Determinação de benzo(a)pireno em pescados

Determination of benzo(a)pyrene in fish products

Determinação de benzo(a)pireno em pescados

Determination of benzo(a)pyrene in fish products

Antonio Azeredo; Maria Cecília de Figueiredo Toledo^*; Mônica Cristiane Rojo de Camargo

Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos. Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) Rua Monteiro Lobato, 80 Caixa Postal 6121 CEP 13083-862 – Campinas (SP) E-mail: [e-mail]

RESUMO

No presente estudo, peixes, camarões, mexilhões e carnes de siri frescos e processados, comercializados na região metropolitana de Campinas (SP), foram analisados quanto à presença de benzo(a)pireno (B(a)P). A metodologia utilizada envolveu extração com n-hexano, limpeza em Sep-Pak sílica plus e determinação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Fluorescência. A presença de B(a)P foi detectada em todas as amostras analisadas (n=35), em quantidades variando na faixa de 0,03 a 4,54 µg/kg. Os maiores níveis de contaminação foram encontrados em produtos defumados (níveis médios=2,5 µg/kg) e mexilhões (níveis médios=2,4 µg/kg). Considerando-se o potencial carcinogênico desse contaminante e a importância desse grupo de alimentos na dieta, um programa de monitoramento deve ser iniciado para identificar e controlar a fonte de contaminação de pescados por B(a)P.

Palavras-chave: hidrocarboneto policíclico aromático, pescados, peixe defumado.

SUMMARY

In the present study samples of fresh and processed fish, shrimp, mussels and crab meat commercialized in the metropolitan area of Campinas (SP), Brazil were analysed for benzo(a)pyrene (B(a)P). The methodology involved extraction with n-hexane, clean-up on Sep-Pak silica plus and determination by High Performance Liquid Chromatography with a Fluorescence Detector. B(a)P was detected in all samples analysed (n=35) at levels ranging from to 0.03 a 4.54 µg/kg. The highest content of B(a)P was found in smoked products (mean level=2.5 µg/kg ) and mussels (mean level=2.4 µg/kg). In view of the carcinogenic potential of this widely distributed contaminant and the importance of seafood in the daily diet of fisherman communities, a monitoring program should be initiated to identify and control the source of contamination of seafood by B(a)P.

Keywords: polycyclic aromatic hydrocarbons, seafood, smoked fish.

1 - INTRODUÇÃO

Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são contaminantes amplamente distribuídos no ambiente [10, 21], cuja importância se deve ao seu potencial carcinogênico em animais de laboratório [9] e por relacionarem-se com alguns tipos de câncer no homem [19]. Entre os HPAs carcinogênicos, destaca-se o benzo(a)pireno (B(a)P), que por ser o mais bem estudado do grupo e por sua potente ação carcinogênica [12, 5], tem sido utilizado como indicador da presença de HPAs em alimentos [8, 21].

A cada ano são derramados nos mares de todo o mundo cerca de 5 milhões de toneladas de petróleo, uma conhecida fonte de HPAs [6]. Estes compostos são persistentes, principalmente em ambientes aquáticos, devido a sua baixa solubilidade em água e pela tendência de se associarem com material particulado, uma importante fonte de alimento para um grande número de organismos marinhos [15].

Peixes não processados apresentam concentrações de HPAs bastante baixas, mesmo quando capturados em locais contaminados. Isto se deve à grande habilidade do sistema metabólico de peixes em biotransformar HPAs em dióis, epóxidos e outras substâncias [16]. Peixes defumados sob condições controladas têm, normalmente, quantidade inferior a 1 µg/kg de B(a)P (na faixa de 0,1 a 0,5 µg/kg); porém, estes valores podem ser ultrapassados no caso de defumação excessiva. A incidência de câncer de estômago em grupos da população da Nigéria [1] e dos países bálticos [3] tem sido relacionada com o grande consumo de peixe defumado artesanalmente, contendo elevados níveis de HPAs. Os moluscos, por não possuírem mecanismos rápidos de biotransformação e acumularem HPAs e outros poluentes, são considerados organismos sentinela, e têm sido largamente utilizados para monitoramento ambiental.

Vários métodos para a determinação de HPAs em peixes, moluscos e crustáceos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) já foram descritos na literatura e muitos deles envolvem etapas de saponificação, extração da fração insaponificável por meio de partição líquido-líquido, purificação da amostra e determinação analítica [3, 18].

Até o presente momento desconhecem-se pesquisas dirigidas ao monitoramento da presença de B(a)P em pescados disponíveis no mercado brasileiro, embora já existam trabalhos que descrevam a ocorrência deste contaminante em outros alimentos como óleos e produtos cárneos [14, 17]. Esta pesquisa tem como objetivo quantificar B(a)P em amostras de pescados frescos e processados disponíveis no comércio local da região metropolitana de Campinas.

2 - MATERIAL E MÉTODOS

2.1 - Amostras

Amostras de filés de peixe secos e congelados (n=9), mexilhões congelados e enlatados (n=4) peixes defumados (n=5), camarões congelados e enlatados (n=4), carne de siri congelada e enlatada (n=3), sardinha enlatada (n=5) e atum enlatado (n=5) foram adquiridas nos supermercados de Campinas (SP) durante o ano 2000. Três lotes de cada produto foram combinados, homogeneizados em processador e analisados em duplicata. Todas as amostras enlatadas foram drenadas antes de serem homogeneizadas.

2.2 - Metodologia

2.2.1 - Extração

Foi utilizado o método de extração sugerido por TAKAMAWA et al. [20] com algumas modificações, conforme descrito a seguir.

Pesaram-se 25 g de amostra, previamente homogeneizadas, em balões de fundo redondo nos quais foram adicionados 200 mL de KOH etanólico 2 mol/L e pedras de ebulição. A etapa de saponificação foi realizada em banho a 100° C, sob refluxo por 2 h. Os balões com material saponificado foram adicionados de 150 mL de n-hexano, após resfriamento à temperatura ambiente, e agitados. Esta mistura foi transferida quantitativamente para um funil de separação de 500 mL, onde foi homogeneizada vigorosamente por 5 min. Os balões foram lavados com duas porções de 20 mL de etanol e estes volumes adicionados ao funil de separação. O funil de separação foi agitado mais uma vez e esperou-se a separação da fase orgânica da fase aquosa. A fase aquosa foi transferida para outro funil de separação e extraída com porções de 150 mL e 100 mL de n-hexano. Os volumes de n-hexano foram recolhidos em um único funil de separação e lavados com 100 mL de água destilada. O extrato de n-hexano foi seco por filtração com sulfato de sódio anidro e concentrado até aproximadamente 4 mL em evaporador rotativo a vácuo a 40°C.

2.2.2 - Purificação da amostra

Um cartucho de Sep-Pak sílica plus (Waters^®) (360 mg) foi conectado a uma seringa e condicionado com 30 mL de n-hexano, antes de receber os 4 mL do extrato obtido pelas partições. O cartucho foi eluído com 25 mL de n-hexano e o volume final, concentrado em evaporador rotativo a vácuo, a 40°C, até aproximadamente 2 mL, que foi seco sob corrente de nitrogênio. O resíduo foi dissolvido em 1 mL de acetonitrila e passado em filtro Millex, membrana Durapore, em PVDF (Millipore^®) com poros de 0,45 µm de diâmetro (tipo HV).

2.2.3 - Desenvolvimento cromatográfico

A separação foi feita por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), utilizando-se um cromatógrafo Waters constituído por bomba quaternária modelo 600, injetor automático modelo 717 e detector de fluorescência modelo 474, operando com comprimentos de onda de excitação/emissão de 294/404 nm. A separação isocrática foi feita em coluna cromatográfica VYDAC C18 (5 µm, Vydac 201 TP) de 25 cm x 4,6 mm d.i., acoplada a uma coluna de guarda também de 5 µm (0,46 mm x 1,0 cm), ambas mantidas à temperatura de 33°C. A fase móvel foi constituída por acetonitrila-água (85:15, v/v), em vazão constante de 0,5 mL/min. O volume de injeção foi de 20 µl. A confirmação do pico foi feita nas mesmas condições cromatográficas descritas anteriormente, variando-se apenas o comprimento de onda de emissão do detector para 424 nm, de acordo com FALCÓN et al. [4].

2.2.4 - Quantificação

Foi empregado o método de padronização externa. A partir de uma solução estoque do padrão de B(a)P obteve-se, por diluição com acetonitrila, a faixa de concentrações de 0,5 a 22 ug/L.

2.2.5 - Recuperação do método

Amostras de filé de pescada enriquecidas no início da extração com dois níveis conhecidos de padrão de B(a)P foram usadas para avaliar a recuperação do procedimento analítico. As amostras foram analisadas em triplicata. A análise do branco, para verificar a pureza dos reagentes usados na etapa de extração, também foi executada na avaliação do método.

3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

As recuperações de 88 e 96% para as amostra enriquecidas com 2,3 e 4,5 µg/kg de B(a)P, respectivamente, demonstraram a eficiência do método de extração e foram compatíveis com os resultados obtidos por TAMAKAWA et al. [20], utilizando a mesma metodologia (96,3 e 106%). A precisão (CV %) do método foi de 6,7% para o menor nível de fortificação e de 2,9% para o maior nível de fortificação. A repetição da resposta do detector em relação à altura do pico e tempo de retenção foi de 97,4%. A curva de calibração (r²=0,99986170) foi linear, e a análise de regressão apresentou correlação significativa entre as variáveis. Os limites de detecção e de quantificação do método foram 0,005 µg/kg e 0,017 µg/kg, respectivamente, e ficaram bem abaixo do limite referencial de 1 µg/kg de B(a)P [5].

Não foi detectada a presença de nenhum interferente nos reagentes. A formação de emulsões durante as etapas de extração é um dos pontos críticos na análise de HPAs em alimentos [4]. No procedimento adotado, observou-se a tendência à formação de emulsão durante a limpeza da fração de n-hexano com água destilada. Este problema foi minimizado com agitação menos vigorosa, a qual se mostrou eficiente na limpeza da amostra. A Figura 1 ilustra cromatogramas característicos das amostras analisadas.

A presença de B(a)P foi detectada em todas as amostras analisadas (Tabelas 1 e 2), sendo que em oito delas a concentração encontrada ficou acima do limite de referência de 1 µg/kg. As amostras de filé de peixe não defumado apresentaram contaminação relativamente baixa (<0,27 µg/kg), o que pode ser parcialmente atribuído à grande eficiência do sistema metabólico dos peixes para biotransformar e eliminar este contaminante, conforme descrito por outros autores [11, 13, 15]. A mesma observação pode ser feita para camarões e carnes de siri, os quais apresentaram contaminação média de 0,14 µg/kg. Assim como os peixes, estes invertebrados têm a habilidade de biotransformar o B(a)P por meio do sistema de oxidases de função mista (MFO) [6].

A concentração média de B(a)P em sardinha enlatada (0,29 µg/kg) foi superior àquelas encontradas em atum enlatado (0,16 µg/kg) e em filé de peixe (0,08 µg/kg). O mesmo foi relatado por LAWRENCE e WEBER [11], que não observaram diferença significativa entre os níveis médios de B(a)P em sardinha enlatada e fresca (0,5 e 0,4 µg/kg, respectivamente).

Os mexilhões e os peixes defumados foram os dois produtos que apresentaram os maiores níveis de (B(a)P). Das três marcas de mexilhão congelado analisadas, apenas uma continha este contaminante em concentração inferior a 1 µg/kg. Estes valores condizem com o fato de os moluscos serem organismos filtradores que, ao contrário dos peixes, caracterizam-se por bioacumular HPAs [2, 10].

O fato de todas as amostras de peixe defumado analisadas no presente estudo ter apresentado contaminação por B(a)P acima de 1 µg/kg reforça a idéia de que o processo de defumação pode aumentar efetivamente o nível de HPAs no produto final [22]. ZABIK et al. [23] encontraram em peixes defumados quantidades ainda mais elevadas de B(a)P (6,22-10,27 µg/kg). Os níveis de 3,9 µg/kg e de 2,46 µg/kg de B(a)P em salmão defumado relatados por GOMMA et al. [7] e por FALCÓN et al. [5], respectivamente, foram mais próximos dos valores determinados neste estudo.

O teor de B(a)P encontrado na amostra de hadoque defumado foi mais alto que aqueles relatados por LAWRENCE e WEBER [11], que observaram quantidades menores que 0,05 µg/kg em hadoque e em outros peixes defumados. Vários HPAs que se acumulam na superfície de alimentos defumados são formados durante a queima da fonte geradora de fumaça [23]. As diferenças entre os valores encontrados neste estudo e os descritos na literatura podem ser atribuídas ao grau e/ou à forma de defumação empregada nas diferentes amostras [7, 11]. Produtos levemente defumados apresentam níveis menores de HPAs que aqueles defumação excessivamente [11].

4 - CONCLUSÕES

A presença de B(a)P foi observada em todas as amostras analisadas, embora os níveis de contaminação sejam bem mais baixos que os encontrados em outras categorias de alimentos. Peixes frescos, camarões e carne de siri apresentaram baixa contaminação com B(a)P, provavelmente devido ao seu hábil sistema de biotransformação. Os peixes defumados e mexilhões foram os alimentos que mostraram valores mais altos de contaminação e, por isso, recomenda-se um efetivo monitoramento destes produtos quanto à presença de B(a)P. Processos controlados de defumação industrial devem ser adotados, visando diminuir os níveis de B(a)P no produto final.

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Recebido para publicação em 1/12/2004. Aceito para publicação em 23/1/2006 (001444)

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Maio 2006
• Data do Fascículo
  Mar 2006

Histórico

• Aceito
  23 Jan 2006
• Recebido
  01 Dez 2004