Caracterização de populações geograficamente distintas da traça-das-crucíferas por susceptibilidade ao Bacillus thuringiensis Berliner e RAPD-PCR

Characterization of geographically distinct populations from plutella xylostella to B. thuringiensis berliner and RAPD-PCR

PESQUISA

Caracterização de populações geograficamente distintas da traça-das-crucíferas por susceptibilidade ao Bacillus thuringiensis Berliner e RAPD-PCR

Characterization of geographically distinct populations from plutella xylostella to B. thuringiensis berliner and RAPD-PCR

Rose G. MonneratI, ^*; Soraya C.M. Leal-Bertioli^I; David J. Bertioli^II; Tariq M. Butt^III; Domonique Bordat^IV

^IEmbrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C. Postal 02372, 70770-900 Brasilia-DF; E-mail: [e-mail]

^IIUniversidade Católica de Brasília, Pós Graduação Campus II, SGAN 916, 70790-160 Brasília-DF

^IIIUniversity of Wales Swansea, Singleton Park, Swansea, SA2 8PP, Wales, UK

^IVCIRAD-AMIS, Laboratoire Entotrop, BP 5035, 34032 Montpellier Cedex 1, France

RESUMO

Quatro populações de Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Yponomeutidae) oriundas do Brasil, Ilha da Reunião, Filipinas e Benin foram avaliadas quanto à suscetibilidade ao B. thuringiensis através de bioensaios e quanto à variabilidade genética, através de RAPD-PCR. Os dois parâmetros avaliados mostraram similaridade de resultados entre as populações, sugerindo que as mesmas devem ser bastante homogêneas, embora estejam geograficamente distantes.

Palavras-chave: Brassicaceae, Plutella xylostella, variabilidade genética, controle biológico.

ABSTRACT

Four populations of Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Yponomeutidae) isolated in Brazil, Reunion Island, Philippines and Benin were evaluated for susceptibility to B. thuringiensis. Genetic variability was accessed by RAPD analysis. Although the populations were originated from diverse geographical origins, the two evaluated parameters showed a high degree of similarity. This suggests that although the populations were geographically distant, they have a high degree of similarity.

Keywords: Brassicaceae, Plutella xylostella, genetic variability, biological control.

A traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Yponomeutidae), é considerada como uma das pragas mais importantes das plantas da família Brassicaceae no Brasil e no mundo (Talekar e Shelton, 1993). Os danos por ela causados acarretam a depreciação do produto, o atraso no crescimento da planta e mesmo a sua morte. Este inseto é originário provavelmente da região Mediterrânea e está presente nos cinco continentes. O custo para o seu controle pode representar até 50% do custo total da sua produção (Lim, 1986).

Dentre as diferentes técnicas de supressão populacional da traça-das-crucíferas, o controle químico tradicional é sem sombra de dúvida o mais empregado. Ainda que os danos por ela causados justifiquem a adoção dessa medida de controle, sua implementação traz riscos de intoxicação de produtores, animais domésticos e selvagens, pode deixar resíduos nos alimentos, que são consumidos via de regra in natura ou com pouco preparo. Também existe a possibilidade de contaminação do ambiente e danos aos inimigos naturais da praga. O uso contínuo e desordenado destes agentes pode ainda resultar na seleção de populações resistentes, existindo, na região do Distrito Federal, resistência de P. xylostella a piretróides (Castelo Branco e Guimarães, 1990).

Como alternativa ao controle químico, métodos biológicos têm sido estudados e desenvolvidos, cabendo mencionar o uso de inimigos naturais, como parasitóides, predadores e microrganismos entomopatogênicos (Monnerat e Bordat, 1998). O microrganismo mais amplamente utilizado em controle biológico é o Bacillus thuringiensis (Bt). Esta bactéria produz uma ou várias proteínas tóxicas para a traça-das-crucíferas (Monnerat et al., 1999), tendo como grande vantagem de utilização sua especificidade aos insetos sensíveis, seu efeito não poluente ao meio ambiente, sua inocuidade aos mamíferos e invertebrados e ausência de toxicidade às plantas (Whiteley e Schnepf, 1986; OMS., 1987).

Cabe salientar que existem relatos de migração da traça-das-crucíferas em várias partes do mundo, sugerindo a existência de diferentes populações, que podem ter suscetibilidades diferentes ao Bt. Trabalhos recentes têm sido realizados para verificar a variabilidade genética entre populações em diversas espécies de insetos por meio da análise molecular do DNA (Frohlich et al., 1999; Lima et al., 2002).

Este trabalho foi realizado para verificar se quatro populações de P. xylostella oriundas de diferentes partes do mundo apresentavam diferenças quanto a susceptibilidade ao B. thuringiensis e variabilidade genética, observada em reações de RAPD-PCR.

MATERIAL E MÉTODOS

Os insetos utilizados foram coletados na Ilha da Reunião, Brasil, Benin e Filipinas, e mantidos em laboratório nas seguintes condições: Temperatura: 28°C±2, fotoperíodo: 14/10 e UR: 70%.

Os testes de suscetibilidade foram realizados por meio de bioensaios, conduzidos com larvas de segundo estágio da primeira geração de P. xylostella oriundas das diferentes localidades. Folhas de couve foram mergulhadas em diluições decimais (10^-1 a 10^-8) preparadas com um formulado à base de B. thuringiensis var. kurstaki (Tabashnik et al., 1990). Para cada diluição foram feitas três repetições, contendo, cada uma, 50 larvas. A mortalidade larval foi avaliada dois e cinco dias após o início do ensaio e a CL₅₀ (concentração necessária para matar 50% da população exposta) foi calculada por meio da análise de Probit (Finney, 1971).

A variabilidade genética de P. xylostella foi obtida pela extração e amplificação do DNA. Para a obtenção do DNA foram avaliados os protocolos de extração descritos por Black et al. (1992), Langridge et al. (1991) e Möller et al. (1992).

O protocolo descrito por Black et al. (1992) foi selecionado e consistiu em (a) macerar os insetos em tampão TES (100 mM TRIS, pH 8,0, 10 mM EDTA, 2%SDS), (b) deixar o macerado em repouso por 5 minutos, (c) adicionar proteinase K e deixar a 37°C por 15 minutos, (d) sdicionar 100 ml de água e deixar 15 minutos a 37°C, (e) deixar a 94°C por 5 minutos, (f) centrifugar por 5 minutos a 13.000 rpm, (g) coletar o sobrenadante (h) estocar a –80°C.

Dez indivíduos adultos de cada população foram utilizados para os testes intra-específicos. Dez grupos de dez adultos de cada população foram utilizados para os testes inter-específicos.

Um volume de 1 ml da solução contendo o DNA do inseto foi misturado com os seguintes componentes: (1) 2,5 ml de tampão de reação (100 mM tris-HCl pH 8,8; 50 mM KCl, 15 mM Mg Cl2 e 1% de detergente não iônico), (2) 1,5 ml do oligonucleotídeo (50 ng/ml), (3) 0,25 ml dNTPs a 20 mM, (4) 0,2 ml de DNA Taq Polimerase (5U/ml, Northumbria Biologicals), (5) 19,55 ml de água bidestilada estéril.

Quinze oligonucleotídeos (kit Operon) foram utilizados neste estudo (OPA7, OPB16, OPE6, OPE16, OPF13, OPK1, OPK2, OPK5, OPK7, OPK9, OPK10, OPK11, OPK15, OPK17 e OPK18).

As amplificações foram realizadas em termociclador (Hybaid) programado da seguinte forma: (1) desnaturação inicial de 5 minutos a 94°C, (2) 42 ciclos de desnaturação de 1 minuto a 92°C, hibridação de 1 minuto a 35°C e alongamento de 1 minuto a 72°C, (3) alongamento final de 1 minuto a 72°C.

Os produtos foram analisados em gel de agarose 0,8% em tampão TBE (45mM TRIS, 45mM de ácido bórico, 1mM EDTA pH 8,0) e as bandas visualizadas em luz ultra-violeta.

Para a análise das bandas, os perfis eletroforéticos foram analisados através do programa estatístico Genstat (Payne et al., 1987) e a matriz de similaridade genética foi calculada através do coeficiente de similaridade de Jaccard (Sneath e Sokal, 1973).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

B. thuringiensis var. kurstaki apresentou o mesmo nível de toxicidade contra as quatro populações de P. xylostella. Os valores de CL₅₀ encontrados após dois e cinco dias (Tabela 1) foram estatisticamente similares, variando de 12,41 a 16,21 mg/ml no segundo dia e de 2,06 a 3,24 mg/ml no quinto dia, indicando que não há diferenças de suscetibilidade entre as populações. Esses resultados mostram que as toxinas produzidas pela bactéria continuam agindo mesmo após o segundo dia de aplicação, pois a CL₅₀ encontrada na avaliação realizada no quinto dia foi em média 5,5 vezes inferior a CL₅₀ obtida no segundo dia.

Três métodos de extração de DNA foram avaliados, pois não havia nenhum método descrito especificamente para a traça-das-crucíferas. Dentre esses, o método de Black et al. (1992), descrito para extração de DNA de afídeos, foi selecionado para a realização do trabalho, pois foi o único que proporcionou uma boa extração de DNA. Os outros métodos, descritos para a extração de DNA de plantas (Langridge et al., 1991) e de fungos filamentosos (Möller et al., 1992), não foram apropriados por não resultarem em um DNA de boa qualidade.

Nenhuma variabilidade genética intra-populacional foi detectada usando os 15 oligonucleotídeos mencionados (100% de similaridade), sugerindo que cada uma das populações são geneticamente homogêneas (Figura 1).

As amplificações RAPD-PCR com o DNA das diferentes populações geraram 37 produtos. De forma geral, as populações eram bastante homogêneas, pois o menor coeficiente de similaridade era de 75% (Tabela 2). As populações provenientes do Benin e das Filipinas eram as mais semelhantes (91%). A população do Brasil estava mais próxima da população originária da Ilha da Reunião (88,9%) do que as provenientes do Benin e das Filipinas, que apresentaram coeficientes de similaridade respectivamente de 75 e 77,8% (Tabela 2).

Os dois parâmetros utilizados neste trabalho mostraram semelhanças entre as diferentes populações de P. xylostella, tanto de suscetibilidade ao B. thuringiensis quanto na variabilidade genética por RAPD-PCR. A alta homogeneidade encontrada nas populações estudadas sugere uma recente irradiação desta espécie, acompanhando os movimentos do homem e da cultura das crucíferas. Estudos envolvendo maior número de populações e o emprego de outras técnicas molecular seria de grande importância para corroborar estes dados.

LITERATURA CITADA

(Recebido para publicação em 15 de junho de 2003 e aceito em 24 de maio de 2004)

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Autor correspondente

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Nov 2004
• Data do Fascículo
  Set 2004

Histórico

• Aceito
  24 Maio 2004
• Recebido
  15 Jun 2003