na estrutura da bacteriocina e, esses autores sugeriram que a fração glicídica seria importante para a atividade da mesma.

No trabalho de RIËTTE et al [22] sobre a cepa Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides FR 52, foi sugerida uma possível contaminação da a-amilase por proteases, pois foram testadas preparações enzimáticas de dois fornecedores diferentes (Fluka e Sigma), fornecendo resultados discordantes. Estes autores [22] relataram que a amilase da Fluka estava contaminada por proteases. Porém KEPPLER, GEISEN, HOLZAPFEL [14] fizeram ensaios com a bacteriocina de Leuconostoc carnosum LA54A que comprovaram que a degradação da mesma não foi devido à presença de proteases contaminantes, e sim, devido à sensibilidade frente a a-amilase. Em nosso trabalho, não achamos provável a hipótese de contaminação da amilase por proteases, uma vez que a enzima que utilizamos é de alta qualidade (Sigma), e também pelo fato de um dos inibidores produzidos (Leuconostoc sp. 12) ter se mostrado insensível à amilase utilizada. Entretanto, a purificação e determinação da estrutura primária das bacteriocinas serão necessárias para confirmar esta hipótese.

SCHILLINGER, BECKER, HOLZAPFEL [24], afirmaram que a carnosina 54, estudada por eles, era diferente das bacteriocinas produzidas pela maioria das cepas de Leuconostoc devido à sensibilidade à amilase. Lewus, SUN, MONTVILLE [18], também observaram a sensibilidade frente à a-amilase da bacteriocina de uma cepa de Leuconostoc paramesenteroides OX, e concluíram que era de natureza glicoprotéica, sendo ambas estruturas importantes para a atividade bacteriocinogênica.

JIMENEZ-DIAZ et al [13] observaram também a sensibilidade da bacteriocina produzida por Lactobacillus plantarum LPCO10 a enzimas glicolíticas, sugerindo tratar-se de uma bacteriocina glicoprotéica.

Todas as bacteriocinas das LABs avaliadas em nosso trabalho foram insensíveis à pepsina. Esta propriedade foi também relatada para mesentericina Y105 [11] e para a bacteriocina produzida por Leuconostoc carnosum LA44A [22]. Entretanto, em pH 3, MATHIEU et al [19] relataram que a mesenterocina 52 foi destruída pela pepsina.

Os resultados do ensaio da diluição crítica para a avaliação da estabilidade térmica das bacteriocinas a 60°C e 100°C, estão apresentados na Tabela 3.

 

 

As bacteriocinas produzidas por L. sake 1 e L. curvatus 5 permaneceram estáveis em todos os tempos e temperaturas estudados (60°C por até 60 minutos e a 100°C por até 20 minutos). A bacteriocina produzida pela cepa 11, teve sua atividade reduzida à metade após 10 minutos a 60°C, e manteve esta atividade por até 15 minutos a 60°C. Após 30 minutos a 60ºC, sua atividade foi totalmente perdida. A 100°C, a atividade foi reduzida em 50% após 5 minutos, mas manteve o mesmo título por até 20 minutos. A 60°C, a bacteriocina produzida pela cepa 12 foi estável apenas até 15 minutos. A 100°C, esse composto foi estável por 15 minutos, sendo estável apenas parcialmente quando aquecido por 20 minutos nesta mesma temperatura (retenção de 50% da atividade). A cepa 14 teve sua bacteriocina estável por 10 minutos a 60°C e a 100°C. Após 15 minutos (60°C e 100°C), sua atividade foi reduzida em 50%, mantendo o mesmo título por 60 minutos a 60°C e por 20 minutos a 100°C. A bacteriocina produzida pela cepa 16, manteve sua estabilidade por 60 minutos a 60°C e por 15 minutos a 100°C. Após 20 minutos a 100°C, diminuiu pela metade sua atividade.

Confrontando os resultados da estabilidade térmica obtidos neste estudo com a proposta de classificação apresentada no trabalho de KLAENHAMMER [15], as bacteriocinas produzidas pelas cepas L. sake 1 e L. curvatus 5 devem pertencer à classe II (peptídeos termoestáveis). As bacteriocinas de L. mesenteroides 11 e Leuconostoc sp. 12 são proteínas termolábeis, pertencendo provavelmente às classes III ou IV (proteínas complexas). As bacteriocinas das cepas L. curvatus 14 e L. sake 16 apresentaram estabilidade térmica moderada, mantendo 50% de suas atividades mesmo após aquecimento a 100ºC por 20 minutos, podendo também pertencer à classe II de Klaenhammer [15].

O modo de ação das substâncias antagonísticas produzidas por L. sake 1, Leuconostoc mesenteroides 11 e L. sake 16, analisado pela técnica de difusão em poços, permitiu verificar que a inibição de L. monocytogenes não foi revertida após a destruição do inibidor pela ação a-quimiotripsina. Isso evidenciou que as bacteriocinas produzidas pelas bactérias láticas destruíram as células do microrganismo alvo e não apenas inibiram sua multiplicação. Sendo assim, de acordo com DE MARTINIS e FRANCO [6], podemos afirmar que as bacteriocinas produzidas pelas cepas 1, 11 e 16 tiveram ação bactericida.

De acordo com a Tabela 4, em pH 4, todas as bacteriocinas foram estáveis a 10ºC por 24 horas, sendo que Lactobacillus sake 1 produziu a bacteriocina com maior estabilidade a variações de pH, não perdendo atividade quando armazenada a 10ºC na faixa de pH de 2 a 10 por 24 horas.

 

 

O efeito da temperatura de incubação na produção de bacteriocinas estão representados na Tabela 5.

 

 

A maior produção de bacteriocina para a cepa 1 (L. sake) ocorreu em baixas temperaturas, sendo o maior halo observado a 4°C (5,5mm). Para as cepas 5 e 14 (ambas, L. curvatus), as temperaturas intermediárias favoreceram a produção de bacteriocinas, sendo os maiores halos observados a 15°C (9,5mm e 8,0mm, respectivamente). Com as cepas 11 (L. mesenteroides) e 12 (Leuconostoc sp.), foi observada uma tendência de aumento da atividade bactericionogênica com o aumento da temperatura. Para a cepa 16 (L. sake), a produção de bacteriocina foi maior em temperaturas mais baixas e em temperatura intermediária (4ºC e 15ºC).

Segundo HUGAS [12] para a utilização de bactérias láticas bacteriocinogênicas em processos de bioconservação, por meio da adição da cultura produtora viável, é essencial que elas sejam capazes de competir com a microbiota natural. Em nosso trabalho, observamos que todas as cepas bacteriocinogênicas, apresentaram atividade na faixa de temperatura de 4°C a 30°C, conferindo-lhes vantagem competitiva de grande relevância para futuras aplicações em alimentos refrigerados.

 

4 - CONCLUSÕES

A presença de glicose a 2% influenciou positivamente a produção de bacteriocina por Lactobacillus curvatus 5 e 14.

Lactobacillus sake 1 e Leuconostoc mesenteroides 11 apresentaram a maior atividade antilisterial.

As bacteriocinas produzidas eram de naturezas distintas, apresentando variações quanto à sensibilidade a proteases, estabilidade térmica e estabilidade em diferentes pHs.

Todas as cepas estudadas produziram bacteriocinas em temperatura de refrigeração.

 

6 - Agradecimentos

Os autores agradecem à FAPESP pelo Auxílio-Pesquisa 98/10759-2 e pelas bolsas de Iniciação Científica concedidas a Priscila Rossi Santarosa (99/11689-0) e Flávia Zanolli Freitas (00/02756-5). São gratos também a Profa. Dra. Maria Teresa Destro, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas USP, pela doação da cepa de Listeria monocytogenes utilizada neste trabalho.

 

5 - REFERÊNCIAS

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Recebido para publicação em 22/08/2001. Aceito para publicação em 27/09/2002 (000727)

 

 

* A quem a correspondência deve ser enviada