Ácido fólico em leite e bebida láctea enriquecidos: estudo da vida-de-prateleira

Folic acid in enriched milk and milk beveverages: shelf-life study

Ácido fólico em leite e bebida láctea enriquecidos – estudo da vida–de–prateleira

Folic acid in enriched milk and milk beveverages — shelf–life study

Juliana. A. Lima; Rodrigo R. Catharino; Helena T. Godoy^*

Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Caixa Postal 6121, 13083–970, Campinas, SP, Brasil. Telefone: +55–19–37884024. FAX: +55–19–37882159. E–mail: [e-mail]

RESUMO

O ácido fólico é uma vitamina, que desempenha funções importantes, o que justifica seu uso nos processos de enriquecimento dos alimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a estabilidade do ácido fólico, utilizado no enriquecimento, durante a vida–de–prateleira de amostras dos seguintes produtos: leites em pó, leites esterilizados e bebidas lácteas achocolatadas prontas para o consumo. A determinação desta vitamina foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência. O ácido fólico foi extraído com solução básica e a limpeza do extrato foi realizada com ácido tricloroacético concentrado seguida de filtração. No processo cromatográfico utilizou–se coluna C₁₈, sistema de eluição por gradiente, sendo a fase móvel composta por tampão acetato e acetonitrila. A detecção foi feita na região do ultravioleta, a 290nm, e a quantificação por padronização externa. Nas amostras de leites em pó durante o período de estocagem de um ano ocorreram perdas acentuadas desta vitamina (60% em média), enquanto nas de leites esterilizados e bebidas lácteas achocolatadas as perdas foram, em média, de 25 e 29%, respectivamente, durante os quatro meses de estocagem.

Palavras–chave: ácido fólico; CLAE; leite em pó; leite esterilizado; bebida láctea achocolatada.

SUMMARY

Folic acid is a vitamin which plays importants roles, that justify its use in enriched foods. The aim of this work was to evaluate the stability of folic acid during the shelf–life of enriched samples of powdered milk, sterilized milk and ready–to–drink milk chocolate beverages. The determination was done by high perforamance liquid chromatography. Folic acid was extracted by a basic solution and the clean–up was carried out by the addition of trichloroacetic acid, followed by filtration. In the chromatographic process, a C₁₈ column and gradient elution were used. The mobile–phase consisted of acetate buffer and acetonitrile. Detection was carried out in the ultraviolet region, at 290nm, and quantification by external standardization. For powdered milk considerable losses of vitamin were observed (60% on average), after one year of storage For the sterilized milk and ready–to–drink milk chocolate beverage, the losses of folic acid were 25 and 29%, respectively, during the four months of storage.

Keywords: folic acid; HPLC; powder milk; sterilized milk; chocolate beverages.

1 — INTRODUÇÃO

Muitos trabalhos científicos têm apresentado dados que apontam uma ingestão insuficiente de vários nutrientes por parte da população mundial como um todo. Para tentar amenizar esse quadro e atender as recomendações em relação aos teores de compostos responsáveis pela manutenção da saúde, que devem estar presentes em produtos novos lançados no mercado, além de atender a padrões de identidade e regulamentos referentes a alimentos já existentes, é que tem sido feito o enriquecimento de produtos alimentícios [5]. Produtos lácteos, leite, farinhas, cereais, biscoitos, enfim, produtos com expressivo consumo pela população em geral têm sido os mais utilizados para esse fim.

A baixa ingestão de ácido fólico tem sido apontada como possível causa de doenças graves que atingem o homem, como as doenças cardíacas, o câncer e as malformações congênitas [8, 9, 14]. Programas de enriquecimento de alimentos e políticas elucidativas sobre a importância dessa vitamina têm sido implantadas por alguns governos. Nos Estados Unidos, o FDA (Food Drug Administration) determinou que o ácido fólico deveria ser adicionado (140µg/100g) em produtos como cereais, incluindo farinha, pão, cereais de refeição, arroz e macarrão, normativa, com efeito, a partir de janeiro de 1998 [5, 15].

O ácido fólico é a forma mais estável dentre os folatos, sendo a escolhida para o enriquecimento de alimentos [7], entretanto, durante os processos de fabricação e estocagem podem ocorrer perdas, até mesmo da vitamina adicionada.

Muito pouco se conhece a respeito da resistência do ácido fólico frente às condições de processamento e estocagem. Fatores como temperatura, luz, pH, presença de catalisadores e agentes oxidantes são responsáveis pela degradação do ácido fólico [1, 2, 3, 5, 16]. Gregory [13] mostrou que os fatores que parecem ter alguma importância na avaliação do comportamento de folatos são a presença de oxigênio e ácido ascórbico, além do conteúdo de água presente. DONG & OACE [10] , mostraram que leites submetidos a esterilização e subsequente estocagem apresentaram variada taxa de retenção de folatos (0 — 80%), dependendo da raça e tipo de alimentação do animal, das condições do processo, da presença de vitamina C e da concentração de oxigênio durante e após o processo. FORD et al. [12], FAVIER et al. [11] e RENNER[17] relataram que a estabilidade de folatos, durante o período de estocagem de leites processados, depende principalmente das quantidades de ácido ascórbico e oxigênio presentes, sendo o ácido ascórbico protetor e o oxigênio um agente que atua na degradação dos folatos.

Dessa forma, estudos sobre a estabilidade do ácido fólico em alimentos enriquecidos tornam–se bastante úteis, no sentido de garantir a qualidade dos produtos, assegurando até o final do seu prazo de validade o valor nutricional, além de orientar o produtor na sobredosagem necessária, para a produção, e das melhores condições de embalagem, transporte e armazenamento.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 — Produtos avaliados

Foram analisados quatro tipos de leite esterilizado (LLA, LLB, LLC e LLD), leite em pó (LPA, LPB, LPC e LPD) e bebida láctea achocolatada pronta para o consumo (BAA, BAB, BAC e BAD), todos enriquecidos com ácido fólico. As amostras foram adquiridas em supermercados da cidade de Campinas/SP. As determinações foram feitas em três diferentes lotes (1, 2 e 3), em duplicata, para cada amostra, diferenciados pelas datas de fabricação, com a preocupação de estarem com o menor tempo de fabricação possível. Cada lote foi formado por duas embalagens, que tiveram seu conteúdo homogeneizado antes da retirada da amostra. Todos os produtos analisados estavam sem danos aparentes. O estudo de vida–de–prateleira foi efetuado com a análise mensal de cada amostra, até o final do prazo de validade, com exceção das amostras de leite em pó que, por apresentarem maior prazo de validade, foram analisadas em intervalos de tempo maiores, 2 meses.

2.2 — Equipamento

Foi utilizado um cromatógrafo a líquido HP (HEWLETT PACKARD) série 1100, com degaseificador, bomba quaternária, injetor automático com capacidade de 1 a 100µL. Para a separação do ácido fólico foi utilizada uma coluna cromatográfica Microsorb–MV, ODS–2, 5µm, 150 X 4,6mm d.i. (Rainin Instrument Company), protegida por uma coluna de guarda Bondesil, C_18, 5µm, 10 X 4,6mm d.i. (VARIAN). Utilizou–se um detector de arranjo de diodos (DAD) da marca HP, série 1100. Acoplado ao sistema o software HP–Chemstation que, além de monitorar todos os componentes, permitiu o melhor tratamento dos dados.

2.3 — Determinação do ácido fólico

A metodologia utilizada neste trabalho foi desenvolvida e validada para leites por CATHARINO & GODOY [6]. Para a análise, foram tomados 1mL das amostras líquidas e 1,0g das amostras de leites em pó, previamente homogeneizados. A água utilizada no preparo das amostras e das fases móveis foi purificada no sistema Mili–Q (Millipore). O ácido fólico foi extraído das matrizes alimentícias utilizando–se, aproximadamente, 3,0mL de hidróxido de potássio (0,1mol/L, MERCK, Brasil), colocado em banho ultra–sônico por 10 minutos. Para a limpeza do extrato transferiu–se quantitativamente a solução para balão volumétrico de 10mL, adicionou–se 3,0mL de ácido fosfórico (0,1mol/L, MERCK, Brasil), 2,0mL de tampão fosfato, composto por Na₂HPO₄ (0,25mol/L, MERCK, Brasil)/ KH₂PO₄ (0,37mol/L, MERCK, Brasil) e 350µL de ácido tricloroacético (Synth, Brasil), completando–se o volume do balão com tampão fosfato. Após a homogeneização, seguiram–se duas etapas de filtração, a primeira em papel de filtro comum e a segunda em membrana Durapore (HAWP 01300 MILLIPORE), com poros de 0,45µm. Seguiu–se, então, a injeção de 100µL do extrato no cromatógrafo.

Utilizou–se sistema de eluição por gradiente para a separação do ácido fólico a vazão de 0,5mL/min, com 90% de tampão acetato (TPAC), contendo 0,166mol/L de ácido acético (MERCK, Brasil) e 0,01mol/L de hidróxido de potássio, a pH 2,8, e 10% de acetonitrila (ACN, MERCK, Brasil) (v/v) no início da corrida, chegando em 8,5 minutos a 76% de TPAC e 24% de ACN (v/v), mantendo–se essa proporção até 9,0 minutos. Para as bebidas lácteas achocolatadas prontas para o consumo, o gradiente chegou em 10,5 minutos a 76% de TPAC e 24% de ACN (v/v), mantendo–se a proporção até 11,0 minutos. Para ambos os casos, as condições iniciais foram retomadas e a coluna re–equilibrada durante 7 minutos, antes da próxima injeção. A detecção foi feita em detector de arranjo de diodos (DAD), utilizando–se o comprimento de onda de leitura a 290nm. A identificação da vitamina foi feita por comparação dos tempos de retenção, obtidos com padrões analisados nas mesmas condições, co–cromatografia e pela comparação dos espectros de absorção obtidos no DAD. A pureza do pico foi determinada pelo sistema ploter disponível no software HP–Chemstation. A quantificação do ácido fólico foi feita por padronização externa, utilizando–se padrão SIGMA cód. F–7876, lote 40H321, sendo a curva analítica construída com 7 níveis de concentração (0,01; 0,05; 0,10; 0,15; 0,30; 0,50 e 1µg/mL), sendo cada ponto representado pela média de três determinações.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nas Figuras 1 e 2 podem ser visualizados os perfis cromatográficos dos produtos enriquecidos analisados. O pico do ácido fólico aparece isolado, com tempo de retenção de aproximadamente 8,2 minutos. Para os achocolatados, em virtude da presença de interferentes, o gradiente de eluição teve que ser ligeiramente modificado. Desta forma, o interferente teve seu tempo de retenção deslocado, permitindo que o ácido fólico pudesse ser separado.

Os teores iniciais de ácido fólico encontrados nas amostras são apresentados na Tabela 1. Todas as amostras de leite em pó continham ácido fólico, mesmo aquelas de diferentes lotes, de acordo com o apresentado na embalagem do produto, com pequenas variações em relação a esses valores. Nos leites esterilizados, os da marca LLA apresentaram apenas 40% da quantidade especificada no produto, em todos os lotes. A situação mais alarmante foi com os leites LLB que apresentaram somente 7,6% do teor da vitamina. As outras duas marcas tinham concentrações próximas às declaradas. Nas amostras de bebidas lácteas a situação foi a mesma dos leites esterilizados, em duas, (BAA e BAB) das quatro marcas analisadas, os teores não chegaram a 20% da quantidade declarada no produto.

Os resultados obtidos neste trabalho, em relação aos teores de ácido fólico inicialmente presentes nas matrizes analisadas, confirmaram as observações feitas por GREGORY[13] em relação à influência da atividade de água nos processos de degradação dos folatos, o que justificaria as diferenças obtidas entre as amostras fluidas e em pó. Segundo o mesmo autor, quanto maior a atividade de água, menor a estabilidade da vitamina. No caso dos leites em pó, produtos com baixa atividade de água, os teores de ácido fólico encontravam–se próximos dos valores declarados nos rótulos.

Considerando que os produtores tenham realmente adicionado ácido fólico numa quantidade de pelo menos 100% a mais, o que é recomendado pelos fabricantes de "premix", as variações das diferenças entre os valores encontrados e dos apresentados nos rótulos, podem, ser explicadas pelas condições de processamento, concentração de oxigênio dissolvido durante e após o processo. Fatores como esses foram relatados anteriormente por BURTON et al. [4] e DONG & OACE [10]. De acordo com esses autores, quanto maior a quantidade de oxigênio incorporado ao alimento e maior a temperatura durante o processamento industrial a que ele foi submetido, menor será a estabilidade desta vitamina. Provavelmente, os leites que apresentaram maior teor da vitamina, passaram por um processamento mais favorável à preservação do ácido fólico.

As Tabelas 2, 3 e 4 mostram os valores referentes à concentração de ácido fólico obtidos durante a estocagem de leite em pó, leite esterilizado e bebida láctea achocolatada, respectivamente, para cada lote de cada produto. Alguns lotes referentes à amostras de bebidas achocolatadas e leites esterilizados (BAA1, BAB1, BAC3, BAD1, LLB1, LLD1) foram perdidas durante a estocagem, devido ao estufamento das embalagens e, portanto, o estudo da estabilidade da vitamina não pôde ser realizado até o final do prazo de validade.

A Figura 3 ilustra o comportamento do ácido fólico nas amostras analisadas neste trabalho, durante o referido período de estocagem. Os pontos representam a média dos lotes.

Para os lotes de leite em pó analisou–se os produtos durante 12 meses, correspondente ao prazo de validade dos mesmos, exceto para a amostra LPB que apresentava prazo de validade de 2 anos. Para todas as amostras verificou–se uma diminuição do teor de ácido fólico, mais acentuada nos primeiros 6 meses. A porcentagem de perda média, após 12 meses, variou de 58 a 70,7% (Tabela 5). As curvas obtidas e apresentadas na Figura 3, sugerem que, provavelmente, a partir do quarto mês de estocagem, nenhum dos lotes de leite em pó continha o teor de vitamina declarado na embalagem. Este fato pode ser explicado, provavelmente, devido a maior exposição do ácido fólico, adicionado aos leites em pó, a processos de oxidação.

O comportamento do ácido fólico nos leites esterilizados e bebidas lácteas achocolatadas foi o mesmo (Tabelas 3 e 4), devido à similaridade das características da matriz. Foram observadas perdas gradativas ao longo do período de validade (120dias), variando de 20 a 29% para os leites e as bebidas achocolatadas, respectivamente (Tabela 5). No entanto, após 60 dias de estocagem, o teor de ácido fólico não correspondia ao teor declarado na embalagem em nenhum desses produtos. Os leites esterilizados foram analisados por um período de 90 dias, porém para LLD o prazo de validade era de 4 meses e, portanto, verificou–se os teores de ácido fólico por 120 dias nesse produto e verificou–se uma perda de 40%. A degradação do ácido fólico nessas matrizes pode ser explicada, provavelmente, pela atividade de água, que por ser maior nesses alimentos, proporcionaria a ocorrência de reações químicas que poderiam ocasionar a perda da vitamina.

4 — CONCLUSÕES

Observa–se pelos resultados obtidos, que o enriquecimento está sendo realizado, entretanto, em alguns produtos, mesmo pouco tempo após a fabricação, as concentrações de ácido fólico foram muito inferiores em relação às declaradas nos rótulos.

Durante o período de estocagem, verificou–se uma perda acentuada nos níveis de ácido fólico, dos leites em pó. Para os demais produtos, a perda da vitamina ocorreu, porém de forma menos drástica. Portanto, para que esses produtos estejam de acordo com as especificações do fabricante, até o final da vida–de–prateleira, se faz necessário um estudo para a verificação das melhores condições para estabilizar a vitamina durante esse prazo.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 — AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Centro de Aperfeiçoamento de Pesquisadores (CAPES) pela concessão da bolsa de mestrado para Juliana A. Lima e Rodrigo R. Catharino.

Recebido para publicação em 02/10/2002

Aceito para publicação em 23/12/2003 (000996)

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A quem a correspondência deve ser enviada.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Jun 2004
• Data do Fascículo
  Mar 2004

Histórico

• Recebido
  02 Out 2002
• Aceito
  23 Dez 2003