Extração e caracterização parcial de peroxidase de folhas de Copaifera langsdorffii Desf.

Extraction and partial characterization of peroxidase from Copaifera langsdorffii Desf. leaves

Extração e caracterização parcial de peroxidase de folhas de Copaifera langsdorffii Desf.

Extraction and partial characterization of peroxidase from Copaifera langsdorffii Desf. leaves

Hermelinda Penha Freire Maciel^I; Cibele Marli Cação Paiva GouvêaII, ^*; Gláucia Maria Pastore^I

^IDepartamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas - SP, Brasil

^IIDepartamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Alfenas, Rua Gabriel Monteiro da Silva, 714, Centro, CEP 37130-000, Alfenas - MG, Brasil, E-mail: [e-mail]

RESUMO

Em recentes publicações têm sido descritos vários processos para obtenção de peroxidases. O propósito deste trabalho foi extrair peroxidase de folhas de Copaifera langsdorffii e caracterizar parcialmente a enzima usando planejamento experimental e teste univariado, para confirmação dos resultados obtidos por planejamento experimental. A atividade da peroxidase foi medida usando sistema guaiacol: peróxido de hidrogênio. A peroxidase isolada apresentou 81,6% da atividade da horseradish peroxidase e é de fácil obtenção, a partir de folhas de uma árvore abundante em todo o país. A peroxidase semi-purificada (COP) foi obtida pela precipitação do extrato bruto com acetona 65% (v.v^-1), produzindo o pó cetônico. A COP apresentou atividade ótima na faixa de pH 5,0 a 7,0 e temperatura de 5 a 45 °C, com atividade máxima em pH 6,0 e 35 °C. A enzima mostrou-se estável em temperaturas inferiores a 50 °C e pH entre 4,5 e 9,0, por até 24 horas. A peroxidase foi inativada após 4 horas a 80 °C e após 3 minutos a 96 °C. Esta enzima demonstra possibilidade para ser usada como reagente para diagnósticos, construção de biossensores e outros métodos analíticos em vários campos da ciência.

Palavras-chave: copaíba; enzima; extrato vegetal.

ABSTRACT

In the literature, several processes have been described to obtain peroxidases. The purpose of this work was to obtain peroxidase from Copaifera langsdorffii leaves and characterize it partially using a factorial design of experiments and univaried tests, to confirm the results obtained by the factorial design of experiments. Peroxidase activity was measured using the guaiacol: hydrogen peroxide system. The isolated peroxidase presented 81.6% of horseradish peroxidase activity and was easy to obtain from leaves of an abundant tree distributed all over the country. Semi-purified peroxidase (COP) was precipitated with acetone 65% (v.v^-1) of the crude extract, obtaining the acetone powder. The COP optimum reaction pH values were between 5.0-7.0 and the temperatures between 5 and 45 °C, with a maximum activity at pH 6.0 and 35 °C. The enzyme was stable in temperatures below 50 °C and pH from 4.5 to 9.0 for up to 24 hours. The peroxidase was inactivated after 4 hours at 80 °C and after 3 minutes at 96 °C. This enzyme can possibly be used as a diagnostic reagent, biosensor and for other analytical methods in several fields of Sciences.

Keywords: copaiba; enzyme; vegetal extract.

1 Introdução

As peroxidases (E.C. 1.11.1.7, doador H₂O₂ oxidorredutase) catalisam a redução do peróxido de hidrogênio ou outro peróxido orgânico, enquanto um doador de elétrons é oxidado. São abundantes em vários organismos incluindo as plantas superiores, com múltiplas isoformas sintetizadas e reguladas por estímulos diversos^8,22. Nas últimas décadas inúmeros trabalhos têm estudado as peroxidases de plantas para determinar as funções bioquímicas das isoperoxidases^4,21. Existe a possibilidade de que a medida da atividade de peroxidase em extrato de plantas não reflita sua real atividade in vivo⁷ e a determinação do substrato específico in vivo permanece como ponto crucial para estabelecer o papel fisiológico das isoperoxidases aniônica, catiônica ou neutra^2,10,26,33.

Tem sido identificada a importância fisiológica da peroxidase no controle do crescimento, lignificação¹, biossíntese da parede celular^27,31, defesa contra patógenos e esta enzima pode ainda causar mudanças indesejáveis no aroma, gosto, cor, textura e também a perda de nutrientes em alimentos^14,29,30,32.

A peroxidase tem sido utilizada em biotecnologia e várias outras áreas da ciência, para estabelecimento de diagnósticos clínicos e avaliação de processos patológicos^{6,9,11,12,16,22,25}, em análise de qualidade dos alimentos^3,23,30,32, na construção de biossensores para análise qualitativa e quantitativa de formulações farmacêuticas, cosméticas e outras análises que envolvam a presença ou a formação de peróxidos e outros processos enzimáticos^{5,24,28,34,35,36}.

Devido à ampla utilização das peroxidases há um interesse crescente por novas fontes desta enzima. O Brasil possui ampla variedade de vegetais que podem se constituir em fonte inesgotável de enzimas^34,35. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo extrair e caracterizar parcialmente a peroxidase de folhas de Copaifera langsdorffii (COP), visando obter nova fonte de peroxidase com potencial para uso em diversas áreas.

2 Material e métodos

2.1 Tecido fonte

A peroxidase foi extraída de folhas de Copaifera langsdorffii Desf., que foram colhidas de árvores da UNICAMP (Universidade Estadual de Campinas), pela manhã (até 9 horas), lavadas e em seguida utilizadas para extração enzimática.

2.2 Obtenção do extrato enzimático bruto

O extrato enzimático bruto foi obtido de acordo com procedimento descrito por JACKSON e RICARDO¹³, com modificações. As folhas de C. langsdorffii foram pesadas na proporção de 1 g de folha para 4 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 gelado (5 °C). A amostra foi colocada em liquidificador para homogeneização por 5 minutos, em baixa rotação. Em seguida foi filtrada em gaze com diâmetro reduzido através de 6 dobras, sendo o filtrado recolhido em banho de gelo e centrifugado a 11.000 g, a 5 °C, por 15 minutos.

2.3 Purificação parcial da peroxidase de folhas de C. langsdorffii (COP)

A COP foi obtida a partir do extrato enzimático bruto. A enzima foi extraída por precipitação com acetona 65% (v.v^-1) gelada, de acordo com a metodologia descrita por MARIN e CANO¹⁹. Foi testada também a precipitação da peroxidase com etanol 65% (v.v^-1) e com sulfato de amônio a 90% (p.v^-1) de saturação, segundo metodologia descrita por MOULDING et al.²⁰. Foram efetuadas extrações seqüenciais, observando-se o mesmo período de coleta das folhas e procurando-se manter condições idênticas em cada extração, para obtenção da enzima semi-purificada.

2.4 Determinação da atividade da peroxidase

A atividade da peroxidase foi determinada segundo KHAN e ROBINSON¹⁵. Utilizou-se como meio de reação: 1,5 mL de guaiacol 1% (v.v^-1); 0,4 mL de H₂O₂ 0,3% (v.v^-1), 0,1 mL do extrato enzimático ou da enzima parcialmente purificada e 1,2 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,0. A reação foi acompanhada durante, 5 minutos, a 30 °C em espectrofotômetro BECKMAN UV/VIS, série DU-70. A atividade de peroxidase foi expressa em unidade (atividade capaz de alterar 0,001 de absorbância a 470 nm) por minuto (U.min^-1) e foi calculada usando-se dados relativos à porção linear da curva entre 0,1 e 0,7 unidades de absorbância, com leituras em triplicata.

2.5 Caracterização parcial da COP

Determinação das condições ótimas de pH e temperatura

Para determinação das condições ótimas de atividade da COP através de teste univariável, os ensaios foram realizados usando-se solução de 0,2% da COP, mantendo-se a temperatura e variando-se o pH das soluções tampão de 4,0 a 9,0, com intervalo de uma unidade em cada ensaio. As temperaturas utilizadas foram 5, 15, 25, 35, 45 e 65 °C, num total de 36 ensaios. Foram realizados também testes através de planejamento experimental, com 11 ensaios, usando-se valores de pH e temperatura propostos pelos níveis das variáveis indicadas no modelo.

Determinação da estabilidade da COP

Foi utilizada solução de 0,2% da COP em ensaios através de teste univariável com períodos de incubação da enzima de 3, 6, 9 e 24 horas, variando-se o pH dos tampões de 3,0 a 9,0 com intervalos de uma e meia unidades e temperaturas de 8, 20, 50 e 65 °C, num total de 96 experimentos. Utilizou-se também o planejamento experimental, com 44 ensaios, com valores de pH e temperatura propostos pelos níveis das variáveis indicadas no modelo. Foi ainda observado o comportamento da COP a 80 °C e em ebulição (96 °C).

Análise estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada através de software STATISTICA, utilizando-se Experimental Design.

3 Resultados e discussão

3.1 Purificação parcial da COP

Os resultados da purificação parcial da peroxidase de folhas de C. langsdorffii (COP) demonstraram que o sulfato de amônio foi o agente precipitante mais eficiente, seguido da acetona e etanol (Tabela 1). A acetona foi escolhida como agente precipitante, por ser mais eficiente que o etanol e apresentar eficiência semelhante a do sulfato de amônio. A acetona apresenta vantagem sobre o sulfato de amônio, pois o precipitado não necessita de diálise e concentração por liofilização. Isto é importante pois reduz o tempo e custo dos experimentos e ainda o risco da diminuição da atividade da peroxidase.

A COP, peroxidase semi-purificada por precipitação com acetona, mostrou atividade de 81,6% da horseradish peroxidase, nas mesmas condições experimentais.

3.2 Influência do pH e temperatura sobre a atividade da COP

A COP mostrou atividade ótima em pH de 4,0 a 7,0 e temperatura de 5 a 45 °C, com atividade máxima em pH 6,0 e 35 °C. A enzima ainda mostrou atividade em pH 4,0 a 45 °C e diminuição da atividade em temperatura acima de 50 °C (Tabela 2). WRIGHT e NICELL³⁶ encontraram atividade ótima em pH 6,4 para peroxidase de soja e segundo LIN et al.¹⁸ o pH ótimo da peroxidase de folhas de Ipomoea cairica foi 6,0 e a temperatura 50 °C.

O planejamento experimental tem como objetivo reduzir o número de experimentos a serem realizados, sem prejuízo da confiabilidade dos resultados. Assim neste trabalho compararam-se os resultados obtidos por meio de teste univariado (Tabela 2) e de planejamento experimental (Tabela 3), para validação do uso do planejamento experimental para a COP, que tem sua primeira descrição neste trabalho. Os resultados foram similares, indicando que o planejamento experimental é aplicável ao estudo da COP.

3.3 Influência do pH, temperatura e tempo de incubação sobre a estabilidade da COP

Os resultados obtidos por teste univariável estão descritos na Tabela 4. A COP mostrou-se estável em pH de 4,5 a 9,0, temperaturas até 50 °C por um período de 24 horas. A COP foi inativada após 4 horas a 80 °C e após 3 minutos a 96 °C. Os dados obtidos por planejamento experimental (Tabela 5) também mostraram inativação da COP a 80 e a 92,3 °C e estabilidade da enzima em pH de 4,5 a 8,5 e temperatura até 50 °C. Estes resultados foram semelhantes aos obtidos por teste univariado.

Observando-se os resultados é possível verificar que a COP apresenta estabilidade semelhante a outras peroxidases como a de folhas de Ipomoea cairica, a HRP¹⁸ e a peroxidase de folhas de Vitis pseudoreticulata¹⁷.

A estabilidade de peroxidases é muito importante para sua utilização em diversas áreas da ciência, quanto maior a estabilidade e a atividade enzimática, melhor a capacidade de aplicação da enzima em métodos diversos.

4 Conclusões

A COP apresentou atividade ótima na faixa de pH 5,0 a 7,0 e temperatura de 5 a 45 °C, com atividade máxima em pH 6,0 e 35 °C. A enzima mostrou-se estável em temperaturas inferiores a 50 °C e pH entre 4,5 e 9,0, por até 24 horas. A peroxidase foi inativada após 4 horas a 80 °C e após 3 minutos a 96 °C. Os resultados obtidos indicam que a folha de Copaifera langsdorffii pode ser uma nova fonte de peroxidase (COP) com atividade comparável à horseradish peroxidase. Os métodos de extração e obtenção da enzima semi-purificada, propostos neste trabalho, são simples e economicamente viáveis, possibilitando contribuir para a obtenção de peroxidase em alta escala e baixo custo. Esta enzima demonstra possibilidade de ser usada como reagente para diagnósticos, construção de biossensores e outros métodos em vários campos da ciência.

Agradecimentos

Os autores são gratos a CAPES pela bolsa de estudos de H. P. F. Maciel e pelo suporte oferecido pela UNICAMP.

Recebido para publicação em 16/11/2004

Aceito para publicação em 6/7/2006 (001440)

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*

A quem a correspondência deve ser enviada

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Set 2007
• Data do Fascículo
  Jun 2007

Histórico

• Aceito
  06 Jul 2006
• Recebido
  16 Nov 2004