Priming previne a insuficiência renal aguda nefrotóxica através da estimulação do mecanismo de defesa antioxidante

RESUMO

Introdução:

Priming é um mecanismo de proteção induzida pela exposição anterior de uma célula ou órgão a baixas ou mesmas concentrações de uma substância tóxica.

Objetivo:

analisar o mecanismo de priming induzido pela exposição a gentamicina em células tubulares proximais humanas e na insuficiência renal aguda (IRA).

Métodos:

Células tubulares foram expostos a 2 mM de gentamicina durante 24 horas, enquanto ratos Wistar foram expostas a 40 mg/kg durante 3 dias. Depois de uma semana, as células foram expostas à mesma concentração durante 24h e os ratos durante dez dias. Os animais condicionados foram comparados com ratos controle e tratados com gentamicina durante 10 dias. Foram analisados parâmetros bioquímicos, o estresse oxidativo foi analisado por hidroperóxidos e proteínas carboniladas urinárias, enquanto a defesa antioxidante foi estudada pela atividade antioxidante do plasma e imunomarcação e atividade da catalase, superóxido dismutase, heme oxigenase-1 (HO-1) nos rins. Necrose, apoptose, proliferação e expressão da endotelina-1 (ET-1) e HO-1 foram estudadas em células.

Resultados:

o condicionamento dos animais inibiu o aumento da creatinina, ureia, excreção urinária de sódio e de proteína induzida por gentamicina. Bosentana, antagonista do receptor ET-1, e hemin, indutor de HO-1, potencializaram a inibição. O mecanismo de proteção foi mediado pela indução de enzimas antioxidantes HO-1, catalase e SOD atividade e redução do estresse oxidativo. O condicionamento inibiu a morte celular e induziu a proliferação via produção de ET-1.

Conclusão:

o mecanismo de condicionamento é persistente e multifactorial, o estímulo da defesa antioxidante poderia mimetizar o processo de condicionamento e impedir a IRA.

Palavras-chave:
antioxidantes; estresse oxidativo; gentamicinas; lesão renal aguda; priming de repetição

ABSTRACT

Introduction:

Priming is the mechanism of protection induced by a previous exposition of a cell or organ to low or equal concentrations of a toxic substance.

Objective: To analyze the mechanism of priming induced by the previous exposition to gentamicin in human proximal tubular cells and nephrotoxic acute renal failure (ARF).

Methods:

Wistar rats and tubular cells were exposed to gentamicin 2mM during 24h or 40 mg/kg during 3 days and after one rest week were exposed to the same concentration during 24h in cells and additional ten days in rats. The primed animals were compared to control rats receiving vehicle and GENTA animals treated with the gentamicin during the same period. Biochemical parameters were analyzed. The oxidative stress was analyzed by urinary hydroperoxides and carbonylated protein while antioxidant defense was studied by antioxidant activity of the plasma (FRAP), catalase, superoxide dismutase, heme-oxygenase 1 (HO-1) immunostaining and enzymatic activity in kidney. Necrosis, apoptosis, proliferation, endothelin 1 (ET-1) and HO-1 expression were studied in cells.

Results:

Priming of the animals inhibited the increase in creatinine, urea, sodium excretion and urinary protein induced by gentamicin. Bosentan, ET-1 receptor antagonist, and hemin, HO-1 inducer, potentiate the inhibition. The mechanism of protection was mediated by induction of the antioxidant enzymes HO-1, catalase and SOD activity and oxidative stress reduction. Priming inhibited cell death and induced proliferation through ET-1 production.

Conclusion:

Priming is a persistent and multifactorial mechanism, the stimulation of the antioxidant defense could mimics partially the priming process and prevent the ARF.

Keywords:
acute renal failure; antioxidants; gentamicins; oxidative stress; repetition priming

Introdução

Células e tecidos submetidos a estímulos sub-letais dão início a respostas adaptativas que conferem proteção contra outros estímulos de intensidade igual ou superior. Alguns autores já descreveram este fenômeno, dando-lhe o nome de priming ou autoproteção. Células tubulares expostas a doses sub-letais de S-(1,2-diclorovinil) L-cisteína ficam protegidas contra doses letais subsequentes deste agente,^1-3 principalmente através de proliferação celular e reparo renal.⁴ Camundongos tratados com exposição sub-crônica a clorofórmio posteriormente submetidos a dosagem letal do composto demonstraram 100% de sobrevivência e elevação da capacidade antioxidante.⁵

Um mecanismo de proteção semelhante chamado pré-condicionamento foi proposto para lesões induzidas por hipóxia. O pré-condicionamento hipóxico protege o órgão contra outro insulto isquêmico.⁶ Tal efeito foi observado em diferentes órgãos, como rins⁷ e coração.⁸ O mecanismo do pré-condicionamento envolve a modulação da capacidade antioxidante, a inibição do stress oxidativo e da apoptose e a melhora do fluxo sanguíneo para os órgãos.^7,9

A gentamicina é um antibiótico aminoglicosídeo endovenoso amplamente utilizado em unidades de terapia intensiva. Seus principais efeitos colaterais são ototoxicidade e nefrotoxicidade, fatores que limitam seu uso.

A nefrotoxicidade por gentamicina é uma causa conhecida de insuficiência renal aguda (IRA), observada em 10-20% dos pacientes tratados com o medicamento.¹⁰ A nefrotoxicidade por gentamicina é caracterizada por necrose tubular proximal em consequência do acúmulo do fármaco em nível celular,¹¹ reduções acentuadas da taxa de filtração glomerular (TFG), do coeficiente de ultrafiltração (Kf) e do fluxo sanguíneo renal.¹² A gentamicina estimula o stress oxidativo e a formação de radicais livres nos rins.¹³ Além disso, o fármaco induz um processo inflamatório significativo que ajuda a amplificar sua citotoxicidade.

Fatores de risco como desidratação, uso concomitante de furosemida, agentes de contraste e envelhecimento podem elevar o risco de IRA nefrotóxica.¹⁴

Várias estratégias foram investigadas para tratar ou prevenir a nefrotoxicidade por gentamicina em modelos animais, sobretudo com o uso de substâncias antioxidantes naturais, contudo sem grande uso na prática clínica.^15,16

É razoável sugerir que o priming com antibióticos poderia tratar ou prevenir a IRA nefrotóxica, uma vez que eleva o risco de resistência, mas o entendimento do mecanismo atuante no priming poderia estimular o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento ou prevenção da intercorrência e talvez aumentar o uso de antibióticos nefrotóxicos, particularmente em unidades de terapia intensiva.

O presente estudo pretende determinar o mecanismo de proteção induzido pelo priming de células tubulares proximais humanas e rins de ratos com gentamicina. Observamos que a exposição das células à gentamicina inibiu necrose e apoptose e aumentou a proliferação celular. Estes efeitos foram potencializados pela indução com HO-1 mais HEMINA e o bloqueio do receptor de endotelina-1 com bosentana.

In vivo, o priming dos rins de ratos com gentamicina preveniu contra IRA e inibiu o dano oxidativo de lipídios e proteínas no tecido renal. Houve um aumento na atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase, além de elevação na expressão e na atividade da HO-1 (HSP 32) nos rins.

Materiais e métodos

Experimentos in vitro

Cultura celular: as células tubulares proximais humanas (HK-2) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco/mistura nutriente F12 (DMEM/F12, GIBCO/Life Technologies, EUA) com soro fetal bovino a 10% (SFB, Gibco/Life Technologies), NaHCO₃ (24 mM), HEPES (10 mM) e penicilina/estreptomicina (50.000 U/L) (Gibco/Life Technologies).

Grupos experimentais: no estágio de semiconfluência, o meio foi substituído por DMEM sem SFB e as células foram tratadas como descrito a seguir (quatro culturas por grupo): Controle (CTL): as células foram cultivadas em DMEM por 24 horas. Gentamicina: as células foram tratadas com gentamicina (2 mM) por 24 horas. Priming (PI): as células foram tratadas com gentamicina (2 mM) por 24 horas e após oito (PI-8d) ou dezesseis dias (PI-16d) foram novamente estimuladas com gentamicina (2 mM) por 24 horas. PI + HEMINA: as células foram tratadas com gentamicina (2 mM) e concomitantemente expostas a HEMINA (indutor de HO-1, 0,05 ou 25 µM), (Sigma-Aldrich, MO, EUA) por 24 horas e após oito horas foram estimuladas com gentamicina (2 mM) e HEMINA por 24 horas. PI + ZPP: as células foram tratadas com gentamicina (2 mM) e concomitantemente expostas a ZPP (zinco protoporfirina, inibidor de HO-1, 10 µM), (Sigma-Aldrich, MO, EUA) por 24 horas e após oito horas foram novamente tratadas com gentamicina (2 mM) e ZPP por 24 horas. Gentamicina + BOS: as células foram tratadas com gentamicina (2 mM) e bosentana (antagonista não-específico da endotelina-1, 10 nM), (Actelion, Allschwil, Suíça) por 24 horas. PI + BOS: as células foram tratadas com gentamicina (2 mM) e bosentana (antagonista da endotelina-1, 10 nM) por 24 horas, e após oito dias foram novamente tratadas com gentamicina (2 mM) e bosentana por 24 horas.

Experimentos de viabilidade celular: a viabilidade celular foi determinada pela exclusão dos corantes fluorescentes (Sigma-Aldrich, EUA).¹⁷ As suspensões celulares foram incubadas em 0.3 µg/mL). As células que emitiram fluorescência verde (brometo de etídio) foram consideradas viáveis, e aquelas que emitiram fluorescência vermelha (laranja de acridina) foram consideradas inviáveis (necróticas). As suspensões celulares foram observadas sob microscopia de fluorescência em ampliação de 400X, e 200 células por frasco de cultura foram contadas. As células inviáveis foram descritas em função percentual em relação à contagem celular total.

Apoptose: o número de células apoptóticas foi determinado com o uso do corante HOE 33342 [Bisbenzimide HOE 33342 (2'-[4-etoxifenil]-5-[4-metil-1-piperazinil]-2,5'-bi-1H-benzimidazol) tricloridrato] (Sigma-Aldrich, EUA). As suspensões celulares foram incubadas em with 10 µL de solução de HOE 33342 (1,0 mM) por 15 minutos para corar a cromatina.¹⁸ As células foram observadas sob microscopia óptica. As células azuis foram consideradas não-apoptóticas, enquanto as células com cromatina foram classificadas como apoptóticas. Foram contas pelo menos 100 células por frasco de cultura. Os resultados foram relatados em função percentual de células apoptóticas.

Ensaio de proliferação: o sal de tetrazólio (MTT - brometo de 3-(4, 5-dimetiliazol-2)-2,5-difenil-tetrazólio) (Sigma-Aldrich, EUA) é reduzido pelas células vivas, resultando em formazana intracelular de cor púrpura que é solubilizada e quantificada por espectrofotometria. Mil células foram semeadas em placas com 96 poços e após 24 horas submetidas aos seus respectivos protocolos. Durante quatro dias, uma solução de MTT (5mg/ml) foi somada à placa com poços e incubada por três horas. Após esse período, 100 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) foram acrescentados para solubilizar o MTT e a leitura de absorvância foi de 540 nm. Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias.

Western Blot: córtex renal foi homogeneizado em 200 µl de tampão RIPA. Quarenta microgramas de proteína foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio a 10% e transferidos eletroforeticamente para uma membrana de PVDF com o auxílio de uma célula de transferência eletroforética Trans-Blott SD Semi-Dry (BIO-RAD, Hercules, CA).

Sítios ligantes não específicos foram bloqueados com 5% de albumina de soro bovino em solução TBS. Immunoblots foram incubados durante a noite a 4 ºC com os seguintes anticorpos primários: endotelina-1 (1:500, ABCAM, Cambridge, Reino Unido), tubulina (1:1000), GAPDH (1:1000) (Cell Signaling, MA, EUA) e HO-1 (1:500, Enzo Life Science, EUA). Após a lavagem, as membranas foram incubadas por duas horas a 4°C em anticorpo secundário conjugado a peroxidase de rábano (1:10000, Merk Millipore, MA, EUA). Bandas específicas de proteínas foram visualizadas com reagentes quimioluminescentes Immobilon (Merk Millipore, MA, EUA).

PCR em tempo real: o RNA total foi purificado com o kit TRIZOL (Life Technologies, Gaithersburg, MD, EUA). Dois microgramas de RNA total foram tratados com DNase (RQ1 RNase-Free DNase; Promega, Madison, WI, EUA). A transcrição reversa foi feita com kit de cDNA de alta capacidade de transcrição reversa (Life Technologies). A amplificação em tempo real foi realizada utilizando kit GeneAmp 7500/ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com iniciadores de reação seletivos para pré-pró endotelina (ppET-1), Heme oxigenase 1 (HO-1) e gene de manutenção β-actina. As sequências de iniciadores foram ppET-1 (sense: 5`-GAG AAA CCC ACT CCC AGT CCG GGA-3` e antisense: 5`-GAT GTC CAG GTG GCA GAA GTC CTA-3`), β-actina (sense: 5'- CCT CTA TGC CAA CAC AGT GC - 3' e antisense: 5' - ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC - 3') e HO-1 (sense: 5' AGA GGG AAT TCT CTT GGC TGG CTT - 3' e antisense: 5' ATG CCA TAG GCT CCT TCC TCC TTT-3'). A acumulação do produto do PCR em tempo real foi monitorizada através do corante intercalante SYBR Green I (Life Technologies).

Para fins de representação gráfica, a variação da ordem de grandeza foi então determinada pelo método 2-(ΔΔCt) segundo protocolos publicados¹⁹ e recomendações do fabricante.

Concentração de bilirrubina: os níveis de bilirrubina foram determinados com o uso de ácido sulfanílico diazotado, formando azobilirrubina.²⁰ O composto formado foi mensurado por espectrofotometria a 560 nm. Os resultados foram expressos em µg/mg de proteína.

Experimentos in vivo

Ética animal: o protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética da Universidade Federal de São Paulo (0132/12). Cada grupo experimental foi composto por três animais e cada grupo experimental foi repetido três vezes.

Grupos experimentais: ratos Wistar machos pesando 200-250 g foram divididos em três grupos: controle (CTL): ratos que receberam injeção intraperitoneal (IP) de PBS por 10 dias. Gentamicina: ratos que receberam injeções IP de gentamicina (40 mg/kg de peso corporal, GARAMYCIN, Schering-Plough, EUA) por 10 dias. Priming (PI): animais preparados com injeções IP de gentamicina (40 mg/kg de peso corporal) por três dias e que, após uma semana, receberam injeções de gentamicina por mais 10 dias. PI + HEMINA: animais preparados com injeções IP de gentamicina e HEMINA (0,1 mg/kg de peso corporal) por três dias e que, após uma semana, receberam injeções IP de gentamicina e HEMINA por mais 10 dias. PI + BOS: animais preparados com injeções IP de gentamicina e bosentana (10 nM) por três dias e que, após uma semana, receberam injeções de gentamicina e bosentana por mais 10 dias.

Após 1 (Linha Basal) e 10 dias (Pós-T) do início dos protocolos experimentais, amostras de sangue foram colhidas da veia lateral da cauda. Os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas por 24 horas para coleta de urina. Os animais foram sacrificados 20 dias após o início do protocolo experimental e tiveram seus rins removidos para análise histológica.

Análise bioquímica: os níveis séricos de creatinina, ureia e proteína na urina foram verificados por espectrofotometria segundo os procedimentos descritos para kits diagnósticos comercialmente disponíveis (Labtest Diagnóstica, Minas Gerais, Brasil). A creatinina foi determinada por método colorimétrico baseado na reação de Jaffé.²¹ A ureia foi determinada por ensaio colorimétrico baseado na atividade da urease. A proteína urinária foi determinada por método colorimétrico baseado em vermelho de pirogalol/molibdato. Os resultados foram expressos em mg/dl para creatinina e ureia e mg/24 h para proteína urinária. As concentrações urinárias de sódio foram determinadas com um fotômetro de chama Micronal B462 (São Paulo, Brasil). A fração de excreção de sódio (FENa) foi expressa em porcentagem.

Imunoistoquímica: Os tecidos incluídos em parafina foram cortados em seções de 4 µm de espessura em micrótomo rotativo (Leica Microsystems, Herlev, Dinamarca). Os cortes de tecido renal foram então desparafinados e reidratados. Em seguida, foram aquecidos em solução de recuperação (1 mmol/l Tris, pH 9,0, com 0,5 mM EGTA) por 10 minutos para identificação dos antígenos. Ligações não-específicas foram evitadas pela incubação dos cortes em PBS com 1% de BSA, 0,05% de saponina e 0,2% de gelatina. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 5% de H₂O₂ em metanol absoluto por 10 minutos a temperatura ambiente. Os cortes foram incubados com anticorpos primários para heme-oxigenase 1 (HO-1, Stressgen, Assay Designs, Michigan, EUA), endotelina-1, catalase e superóxido dismutase 1 (Abcam, Cambridge, Reuni Unido) em diluição de 1:200 para ambos, durante a noite a 4°C. Após a lavagem, os cortes foram incubados em polímero marcado com peroxidase de rábano conjugado a anticorpo secundário (Dako, Dinamarca) por uma hora em temperatura ambiente. Os sítios das reações anticorpo-antígeno foram visualizados com 0,5% de tetracloreto de 3,3′-diaminobenzidina (DAKO, Dinamarca) dissolvido em água destilada com 0,1% de H₂O₂.

Dez cortes por animal ao longo do córtex renal foram analisados e contados a partir da marcação (corados em marrom claro a escuro). Os valores obtidos foram expressos em unidades arbitrárias.

Hidroperóxido urinário: os níveis urinários de hidroperóxido foram medidos por oxidação ferrosa com alaranjado de xilenol e ensaio FOX2 para hidroperóxido lipídico.²² Alíquotas de 100-µl de urina foram prontamente transferidas para frascos de micro-centrifugação com a adição de 900 µl de solução FOX2 compostas por alaranjado de xilenol (100 µM), hidroxitolueno butilado (4,4 mM), ácido sulfúrico (25 mM) e sulfato ferroso de amônia (250 µM). Após incubação, os frascos foram centrifugados a 18,200 × g a 25 °C por 10 minutos. A absorvância do sobrenadante foi então determinada em 560 nm. O teor de hidroperóxido lipídico das amostras de urina foi determinado segundo o coeficiente molar (4,3 10⁴ M-1cm-1). Os resultados foram expressos em 10^-7 M/mg de creatinina.

Atividade da superóxido dismutase: as amostras foram colocadas em 50 mM de tampão TrisHCl (pH 8,2), 1 mM EDTA e 2mM de pirogalol em HCl (10 mM). Elevação da absorvância foi observada em 420 nm por três minutos por espectrofotometria. Uma unidade de atividade enzimática é a taxa que inibe 50% da auto-oxidação do pirogalol conforme determinado pela mudança da absorvância/min a 420 nm. O teor de proteína do lisado foi estimada e a atividade da SOD foi expressa em unidades/mg de proteína.

Atividade da catalase: a atividade da catalase nas amostras de córtex renal foi determinada segundo protocolo anteriormente descrito.²³ Os lisados de córtex renal foram dispostos em uma cubeta com tampão fosfato (pH 7,0) e H₂O₂ (30 mM). A atividade da catalase foi medida a 240 nm por um minuto utilizando espectrofotometria. O coeficiente de extinção molar da H₂O₂, 43,6 M cm-1 foi utilizado para determinar a atividade da catalase. Uma unidade de atividade foi considerada como igual a um micromol de H₂O₂ degradado por minuto e foi expressa em unidades por miligrama de proteína.

Análises de poder redutor: o poder redutor do plasma foi avaliado segundo os protocolos publicados.²⁴ Amostras de plasma foram misturadas com reagente FRAP (300 mM tampão acetato, pH 3,6, 2, 4, 6-tripiridil-s-triazina (TPTZ, 10mM) em 40mM de HCl e FeCl₃.6H₂O (20 mM)). A mistura foi incubada a 37°C por cinco minutos e a camada superior da solução foi analisada a 595 nm contra um branco de amostra. A absorvância foi comparada à curva padrão do ácido ascórbico e expressa em mM.

Medição de carbonilação proteica: a determinação da carbonilação proteica foi realizada segundo relatos anteriores.²⁵ Extratos de proteína renal foram ressuspendidos em 1ml de 10 mM 2, 4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) em 2 M HCl por 1h. As amostras foram precipitadas com ácido tricloroacético (50%) e centrifugadas a 11, 000 × g por 5 minutos. Depois foram lavadas três vezes com 1 mL de etanol-acetato de etila (1:1; v/v) para remover remove os resíduos do reagente DNPH. Os precipitados finais foram dissolvidos em soluções 6 N de hidrocloreto de guanidina (1 mL) e o teor de carbonila na proteína foi determinado pela medida da absorvância de derivados da proteína 2, 4 dinitrofenilhidrazina a 365 nm, utilizando um coeficiente de absorção molar de 22.000 M-1 cm-1. Os resultados foram expressos em 10^-7 M/mg de creatinina.

Peroxidação lipídica: a peroxidação lipídica foi medida pelo ensaio TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico). As substâncias reativas se combinam com o ácido tiobarbitúrico, formando um composto avermelhado. A curva do malondialdeído foi utilizada como referência, e os resultados foram expressos em mM de MDA/mg de proteína. As amostras de urina foram colocadas em solução de 0,375% ácido tiobarbitúrico, 15% ácido tricloroacético e 0,25 N HCl (Sigma, Saint Louis, EUA); então elas foram continuamente agitadas enquanto eram aquecidas a 95°C por 20 minutos e depois foram deixadas para resfriar em temperatura ambiente. A absorvância foi determinada por espectrofotometria em 535 nm.²⁶ O nível de proteínas nas amostras de urina foram avaliadas como descrito anteriormente.

Análise estatística

Os resultados foram expressos na forma de média ± EP. Os dados foram analisados por análise de variância (ANOVA) fator único seguido pelo teste de Tukey. Eventos com p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

A Figura 1 mostra que o efeito benéfico do priming sobre a viabilidade celular é prolongado. O grupo submetido a priming teve decréscimo significativo em necrose (PI-16d: 2,3 ± 0,3; Gentamicina: 25,4 ± 1,5%) e apoptose (PI-16d: 2,1 ± 0,3; Gentamicina: 19,4 ± 1,4%) em comparação aos indivíduos do grupo gentamicina. Este efeito foi observado oito ou dezesseis dias após o priming.

Figura 1
Viabilidade in vitro. Morte celular necrótica (A) e apoptótica (B) de células HK-2 em condições de controle (CTL), células submetidas apriming com gentamicina (Gentamicina, 2 mM) por 24 h e novamente expostas ao antibiótico após 8 (PI-8d) e 16 dias (PI-16d). (*) p < 0,05 em comparação a CTL. (+) p < 0,05 em comparação ao grupo Gentamicina.

Os efeitos do priming foram explicados por mais de um mecanismo,^1,4,27,28 que provavelmente interagem entre si em circunstâncias tóxicas. A Figura 2 demonstra a participação da endotelina-1 nesse mecanismo. As células pré-tratadas demonstraram expressão aumentada de pré-pró endotelina (12,0 ± 3,3 UA) (Figura 2A) em comparação às células de controle (1,2 ± 0,4 UA) e ao grupo tratado com gentamicina (5,0 ± 1,3 UA). O tratamento com bosentana bloqueou, pelo menos parcialmente, tal aumento (4,6 ± 0,6 UA). Resultados semelhantes foram observados na síntese de endotelina-1 (Figura 2B).

Figura 2
Efeito in vitro da ET-1. Expressão de ppET-1 medida por PCR em tempo real (A), síntese de ET-1 avaliada por western blot e quantificação gráfica (B), proliferação celular medida por ensaio MTT (C) e morte celular necrótica e apoptótica (D) em células HK-2 em condições de controle (CTL), estimuladas com gentamicina (Gentamicina, 2 mM), submetidas a priming com gentamicina (PI), submetidas a priming com gentamicina e concomitantemente tratadas com o antagonista do receptor da ET bosentana (PI+BOS), ou tratadas com bosentana apenas (BOS, 10 nM). (*) p < 0,05 em comparação a CTL. (#) p < 0,05 em comparação a PI e (+) p < 0,05 em comparação a Gentamicina.

As células submetidas a priming exibiram aumento na proliferação em relação ao grupo gentamicina após três dias em condições de cultura. O bloqueio dos receptores de endotelina-1 com bosentana evitou tal aumento, sugerindo um efeito direto da ET-1 sobre a proliferação observada nas células pré-tratadas (Figura 2C).

Em condições experimentais, as células pré-tratadas exibiram reduções significativas de necrose (14,1 ± 0,8%) e apoptose (12,5 ± 0,8%) em comparação aos níveis de necrose (27,4 ± 0,4%) e apoptose (22,8 ± 0,7%) observados no grupo gentamicina. O tratamento com bosentana potencializou de forma significativa o efeito protetor do priming contra necrose (7,3 ± 0,3%) e apoptose (7,1 ± 0,6%) (Figura 2D).

A Figura 3 exibe a enzima antioxidante heme-oxigenase 1. Não houve diferenças na expressão de HO-1 na maioria dos grupos, exceto pelas células HK-2 pré-tratadas estimuladas com Hemina, como já era esperado (Figura 3A). Não obstante, os níveis da proteína HO-1 estavam reduzidos nas células expostas a gentamicina, condição esta revertida nas células submetidas a priming expostas ou não a hemina (Figura 3B).

Figura 3
Efeito in vitro da HO-1. A expressão da HO-1 foi medida por PCR em tempo real (A), a síntese de HO-1 foi medida por western blot (B), a proliferação celular por ensaio MTT (C) e a morte celular necrótica e apoptótica (D) em células HK-2 sob condições de controle (CTL), estimuladas com gentamicina (Gentamicina, 2 mM), submetidas a priming com gentamicina (PI), submetidas a priming com gentamicina e concomitantemente tratadas com indutor de HO-1 hemina (PI+HEMINA), ou submetidas a priming com gentamicina e concomitantemente tratadas com inibidor de HO-1 ZPP (PI+ZPP). (*) p < 0,05 em comparação a CTL. (+) p < 0,05 em comparação a Gentamicina; (#) p < 0,05 em comparação a PI.

O efeito da HO-1 sobre a proliferação é analisado na Figura 3C. As células submetidas a priming exibiram aumento na proliferação, mas este efeito foi embotado pelo tratamento com Hemina, sugerindo que a atividade da HO-1 não está envolvida na proliferação celular.

Sob tais condições experimentais, o grupo HK-2 pré-tratado exibiu redução de necrose (15,6 ± 0,4%) e apoptose (15,9 ± 0,9%) em relação aos níveis de morte celular observados nas células estimuladas com gentamicina. A Hemina (25 µM) potencializa o efeito do priming sobre necrose (10,2 ± 1,3%) e apoptose (9,0 ± 0,5%). Entrementes, ZPP (10 µM) reverteu o efeito do priming sobre necrose (24,2 ± 0,6%) e apoptose (24,7 ± 1,0%) (Figura 3D).

Os parâmetros bioquímicos observados nos diferentes grupos na linha basal e pós-T encontram-se na Tabela 1. Não foram observadas diferenças entre os grupos analisados na linha basal.

Tabela 1
Parâmetros fisiológicos

	CTL		Gentamicina		PI		PI+ HEMINA		PI+ BOS
	Linha Basal	Pós-T	Linha Basal	Pós-T	Linha Basal	Pós-T	Linha Basal	Pós-T	Linha Basal	Pós-T
Cr (mg/dL)	0,39 ± 0,08	0,45 ± 0,07	0,34 ± 0,01	5,09 ± 0,34*	0,31 ± 0,04	1,55 ± 0,35#	0,31 ± 0,04	0,48 ± 0,03# +	0,53 ± 0,08	0,51 ± 0,04# +
U (mg/dL)	35,32 ± 2,43	34,28 ± 2,52	34,99 ± 3,22	144,25 ± 1,5*	35,45 ± 2,57	101,33 ± 2,7#	35,42 ± 2,53	45,81 ± 1,62# +	42,03 ± 6,19	46,53 ± 3,46# +
Proteinúria (mg/24hs)	7,42 ± 0,41	6,81 ± 0,61	9,11 ± 1,12	34,29 ± 3,44*	4,21 ± 2,32	10,20 ± 2,01#	7,2 ± 1,6	17,0 ± 0,9#	7,24 ± 1,64	17,01 ± 0,91#
FENa (%)	0,43 ± 0,18	0,50 ± 0,11	0,31 ± 0,05	2,97 ± 0,61*	0,22 ± 0,03	1,46 ± 0,33#	0,21 ± 0,06	0,71 ± 0,01# +	0,30 ± 0,05	0,56 ± 0,08# +
VU (ml)	8,15 ± 0,61	8,55 ± 0,73	12,12 ± 1,54	21 ± 2,35*	5,13 ± 2,30	7,81 ± 1,11#	8,82 ± 0,71	13,30 ± 0,82#	7,82 ± 1,74	9,62 ± 2,42#
PC (g)	224 ± 0,51	245 ± 0,62	224 ± 0,87	241 ± 0,7	233 ± 0,54	251 ± 0,59	226,6 ± 0,57	248,3 ± 0,45	226,6 ± 0,41	246,3 ± 0,74

• ^*
  p < 0,05 x CTL;
• ^#
  p < 0,05 x Gentamicina
• ⁺
  p < 0,05 x PI;
• Dados expressos como média ± MEP. Os grupos experimentais foram comparados por análise de variância (ANOVA) fator único e teste de Tukey. O nível de significância para a hipótese de nulidade foi configurado em 5% (p < 0,05). PC (peso corporal), VU (volume urinário), Cr (creatinina sérica), U (ureia sérica), FENa (excreção da fração de sódio) foram analisadas nos grupos CTL, Gentamicina, PI, PI + HEMINA e PI + BOS.

O grupo gentamicina mostrou aumento significativo em creatinina sérica, ureia, proteína urinária, volume e FENa no período pós-T, mas nenhuma diferença foi observada no peso corporal dos animais. Nos animais pré-tratados com antibiótico, o aumento dos parâmetros bioquímicos foi significativamente embotado. Além disso, o tratamento dos animais submetidos a priming com bosentana ou hemina potencializou o efeito protetor do priming segundo parâmetros bioquímicos. Houve redução de creatinina sérica, ureia e FENa nos grupos PI+HEMINA e PI+BOS em relação ao grupo PI, mas não em proteína urinária ou volume, como mostrado na Tabela 1. Estes resultados mostram que o tratamento com hemina e bosentana potencializou o efeito do priming também em condição in vivo.

A Figura 4 mostra a imunoistoquímica do córtex renal dos diferentes grupos de animais. Nos animais submetidos a priming (17,6 ± 2,1%) e tratados com gentamicina (54,5 ± 2,7%), como observado nas células tubulares, houve aumento significativo na coloração para endotelina-1 em relação ao grupo de controle (0,87 ± 0,39%).

Figura 4
Análise imunoistoquímica. Cortes em microscopia óptica (4 µm) de imunoistoquímica renal corada com anticorpos contra heme-oxigenase 1 (HO-1), catalase (CAT), superóxido dismutase 1 (SOD) e endotelin-1 (ET-1) em ratos de controle (CTL), animais estimulados com gentamicina por 10 dias (GENTAMICINA), animais submetidos a priming com gentamicina por 3 dias e, depois de uma semana, estimulados com antibiótico por 10 dias (PI). (*) p < 0,05 em comparação ao grupo CTL.

Como observado in vitro, os animais submetidos a priming (9,7 ± 3,6%) e tratamento com gentamicina (8,5 ± 2,5%) mostraram elevações na coloração para HO-1 em relação ao grupo de controle (2,7 ± 1,1%). Curiosamente, outras enzimas antioxidantes como catalase e superóxido dismutase 1 também apresentaram elevação em relação ao grupo de controle e aos animais tratados com gentamicina, respectivamente.

A heme-oxigenase degrada o grupo heme em CO, ferro livre e biliverdina, que é rapidamente convertida em bilirrubina pela bilirrubina redutase.²⁰ Analisamos indiretamente a atividade da HO-1 pelo teor de bilirrubina no extrato de córtex renal (Figura 5A). O teor de bilirrubina no córtex renal foi mais elevado nos grupos gentamicina (1,69 ± 0,16 µg/mg de proteína) e priming (2,22 ± 0,22 µg/mg de proteína) em relação ao grupo de controle (0,63 ± 0,11 µg/mg de proteína).

Figura 5
Atividade antioxidante in vivo. (A) Concentração de bilirrubina em unidades de µg/ml de proteína, (B) atividade da SOD em unidades de U/ mg de proteína, (C) atividade da catalase em unidades de U/mg de proteína no rim e (D) quantificação da fração antioxidante do plasma em mM dos animais do grupo de controle (CTL), animais estimulados com gentamicina por 10 dias seguidos (Gentamicina, 40 mg/kg) e animais submetidos a priming com gentamicina por 3 dias e estimulados novamente com gentamicina por 10 dias após uma semana de repouso (PI). Linha basal (barras brancas): valores de todos os grupos antes da estimulação, Pós-T (barras pretas): valores obtidos após estimulação com gentamicina em todos os grupos. (*)p < 0,05 em comparação a CTL. (+) p < 0.05 em comparação a grupo Gentamicina.

As Figuras 5B e C mostram as atividades de outras enzimas antioxidantes. Houve aumento significativo na atividade da catalase nos animais submetidos a priming (2,35 ± 0,03 U/mg de proteína) em relação ao grupo de controle (1,49 ± 0,06 U/mg de proteína) e aos animais tratados com gentamicina (1,5 ± 0,1 U/mg de proteína) (Figura 5B). A atividade da superóxido dismutase também aumentou apenas nos animais submetidos a priming (PI: 7,33 ± 0,23 U/mg de proteína) em relação aos indivíduos tratados com antibiótico e ao grupo de controle (Gentamicina: 4,06 ± 0,49; CTL: 4,34 ± 0,71 U/mg de proteína). Além disso, a fração antioxidante do plasma mostrou-se aumentada nos animais submetidos a priming (0,48 ± 0,02 mM) em comparação ao grupo gentamicina (0,26 ± 0,03 mM) e de controle (0,26 ± 0,01 mM) (Figura 5D). Com efeito, estes resultados reforçam que o priming estimula a defesa antioxidante nos rins.

A Figura 6 mostra o stress oxidativo analisado por meio dos peróxidos urinários e proteína carbonilada nos diferentes grupos.

Figura 6
Stress oxidativo in vivo. (A) Peroxidação lipídica na urina indicada por malondialdeído e expressa em unidades de nM/mg de proteína, (B) hidroperóxidos e (C) proteína carbonilada na urina expressa em unidades de M/creatinina em animais do grupo de controle (CTL), animais estimulados com gentamicina por 10 dias seguidos (Gentamicina, 40 mg/kg) e animais submetidos a priming com gentamicina por 3 dias e estimulados com gentamicina por 10 dias após uma semana de repouso (PI). valores de todos os grupos antes da estimulação, Pós-T (barras pretas): valores obtidos após estimulação com gentamicina em todos os grupos.* p < 0,05 em comparação a CTL.+ p < 0.05 em comparação a grupo Gentamicina.

Não houve diferença significativa entre os grupos na linha basal, mas os peróxidos urinários (Gentamicina: 9,0 ± 1,2; CTL: 2,1 ± 0,05 10^-7 M/mg de creatinina) e proteína carbonilada (Gentamicina: 14,1 ± 0,6; CTL: 3,3 ± 0,5 10^-7 M/mg de creatinina) se elevaram significativamente no período pós-gentamicina. O priming dos animais com gentamicina bloqueou a elevação de peróxidos urinários (PI: 4,5 ± 0,4 10^-7 M/mg de creatinina) e proteína carbonilada (PI: 7,2 ± 0,9 10^-7 M/mg de creatinina) induzida pelo antibiótico (Figuras 2A e 2B). A peroxidação lipídica seguiu o mesmo padrão. No período pós-T, houve aumento no grupo gentamicina em relação ao grupo de controle. Nos animais submetidos a priming, a peroxidação lipídica foi embotada.

Discussão

O estudo do mecanismo do priming em células e tecidos pode ajudar a prevenir ou tratar os efeitos tóxicos dos antibióticos aminoglicosídeos e outros agentes nefrotóxicos. Vários estudos demonstraram os efeitos benéficos da estimulação das defesas antioxidantes no tratamento da IRA,^15,16,29 mas até o momento as investigações sobre seu uso na prática clínica não foram suficientemente aprofundadas. Nosso estudo mostra que o mecanismo persistente e multifatorial do priming atua através da indução de enzimas antioxidantes, elevações na fração antioxidante do plasma, inibição do stress oxidativo, inibição da produção de endotelina-1^22,25 e provavelmente outros fatores ainda não determinados. Estratégias baseadas em uma única abordagem talvez não sejam suficientes.

Tanto as células tubulares como os rins de ratos resistiram à toxicidade por gentamicina. Nas células tubulares proximais humanas pré-tratadas com gentamicina, observamos uma redução significativa na necrose e na apoptose 24 horas após o priming, em achado que persistiu mesmo 16 dias após o tratamento. Além disso, observamos aumento da proliferação celular por 96 horas em comparação às células tratadas com gentamicina. Com efeito, trabalhos anteriores de nosso grupo demonstram este mesmo achado em outras linhagens celulares^30,31 assim como os trabalhos de outros autores.²⁸ Porém, demonstramos que a endotelina-1 está imbricada neste efeito. A produção de endotelina-1 foi aumentada nas células submetidas a priming. O bloqueio dos receptores da ET-1 com bosentana inibiu a proliferação, sugerindo efeito direto em exposições por longos períodos como visto no priming.

Além disso, a endotelina-1 pode apresentar efeito deletério de curto prazo, uma vez que sua expressão foi elevada no grupo gentamicina. O tratamento com bosentana em 24 horas inibiu a morte celular e potencializou o efeito inibitório do priming sobre a morte celular em 24 horas. Este achado sugere que a endotelina-1 esteja envolvida neste mecanismo de proteção, no mínimo através do estímulo da proliferação das células tubulares sobreviventes.

A endotelina-1 é produzida no rim humano principalmente no glomérulo, além de nas células tubulares.³² A ET-1 tem importantes efeitos fibróticos, inflamatórios e proliferativos sobre o tecido renal. No rim, os ratos de ambos os grupos estimulados com gentamicina e submetidos a priming com antibiótico apresentaram aumento de endotelina-1 no glomérulo e nos segmentos tubulares parcialmente bloqueados pela bosentana.

Os rins submetidos a priming apresentaram melhora da função renal, como demonstrado pelas reduções de creatinina, ureia, proteinúria e excreção de sódio. O tratamento com bosentana potencializa essa melhora na maioria dos parâmetros, exceto pela proteinúria. Além disso, os rins estimulados com gentamicina apresentaram aumento nas células inflamatórias intersticiais, em achado não observado nos rins submetidos a priming. Quando considerados conjuntamente, estes resultados corroboram a hipótese de que a endotelina-1 está imbricada no mecanismo do priming tanto in vivo como in vitro.

Lesões oxidativas estão presentes em várias causas de insuficiência renal aguda induzida por glicerol,³³ antibióticos aminoglicosídeos¹⁵ e isquemia.³⁴ Não é surpresa que a potencialização das defesas antioxidantes possa agir na prevenção da IRA.

Foi anteriormente demonstrado por nosso laboratório^30,31 que o priming de células ou tecidos com antibióticos nefrotóxicos estimula as defesas antioxidantes e inibe o stress oxidativo.

Células tubulares estimuladas com gentamicina apresentaram redução de HO-1 que ocorreu apenas parcialmente em células submetidas a priming. O tratamento de células tubulares proximais com hemina potencializou e com ZPP inibiu o efeito do priming sobre a morte celular, sugerindo que a HO-1 também participa do mecanismo de priming das células epiteliais.

Rins estimulados com gentamicina e submetidos a priming exibiram aumento da heme-oxigenase 1. A enzima catalisa o grupo heme em CO, ferro livre e biliverdina, que é rapidamente convertida em bilirrubina. O ferro livre é possivelmente sequestrado por indução da ferritina, mas o CO e a bilirrubina podem atuar como antioxidantes.²⁰ A hemina potencializou o efeito protetor nos rins de ratos submetidos a priming. Este resultado sugere que a elevação da atividade da HO-1 aprimora o efeito protetor do priming, mas não podemos descartar outros mecanismos.

As outras enzimas antioxidantes expressas nos rins incluem a superóxido dismutase, que degrada o ânion superóxido em peróxido de hidrogênio, que é metabolizado pela catalase e pela glutationa peroxidase em água e oxigênio. Houve elevação da atividade da catalase e da superóxido dismutase nos rins dos animais submetidos a priming. O peróxido de hidrogênio é um importante radical livre produzido pela célula sob estímulo de agente tóxico. Nossos resultados mostram que o aumento nos peróxidos urinários e a peroxidação lipídica induzida pela gentamicina foram embotados na urina dos animais submetidos a priming.

O principal antioxidante não-enzimáticos presente no plasma é ácido ascórbico.³⁵ Curiosamente, nossos resultados mostram que animais submetidos a priming tiveram elevação na fração antioxidante do plasma, o que indica que os efeitos do processo de pré-tratamento não se limitaram aos rins e que o estímulo da defesa antioxidante pode proteger outros órgãos. Este resultado sugere que o priming dos rins pode conferir resistência a outros órgãos também lesionados pelo antibiótico. Tal hipótese, contudo, ainda carece de confirmação.

Nosso trabalho destacou a importância do mecanismo do priming na proteção dos rins contra a IRA nefrotóxica. O pré-tratamento dos rins com gentamicina pode elevar o risco de resistência medicamentosa, mas o estímulo da defesa antioxidante ou o tratamento dos pacientes com agentes quelante pode eficientemente mimetizar o processo de priming e, talvez, servir de prevenção contra o desenvolvimento da IRA.

• FAPESP, CAPES, CNPq, FINEP, FOR

Agradecimentos

O presente trabalho contou com os apoios financeiros das seguintes instituições: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Fundação Oswaldo Ramos (FOR), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Apr-Jun 2016

Histórico

• Recebido
  29 Set 2015
• Aceito
  25 Jan 2016