Isolamento e seleção de microrganismos pectinolíticos a partir de resíduos provenientes de agroindústrias para produção de aromas frutais

Screening of fruit flavors producing pectinolitic microorganisms isolated from agroindustrial residues

Resumos

As pectinases são enzimas produzidas naturalmente por plantas, fungos, leveduras e bactérias. Estes microrganismos podem ser inoculados em meios contendo resíduos agroindustriais utilizados como fonte de carbono para a produção de compostos de maior valor agregado, como enzimas, etanol, proteínas, aminoácidos e compostos de aroma. Vários microrganismos foram isolados e selecionados quanto à produção de enzimas pectinolíticas pelo método da placa, através de zonas claras de degradação de pectina ao redor da colônia. De 104 linhagens testadas, 18 foram selecionadas para fermentarem em meio líquido, contendo pectina para a determinação de atividade de poligalacturonase (PG) e de pectina liase (PMGL), e em meio frutose/extrato de levedura para produção de aromas. As linhagens 2, 9, 20, 39, 70, 74 e 99 apresentaram unidades de atividade de PG superiores a 80 µmol de ácido galacturônico/mL/min, as linhagens 17, 18, 31, 37, 73, 74 e 125 apresentaram unidades de atividade de PMGL superiores a 1000 etamol de produtos insaturados/mL/min e as linhagens 13, 70, 73, 74, 125 e 144 apresentaram os melhores descritores e as maiores intensidades de aromas percebidos por um painel não treinado de provadores.

pectina; fermentação; pectinase; poligalacturonase; pectina liase; aroma

Pectinases are enzymes used in food industries, produced by plants, fungi, yeasts and bacteria. These microorganisms can be inoculated in a medium containing agro-industrial residues from processing agricultural products, used as a carbon source to produce value-added products such as enzymes, ethanol, proteins, amino acids and flavor compounds. Several microorganisms were isolated and selected due to their capacity to produce pectinolytic enzymes in clear halos around colonies by plate assay. From 104 strains, 18 were inoculated in a medium containing pectin as a carbon source and the pectinolytic activities of polygalacturonase (PG) and pectin lyase (PMGL) were determined. Strains 2, 9, 20, 39, 70, 74, and 99 showed activity units of PG higher than 80 µmol galacturonic acid/mL/minute. Strains 17, 18, 31, 37, 73, 74 and 125 showed activity units of PMGL higher than 1000 etamol unsaturated products/mL/minute. Strains 13, 70, 73, 74, 125 and 144 showed good signs of flavor noticed in the fructose and yeast extract medium and the most intense flavor according to a non-trained board of tasters.

pectin; fermentation; pectinolitic enzyme; polygalacturonase; pectin lyase; flavor

Isolamento e seleção de microrganismos pectinolíticos a partir de resíduos provenientes de agroindústrias para produção de aromas frutais

Screening of fruit flavors producing pectinolitic microorganisms isolated from agroindustrial residues

Mariana Uenojo^*; Glaucia Maria Pastore

Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos (UNICAMP), C. P. 6121, CEP 13083-862, Campinas (SP), E-mail: [e-mail]

RESUMO

As pectinases são enzimas produzidas naturalmente por plantas, fungos, leveduras e bactérias. Estes microrganismos podem ser inoculados em meios contendo resíduos agroindustriais utilizados como fonte de carbono para a produção de compostos de maior valor agregado, como enzimas, etanol, proteínas, aminoácidos e compostos de aroma. Vários microrganismos foram isolados e selecionados quanto à produção de enzimas pectinolíticas pelo método da placa, através de zonas claras de degradação de pectina ao redor da colônia. De 104 linhagens testadas, 18 foram selecionadas para fermentarem em meio líquido, contendo pectina para a determinação de atividade de poligalacturonase (PG) e de pectina liase (PMGL), e em meio frutose/extrato de levedura para produção de aromas. As linhagens 2, 9, 20, 39, 70, 74 e 99 apresentaram unidades de atividade de PG superiores a 80 µmol de ácido galacturônico/mL/min, as linhagens 17, 18, 31, 37, 73, 74 e 125 apresentaram unidades de atividade de PMGL superiores a 1000 hmol de produtos insaturados/mL/min e as linhagens 13, 70, 73, 74, 125 e 144 apresentaram os melhores descritores e as maiores intensidades de aromas percebidos por um painel não treinado de provadores.

Palavras-chave: pectina, fermentação, pectinase, poligalacturonase, pectina liase, aroma.

SUMMARY

Pectinases are enzymes used in food industries, produced by plants, fungi, yeasts and bacteria. These microorganisms can be inoculated in a medium containing agro-industrial residues from processing agricultural products, used as a carbon source to produce value-added products such as enzymes, ethanol, proteins, amino acids and flavor compounds. Several microorganisms were isolated and selected due to their capacity to produce pectinolytic enzymes in clear halos around colonies by plate assay. From 104 strains, 18 were inoculated in a medium containing pectin as a carbon source and the pectinolytic activities of polygalacturonase (PG) and pectin lyase (PMGL) were determined. Strains 2, 9, 20, 39, 70, 74, and 99 showed activity units of PG higher than 80 µmol galacturonic acid/mL/minute. Strains 17, 18, 31, 37, 73, 74 and 125 showed activity units of PMGL higher than 1000 hmol unsaturated products/mL/minute. Strains 13, 70, 73, 74, 125 and 144 showed good signs of flavor noticed in the fructose and yeast extract medium and the most intense flavor according to a non-trained board of tasters.

Keywords: pectin, fermentation, pectinolitic enzyme, polygalacturonase, pectin lyase, flavor.

1 - INTRODUÇÃO

Substâncias pécticas são macromoléculas glicosídicas de alto peso molecular, formadoras do maior componente da lamela média das paredes primárias de células de vegetais superiores [2], compostas de resíduos de ácido galacturônico unidos por ligações a-1,4, parcialmente esterificados por grupos metil éster [16, 19, 47]. São classificadas em protopectina, a forma nativa unida com outros constituintes das células vegetais, insolúvel em água e totalmente metoxilada; ácido péctico, compostas de resíduos de ácido poligalacturônico coloidal completamente desmetoxilada, e pectina e ácido pectínico que possuem um grau variável de metoxilação e, em condições adequadas, são capazes de formar géis com ácidos e açúcares [20, 24, 38, 48].

Essas substâncias pécticas podem ser degradadas por enzimas pectinolíticas produzidas naturalmente por plantas, fungos filamentosos, bactérias e leveduras [11, 45], muito utilizadas nas indústrias de alimentos para extração e clarificação de sucos de frutas e vegetais, para aumentar o rendimento e melhorar o processamento sem o aumento de custos [3, 7]. Sua classificação está baseada no ataque ao esqueleto galacturônico, preferência pelo substrato (pectina ou pectato), ação por transeliminação ou hidrólise e por clivagem randômica ou terminal [16, 38, 49].

As hidrolases (poligalacturonase, PG) hidrolisam ligações glicosídicas a-1,4 entre dois resíduos de ácido galacturônico e as liases (pectina liase, PMGL), também chamadas de transeliminases, rompem ligações glicosídicas, resultando em galacturonídeos com uma ligação insaturada entre os carbonos 4 e 5 [16].

Diversas espécies de microrganismos como Bacillus, Erwinia, Kluyveromyces, Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Pseudomonas, Penicillium e Fusarium são conhecidos como bons produtores de pectinases [10, 16, 38], podendo ser utilizados em escala industrial, pois cerca de 90% das enzimas produzidas podem ser secretadas no meio de cultura. A síntese destas enzimas sofre influência dos componentes do meio, presença de indutores, pH e temperatura de cultivo [4].

Resíduos agroindustriais como casca de café, casca e bagaço de frutas cítricas, farelo de trigo, bagaço de uva, bagaço de mandioca, bagaço de beterraba doce podem ser utilizados como substratos em bioprocessos para a produção de compostos de maior valor agregado como enzimas, etanol, proteínas, ácidos orgânicos e compostos de aroma, desde que se escolha o microrganismo apropriado ou adaptado para a finalidade desejada [4, 7, 27, 42].

A maioria dos aromas naturais é o resultado de misturas de compostos químicos, biologicamente ativos, apresentando estruturas complexas de vários grupos funcionais, encontrados em baixas concentrações. Os compostos químicos responsáveis pelos aromas característicos são álcoois, ácidos, ésteres, cetonas, lactonas, aldeídos [12, 22, 37] e outras moléculas complexas que resultam do metabolismo secundário de plantas ou podem ser obtidas de fontes animais. Certos fungos, leveduras e bactérias também possuem potencial para o metabolismo secundário e podem produzir aromas e fragrâncias [22]. Fungos do gênero Ceratocystis produzem uma grande quantidade de aromas de frutas ou de flores (pêssego, abacaxi, banana, citrus e rosa), dependendo da cepa e das condições de cultivo. Ceratocystis frimbiata tem potencial para síntese de éster, cresce rapidamente e produz uma grande variedade de aromas [31, 41].

O presente trabalho teve como objetivo isolar e selecionar microrganismos pectinolíticos para a posterior produção de aromas frutais em meios de cultura contendo resíduos agroindustriais.

2 - MATERIAL E MÉTODOS

2.1 - Isolamento dos microrganismos

Os microrganismos foram isolados de grãos de café, água de lavagem de café, folhas de pé de café, terra de cafezal e de frutas (banana, mexerica, laranja, melão, mamão, goiaba, uva e damasco). As amostras foram semeadas em 10 mL de meio de enriquecimento estéril e mantidas em estufa a 30 °C por 24 h. A seguir, uma alçada do meio foi inoculada em placas de Petri contendo meio PDA e mantidas em estufa a 30 °C de 24 a 48 h e as colônias isoladas foram transferidas para tubos de ensaio contendo meio PDA inclinado.

2.2 - Seleção de microrganismos pectinolíticos

Os microrganismos pectinolíticos foram inoculados em meio sólido contendo 1,25% de pectina cítrica (Sigma), incubados em estufa a 30 °C por 2 a 4 dias, conforme o crescimento das colônias. A seguir, as placas foram reveladas com uma solução de vermelho rutênio 0,05% e lavadas com água destilada [26]. As linhagens que apresentaram halo de degradação vermelho púrpuro ao redor do halo de colônia foram consideradas produtoras de pectinases e foram selecionadas para determinação de atividade pectinolítica.

2.3 - Determinação de atividade pectinolítica

As linhagens pectinolíticas selecionadas foram inoculadas em meio líquido contendo 1% de pectina cítrica (Sigma) e incubadas em shaker rotatório a 30 °C, 100 rpm por até 96 h. Após cada período de 24 h de fermentação as amostras foram retiradas e centrifugadas e o sobrenadante utilizado para a medida de pH e determinação de atividade de PG e PMGL [46].

Substrato. Foram preparadas soluções de pectina cítrica (Sigma) 0,5% em tampão acetato pH 4,5 e em tampão citrato fosfato pH 5,5 para as atividades de PG e PMGL, respectivamente.

Atividade de PG. Determinada pela medida da liberação de grupos redutores utilizando-se o método do ácido dinitrosalicílico (DNS) [28]. 500 µL de substrato e 500 µL de extrato enzimático foram incubados a 40 °C por 40 min e a reação paralisada com a adição de 1 mL de solução de DNS. A solução foi mantida em ebulição por 8 min, resfriados em banho de gelo e adicionados 8 mL de solução 50 mM de tartarato duplo de sódio-potássio. A absorbância foi medida em espectrofotômetro a 540 hm contra o branco. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 mmol de ácido galacturônico por minuto, segundo uma curva padrão do ácido a-D-galacturônico (Fluka Chemica) [46].

Atividade de PMGL. Baseada no aumento da absorbância devido à formação de produtos insaturados [1]. Um mL de substrato e 1,0 mL de extrato enzimático foram incubados a 40 °C por 1 h e a reação paralisada com a adição de 3,5 mL de HCl 0,5 M. A absorbância foi medida em espectrofotômetro a 235 hm contra o branco. O coeficiente de extinção molar dos produtos insaturados e₂₃₅ = 5550 M^-1 cm^-1 foi utilizado para o cálculo de atividade UA = (DA/e₂₃₅) 10⁹ (hmol/mL/min), onde DA é o aumento de absorbância por minuto [46].

2.4 - Seleção de linhagens produtoras de aromas frutais

Os microrganismos pectinolíticos produtores de aromas de frutas foram inoculados em meio frutose e extrato de levedura, incubados em shaker rotatório a 25 °C e 100 rpm por 72 h e selecionados por meio de um painel não treinado de 10 provadores. Solicitou-se aos provadores a descrição dos aromas e das intensidades percebidas em uma ficha sensorial apropriada contendo uma escala de intensidade de aroma (Tabela 1) [46].

3 - RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1 - Seleção de microrganismos pectinolíticos

Foram testadas 104 linhagens, das quais 18 foram consideradas positivas, ou seja, apresentaram halo de degradação vermelho púrpuro além de halo de colônia. Apenas 5 microrganismos não cresceram neste meio e os 81 restantes cresceram, mas não apresentaram halo de degradação.

Os valores de diâmetro total (colônia mais halo), diâmetro de colônia e diâmetro de halo (diâmetro total menos o de colônia) das 18 linhagens ditas positivas são mostrados na Tabela 2.

3.2 - Determinação de atividade pectinolítica

Os valores de pH e das atividades enzimáticas foram obtidos a partir do sobrenadante das fermentações com as linhagens pectinolíticas.

A Figura 1 mostra a variação de pH das linhagens estudadas durante as 96 h de fermentação. Observa-se que, para a maioria das cepas, há um leve declínio do pH nas primeiras 24 h de fermentação e a partir de 48 h o pH volta a aumentar. Isso pode ser explicado pela liberação de ácido galacturônico no meio pela ação de enzimas pectinolíticas produzidas pelos microrganismos durante as primeiras horas de fermentação. Após 48 h de fermentação observa-se aumento do pH devido ao consumo da fonte de nitrogênio disponível no meio.

A Figura 2 apresenta as atividades obtidas para PG. Observa-se que os microrganismos 2, 9, 20, 39, 70, 74 e 99 apresentaram unidades de atividade superiores à 80 µmol de ácido galacturônico/mL de extrato bruto enzimático/min. Alguns autores descrevem ter obtido unidades de atividade de poligalacturonase entre 2,7 e 3,5 µmol/mL/min após 48 h [40] e 15,72 µmol/mL/min após 30 h de fermentação [15] por cepas de Bacillus sp. Aspergillus awamori produziu 0,05 µmol/mL/min de atividade máxima após 7 dias de fermentação [4] e Lentinus edodes apresentou atividade entre 1,5 e 2,2 µmol/mL/min após 40 dias [49]. 43 µmol/mL/min foram obtidos por Thermoascus aurantiacus cultivados em meios contendo bagaço de laranja e farinha de trigo após 6 e 4 dias de fermentação, respectivamente [23].

As atividades de PMGL obtidas são mostradas na Figura 3. As linhagens 17, 18, 31, 37, 73, 74 e 125 apresentaram unidades de atividade superiores a 1000 hmol de produtos insaturados/mL de extrato bruto enzimático/minuto. Relatos em literatura demonstram a obtenção de 16 hmol/mL/min de atividade de pectina liase por Penicillium griseoroseum após 48 h de fermentação [34] e Aureobasidium pullulan apresentou 9 µmol/mL/min de unidades de atividade após 4 dias de fermentação [21]. Cerca de 2500 µmol/mL/min de atividade foram produzidos por Aspergillus niger quando cultivado em meio contendo 2% de milho por 6 dias [29] e Thermoascus aurantiacus cultivados em meios contendo bagaço de laranja e farinha de trigo apresentaram atividade de 19300 e 11600 µmol/g matéria seca/min após 12 e 14 dias de fermentação, respectivamente [23].

3.3 - Seleção de linhagens produtoras de aromas frutais

Das linhagens selecionadas anteriormente, apenas as linhagens 2 e 37 não cresceram no meio contendo frutose e extrato de levedura. As demais produziram aromas frutais agradáveis, de intensidades variáveis, de acordo com análise sensorial realizada por um painel não treinado de provadores. Algumas das descrições de aromas citadas foram: frutal, abacaxi, pêra, banana, pêssego, laranja, doce, fermento e solvente.

As linhagens 13, 70, 73, 74, 125 e 144 foram as que apresentaram as maiores intensidades de aromas frutais, recebendo atribuição ++++ ("aroma intenso") a +++++ ("aroma muito intenso") de acordo com a escala de intensidade de aromas (Tabela 3).

Observando-se os dados de atividade de PG e de PMGL, verificou-se que as linhagens 70, 73, 74 e 144 apresentaram boa atividade pectinolítica e também produziram aromas de frutas agradáveis durante a fermentação em meio frutose e extrato de levedura, sendo selecionadas para prosseguirem com as fermentações em meios de cultura contendo resíduos agroindustriais para a produção de aromas frutais, cujos resultados serão apresentados em trabalho posterior.

4 - CONCLUSÕES

De acordo com a capacidade de produção de pectinases e de produção de aromas frutais, as linhagens 70, 73, 74 e 144 foram as que apresentaram os melhores e mais agradáveis aromas de frutas durante a fermentação em meio frutose/extrato de levedura, sendo selecionadas para prosseguirem com as fermentações em meios de cultura constituídos de resíduos agroindustriais contendo pectina.

Estas linhagens foram posteriormente cultivadas em meios de cultura contendo resíduos agroindustriais, como casca de café, bagaço de uva, laranja e limão, para a produção de aromas frutais, visando-se o aproveitamento destes materiais que são gerados em grandes quantidades durante o processamento das respectivas matérias-primas. Os microrganismos foram capazes de se desenvolver nestes meios e de produzir aromas frutais, cujos resultados serão apresentados em trabalho posterior.

6 - AGRADECIMENTOS

Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de mestrado concedida.

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Recebido para publicação em 10/11/2004. Aceito para publicação em 6/7/2006 (001434)

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Nov 2006
• Data do Fascículo
  Set 2006

Histórico

• Recebido
  10 Nov 2004
• Aceito
  06 Jul 2006