Biocontrole da mancha-aquosa do melão pelo tratamento de sementes com bactérias epifíticas e endofíticas

Biocontrol of bacterial blotch of melon by seed treatment with epiphytic and endophytic bacteria

COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA

Biocontrole da mancha-aquosa do melão pelo tratamento de sementes com bactérias epifíticas e endofíticas

Biocontrol of bacterial blotch of melon by seed treatment with epiphytic and endophytic bacteria

Aldenir de OliveiraI, ^*; Marcos H M dos Santos^I; Elineide B da Silveira^II; Andréa M A Gomes^II; Rosa de LR MarianoIII, ^**

UFRPE, R. Dom Manoel de Medeiros, s/n°, Dois Irmãos, 52171-030 Recife-PE

^IEstudante de Agronomia

^IIDeptº. Biologia/Microbiologia

^IIIDep^to. Agronomia/Fitossanidade

RESUMO

Bactérias epifíticas e endofíticas (96 isolados) e fungos endofíticos (69 isolados) foram obtidos de plantas de meloeiro sadios e testados no controle da mancha-aquosa, em condições de casa de vegetação, pelo tratamento de sementes pré-inoculadas com Acidovorax avenae subsp. citrulli ou pelo tratamento de sementes sadias visando a proteção da planta a posterior inoculação com o patógeno. As sementes de melão foram microbiolizadas por imersão nas suspensões (A₅₇₀= 0,7), semeadas e avaliadas quanto ao período de incubação (PI), incidência (INC), severidade da doença (SEV) e redução da severidade da doença (RSD). Apenas a microbiolização de sementes artificialmente infectadas, utilizando os endofíticos ENM5 (não identificado), ENM9 (Bacillus cereus), ENM13 (Bacillus sp.), ENM16 (Bacillus cereus), ENM32 (Bacillus subtilis) e ENM43 (Bacillus sp.), revelou potencial para o controle da mancha-aquosa. Esses isolados, após o teste de compatibilidade in vitro, foram reavaliados isoladamente e em misturas dois a dois quanto ao PI, INC, SEV e RSD, além do índice de doença (IDO) e área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD). Todos os tratamentos diferiram significativamente (P= 0,05) da testemunha, com RSD de até 93,6%, destacando-se os isolados ENM13 e ENM9 com PI de 7,5 e 7,25 dias, SEV de 0,22 e 0,22, IDO de 2,59 e 2,59, e AACPD de 0,22 e 0,39, respectivamente. Ensaios foram realizados in vitro para a determinação dos possíveis mecanismos de ação envolvidos no controle biológico. Os isolados ENM13 e ENM9 solubilizaram fosfato, ENM5 apresentou antibiose contra A. avenae subsp. citrulli, ENM43 produziu HCN enquanto ENM16 e ENM32 não apresentaram nenhum dos mecanismos testados.

Palavras-chave:Cucumis melo, Acidovorax avenae subsp. citrulli, semente, Bacillus spp., controle.

ABSTRACT

Epiphytic and endophytic bacteria (96 strains) and endophytic fungi (69 strains) were isolated from symptomless melon plants and tested for control of fruit blotch under greenhouse conditions, by treating seeds previously inoculated with Acidovorax avenae subsp. citrulli or treating healthy seeds in order to protect the plant challenged later with the pathogen. Melon seeds were microbiolized by immersion in suspensions (A₅₇₀= 0,7), sown and evaluated for incubation period (PI), incidence (INC), disease severity (SEV) and disease severity reduction (RSD). Only microbiolization of artificially infected seed using the endophytic ENM5 (not identified), ENM9 (Bacillus cereus), ENM13 (Bacillus sp.), ENM16 (Bacillus cereus), ENM32 (Bacillus subtilis) and ENM43 (Bacillus sp.), showed potencial for disease control. After in vitro compatibility tests, these strains were reevaluated separately and in pairs, in relation to PI, INC, SEV, RSD, disease index (IDO) and area under disease progress curve (AACPD). All treatments differed significantly (P= 0.05) from the control reaching 93.6% of RSD, with emphasis for ENM13 and ENM9 with 7.5 and 7.25 days of PI, 0.22 and 0.22 of SEV, 2.59 and 2.59 of IDO, and 0.22 and 0.39 of AACPD, respectively. In vitro tests to determine the putative mechanisms of action involved in biocontrol were performed. ENM13 and ENM9 solubilized phosphate, ENM5 presented antibiose against A. avenae subsp. citrulli, and ENM43 produced HCN while ENM16 and ENM32 did not show any of the tested mechanisms.

Keywords:Cucumis melo, Acidovorax avenae subsp. citrulli, seed, Bacillus spp., control

A mancha-aquosa causada por Acidovorax avenae subsp. citrulli é a principal doença bacteriana que ocorre nos campos de melão do Nordeste, e responsável por grandes perdas de produção e depreciação dos frutos, principalmente no Rio Grande do Norte e Ceará (Sales Júnior & Menezes, 2001). Desde que Assis et al. (1999) relataram a ocorrência dessa doença no Rio Grande do Norte em 1997, têm sido assinaladas perdas entre 40 a 50%, atingindo até 100% em períodos chuvosos (Sales Júnior & Menezes, 2001). Posteriormente, essa doença também foi relatada no Ceará (Santos & Viana, 2000), Pernambuco (Mariano & Silveira, 2004) e Bahia (Mariano et al., 2004a).

Os sintomas da mancha-aquosa podem se manifestar em qualquer fase de desenvolvimento da planta. Nas folhas cotiledonares e verdadeiras as lesões são inicialmente aquosas e em seguida passam a necróticas. Nos frutos as lesões permanecem aquosas por longo período e correspondem internamente a uma lesão de cor marrom claro a marrom escuro na polpa, chegando até as sementes.

As medidas eficientes para controle da doença são escassas, e após introduzida em uma área é de difícil erradicação (Sales Júnior & Menezes, 2001). Assim, alternativas para o seu controle devem ser avaliadas e, dentre elas, cita-se o controle biológico através de bactérias biocontroladoras (Medeiros et al., 2002, 2003; Santos, 2004; Fessehaie & Walcott, 2005).

Como a bactéria causadora da mancha-aquosa do melão é disseminada por meio de sementes infectadas (O'Brien & Martin, 1999), o tratamento das sementes com microrganismos promotores do crescimento de plantas que seja eficiente para inibir o patógeno ou proteger a plântula emergente constitui em alternativa de controle economicamente desejável para o manejo da doença, podendo ser integrado com outras técnicas para melhorar a eficiência. Os microrganismos agentes de biocontrole de doenças de plantas podem atuar através de diferentes mecanismos, como produção de ácido cianídrico, bacteriocinas e antibióticos, competição por espaço, Fe⁺³ e outros nutrientes, parasitismo, indução de resistência e proteção cruzada (Mariano et al., 2004b).

O presente trabalho teve como objetivos isolar e selecionar microrganismos para o controle biológico da mancha-aquosa do melão em condições de casa de vegetação, e determinar possíveis mecanismos relacionados ao antagonismo.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolamento de microrganismos

Para o isolamento de microrganismos epifíticos e endofíticos foram utilizados raízes, caules, folhas, flores, frutos e/ou sementes de plantas de melão sadias, oriundas de cultivos comerciais em Mossoró (RN), Juazeiro (BA) e Petrolina (PE) e área experimental em Recife (PE). Para isolamento de bactérias epifíticas e endofíticas foram utilizados métodos descritos por Gomes et al. (2005) e Oliveira et al. (2004). Nos dois métodos, as placas foram mantidas por 48 horas à temperatura ambiente de 27±2ºC. Foram selecionadas colônias com características distintas umas das outras, com base nas observações macroscópicas, como coloração e características de crescimento em meio de cultura Tryptic Soy Agar – TSA (40 g de TSA; 10 g ágar; 1000 mL de água destilada). Estas colônias foram purificadas e preservadas em meio ágar nutritivo (3,0 g de extrato de carne; 5,0 g de peptona; 18 g de ágar; 1000 mL de água destilada).

No isolamento dos fungos endofíticos, empregou-se o método descrito por Oliveira et al. (2004), sendo as placas incubadas à temperatura ambiente (27±2ºC) por sete dias. Após esse período, as colônias fúngicas desenvolvidas em torno dos fragmentos foram separadas de acordo com as características das culturas em meio batata-dextrose-ágar (20 g de dextrose; 20 g de ágar; caldo de 200 g de batata cozida em água, e 1000 mL de água destilada). As colônias foram purificadas e preservadas no mesmo meio de cultura.

Seleção de microrganismos para sementes pré-inoculadas

Sementes comerciais de melão híbrido AF682 foram lavadas em água corrente por 10 minutos, submetidas a secagem por 48 h, inoculadas por infiltração a vácuo com o inóculo de Acidovorax avenae subsp. citrulli (Aac1) na concentração de 3,4x10⁷ UFC/mL e armazenadas em sacos de papel após secas. Após sete dias, foram imersas em suspensões (A₅₇₀= 0,7) de bactérias epifíticas (34 isolados) e endofíticas (62 isolados) ou fungos endofíticos (59 isolados), por 10 minutos. As testemunhas relativas e absolutas foram inoculadas com o patógeno e com água destilada esterilizada (ADE), respectivamente. Decorridas 16 h procedeu-se a semeadura em bandejas de poliestireno com 120 células contendo substrato comercial Plantmax^®. Após a emergência, as plântulas foram submetidas à câmara úmida por 48 h. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 98 tratamentos (34 isolados de bactérias epifíticas, 62 isolados de bactérias endofíticas, uma testemunha absoluta e uma testemunha relativa) ou 61 tratamentos (59 isolados de fungos endofíticos, uma testemunha absoluta e uma testemunha relativa), respectivamente para os experimentos com as bactérias e fungos, e oito repetições, sendo a unidade experimental constituída por uma plântula. As plântulas foram avaliadas diariamente, até o quinto dia da retirada da câmara úmida, determinando-se os seguintes componentes da doença: a) período de incubação (PI), calculado pelo número de dias entre a emergência das plântulas e o surgimento dos sintomas da doença. Plântulas sem sintomas da doença tiveram o PI ajustado para 8 dias, correspondendo ao período de avaliação total acrescido de um dia, conforme proposto por Iamsupasit et al. (1993); b) incidência (INC), calculada pela porcentagem de plântulas com sintomas da doença em relação ao total de plântulas avaliadas; c) severidade da doença (SEV) aos sete dias após germinação das sementes, estimada com o auxílio de escala descritiva, com notas variando de 0 a 5 (Silveira et al., 2003); e d) redução da severidade da doença (RSD), calculada através da fórmula RSD= (SEV Testemunha - SEV Tratamento) x 100/SEV Testemunha.

Seleção de microrganismos para plantas pós-inoculadas

Sementes comerciais de melão (híbrido AF682) foram imersas nas suspensões dos isolados de bactérias epifíticas e endofíticas ou de fungos endofíticos (A₅₇₀= 0,7) durante 10 minutos, sendo postas para secar em papel de filtro por 16 horas. As sementes da testemunha foram tratadas com ADE. Em seguida, efetuou-se o plantio em copos de 500 mL contendo a mistura solo esterilizado/substrato Plantmax^® (1:1 v/v). Após 20 dias as plantas foram submetidas à câmara úmida por 24 horas e então pulverizadas com uma suspensão de Aac1 com concentração de 3,4 x 10⁷ UFC/mL, sendo novamente mantidas em câmara úmida por 24 horas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 97 tratamentos (34 isolados de bactérias epifíticas, 62 isolados de bactérias endofíticas e uma testemunha relativa) ou 60 tratamentos (59 isolados de fungos endofíticos e uma testemunha relativa), respectivamente para os experimentos utilizando bactérias e fungos, e quatro repetições, sendo a unidade experimental constituída por duas folhas de uma planta. As plantas foram avaliadas diariamente, até cinco dias após a retirada da câmara úmida, determinando-se os componentes da doença PI, INC, SEV e RSD. Para a determinação da SEV em plantas, foi utilizada a escala descritiva de notas adaptada por Silveira et al. (2003).

Efeito de misturas de isolados bacterianos pelo tratamento de sementes infectadas

Na avaliação da compatibilidade entre os isolados bacterianos selecionados foi empregado o método de antibiose bactéria x bactéria (Mariano et al., 2005), com as suspensões bacterianas ajustadas para concentração A₅₇₀= 0,7. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 30 tratamentos (seis isolados testados entre si) e quatro repetições, sendo cada repetição constituída por duas placas de Petri contendo quatro discos cada.

As suspensões dos isolados bacterianos foram preparadas separadamente e em misturas dois a dois, em volumes iguais, e foram aplicadas às sementes conforme método descrito anteriormente para o tratamento de sementes pré-inoculadas com A. avenae subsp. citrulli. Além do PI, INC, SEV e RSD, foi determinado o índice de doença (IDO) no sétimo dia após a emergência das plântulas, calculado de acordo com McKinney (1923) pela fórmula IDO= (grau de escala x freqüência) x 100/ nº total de unidades x grau máximo da escala, utilizando-se os dados de severidade da doença, e a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), calculada pela fórmula= AACPD= [ (y_i+y_i+1)/2. d_ti ]/n, onde y_i e y_i+1 são os valores de SEV observados em duas avaliações consecutivas e d_ti, o intervalo entre duas avaliações (Shaner & Finney, 1977). O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com 22 tratamentos (seis bactérias endofíticas isoladamente, 15 combinações de isolados bacterianos e uma testemunha relativa) e cinco repetições, sendo cada repetição constituída por duas plântulas.

Os dados obtidos em todos os experimentos foram submetidos à análise de variância e, as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott ou Duncan (P= 0,05).

Determinação do mecanismo de ação dos isolados bacterianos

Os isolados bacterianos previamente selecionados como eficientes no controle da mancha-aquosa foram avaliados quanto a antibiose, produção de ácido cianídrico (HCN) e solubilização de fosfato, de acordo com os métodos descritos por Cattelan (1999) e Mariano et al. (2005). Como padrões positivos para produção de HCN e solubilização de fosfato foram utilizados respectivamente os isolados de Burkholderia cepacia GN1201 e Pseudomonas chlororaphis GN1212. O delineamento experimental para cada teste foi inteiramente casualizado, com sete tratamentos (seis bactérias endofíticas e um padrão positivo) e quatro repetições, sendo cada repetição constituída por uma placa de Petri.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De plantas sadias de melão de diversas localidades foram obtidos 37 isolados de bactérias epifíticas (9 de raízes, 10 de caule, 15 de folhas, 1 de flor e 2 de frutos), dos quais três perderam a viabilidade durante o processo de purificação; 62 isolados de bactérias endofíticas (19 de raízes, 22 de caules, 13 de folhas, 5 de flores e 3 de sementes) e 59 isolados de fungos filamentosos endofíticos (19 de raízes, 14 de caules, 17 de folhas, 5 de flores, 2 de frutos e 2 sementes). De acordo com McInroy & Kloepper (1995), isolados bacterianos provenientes da própria comunidade endofítica e epifítica da planta, podem ser potenciais agentes de controle biológico.

Dos 96 isolados bacterianos avaliados para o controle da mancha-aquosa através do tratamento de sementes pré-inoculadas com A. avenae subsp. citrulli foram selecionados, respectivamente quanto, ao período de incubação, incidência e severidade, os endofíticos ENM5 (4,0; 75,0%; 1,6), ENM9 (4,2; 62,5%; 1,9), ENM13 (7,0; 37,5%; 0,63), ENM16 (4,2; 62,5%; 1,9), ENM32 (4,7; 62,5%; 1,6) e ENM43 (4,25; 62,5%; 1,9), que diferiram significativamente da testemunha relativa (3,0; 87,5%, 2,75) pelo teste de Scott-Knott (P= 0,05) (dados não exibidos em tabela). Os isolados ENM5, ENM9 e ENM16 foram obtidos de raízes, o isolado ENM32 de fragmentos de caule e o ENM43, de folhas de melão.

Dos isolados avaliados, apenas 5% apresentaram potencial para o controle da mancha-aquosa, sendo todos endofíticos. Esse percentual pode ser considerado elevado, uma vez que na maioria das pesquisas realizadas com bactérias promotoras de crescimento de plantas menos de 1% dos isolados são eficientes (Chen et al., 1996). Bactérias endofíticas utilizadas no biocontrole de doenças de plantas apresentam como principais vantagens, em relação às epifíticas, possuírem nicho ecológico similar ao do patógeno e serem protegidas das diversas influências abióticas (Halmann et al., 1997).

Os isolados ENM5 (não identificado), ENM9 (Bacillus cereus ), ENM13 (Bacillus sp.), ENM16 (Bacillus cereus ), ENM32 (Bacillus subtilis), e ENM43 (Bacillus sp.), apresentaram compatibilidade in vitro e, tanto isoladamente quanto em misturas, mostraram-se eficientes no controle da mancha-aquosa do melão, diferindo significativamente (P= 0,05) da testemunha em relação as variáveis severidade, índice de doença e área abaixo da curva de progresso da doença (Tabela1). Esses isolados apresentaram redução da severidade da doença de até 93,6% (Figura 1). Não foi observado efeito aditivo ou sinergístico significativo para as misturas de isolados no controle da mancha-aquosa. Os resultados indicam que a aplicação de apenas um isolado para bacterização de sementes de melão é mais prática e econômica, destacando-se com maiores níveis de controle os isolados ENM13 e ENM9, os quais apresentaram respectivamente, período de incubação de 7,5 e 7,25 dias, severidade de 0,22 e 0,22, índice de doença de 2,59 e 2,59, e área abaixo da curva de progresso da doença de 0,22 e 0,39 (Tabela 1).

Resultados promissores com utilização de Bacillus para controle da mancha-aquosa foram relatados recentemente na literatura. Medeiros et al. (2002) relataram ter obtido controle eficiente da mancha-aquosa em casa de vegetação com emprego do Bacillus sp. RAB9 no tratamento de sementes infectadas. Também Santos (2004) conseguiu o controle através do tratamento de sementes infectadas com líquidos fermentados com ou sem presença das células de B. subtilis R14, B. megaterium pv. cerealis RAB7, B. pumilis C116, Bacillus sp. MEN2, tendo caracterizado que o mecanismo de ação desses isolados deveu-se a antibiose e à presença de compostos ativos parcialmente caracterizados como lipopeptídeos. Espécies de Bacillus têm sido amplamente testadas no controle biológico, uma vez que produzem endósporos, o que facilita a formulação dos produtos para aplicação comercial. Para o controle de diferentes doenças, produtos como Companion, EcoGuard, HiStick N/T, Kodiak, Rhizo-Plus, Serenade, Subtilex e YieldShield, a base de Bacillus, são registrados para uso agrícola nos Estados Unidos (Mariano et al., 2004b).

O principal modo de disseminação de A. avenae subsp. citrulli é através das sementes contaminadas (Hopkins et al., 1996), provável causa da introdução da mancha-aquosa no Rio Grande do Norte (Assis et al., 1999), podendo essa transmissão variar de 10 até 91% (O'Brien & Martin, 1999; Oliveira et al., 2001). Como os isolados endofíticos selecionados no presente trabalho se mostraram eficientes, estes poderão ser indicados para o tratamento de sementes infectadas com A. avenae subsp. citrulli individualmente ou em combinação com outros métodos de controle.

Nos ensaios realizados in vitro quanto a determinação dos mecanismos de ação envolvidos no biocontrole da mancha-aquosa, verificou-se que os isolados ENM13 e ENM9 solubilizaram fosfato, ENM5 exerceu antibiose contra A. avenae subsp. citrulli e ENM43 produziu HCN. Nenhum dos mecanismos estudados está relacionado ao controle exercido pelos isolados ENM16 e ENM32. Esses mecanismos de ação já foram relatados anteriormente associados ao controle de doenças por Bacillus spp. e outras bactérias. Segundo Melo (1998), o biocontrole exercido por B. megatherium var. phosphaticum inclui aumento da solubilização de fosfato orgânico via ação da fosfatase ou solubilização de fosfatos inorgânicos com ácidos orgânicos e subseqüente incremento na absorção desse elemento pela planta, o que a torna mais resistente ao patógeno. Isolados de Bacillus subtilis (R14), B. pumilis (C116), B. megaterium pv. cerealis (RAB7) e B. cereus apresentaram atividade antibiótica in vitro a Xanthomonas campestris pv. campestris (Luna et al., 2002). Défago et al. (1990) apresentaram evidências de que o HCN é benéfico no controle microbiológico, sendo esse composto relacionado à supressão da podridão preta das raízes do fumo pela bactéria Pseudomonas fluorescens. Na prática, provavelmente, poucos microrganismos exercem um único mecanismo antagônico, bem como os mecanismos não são mutuamente exclusivos, uma vez que sua importância relativa pode ser variável com as condições ambientais, estádio de desenvolvimento do agente biocontrolador e do fitopatógeno (Andrews, 1992). No presente estudo, apesar da maioria dos isolados testados terem apresentado individualmente mecanismos de ação diferentes, quando avaliados em combinações não se observou efeito aditivo ou sinergístico para o controle da mancha-aquosa (Tabela 1).

Com relação ao controle da mancha-aquosa do melão pela proteção da planta com bactérias epifíticas e endofíticas, dos 96 isolados testados inicialmente foram selecionados por diferirem significativamente (P= 0,05) da testemunha pelo teste de Scott-Knott, respectivamente quanto à incidência e severidade os endofíticos ENM2 (66,7%; 2,0), ENM8 (66,7%; 2,0), ENM24 (66,7%; 1,0) e ENM30 (66,7%; 2,0) (100,0%; 3,0) (dados não exibidos em tabela). Contudo, esses isolados não se mostraram eficientes no controle da mancha-aquosa após o experimento ter sido repetido mais duas vezes. Segundo Fravel (1999), fatores como a falta de repetibilidade de resultados obtidos durante o tempo e condução dos experimentos tem sido um dos maiores obstáculos no controle biológico de doenças de plantas. Weller (1988) cita como fatores responsáveis pelo desempenho inconsistente de um biocontrolador a perda da competitividade ecológica devido à alteração de alguma característica da bactéria, a variação na colonização pelo antagonista, e a interferência de fatores bióticos e abióticos. Em trabalhos realizado por Medeiros et al. (2003), plantas de melão foram protegidas contra A. avenae subsp. citrulli quando pulverizadas aos sete dias de idade com o isolados de Bacillus spp. Fessehaie & Walcott (2005) estudaram a proteção de flores de melancia para evitar-se a infecção das sementes pela bactéria e verificaram uma redução no percentual de sementes infectadas da ordem de 13,8% quando do tratamento prévio com A. avenae subsp. avenae (AAA99-2) antes da inoculação com A. avenae subsp. citrulli.

Dos 59 isolados de fungos filamentosos endofíticos avaliados nenhum foi eficiente no controle da mancha-aquosa, quer seja no tratamento de sementes infectadas ou pulverização sobre as plantas (dados não apresentados). Existem diferentes relatos da utilização de espécies de fungos filamentosos, a exemplo dos gêneros Trichoderma, Pythium e Fusarium, porém para o controle de doenças fúngicas, algumas das quais na filosfera de plantas (Mariano et al., 2000).

Os resultados apresentados demonstram que os seis antagonistas selecionados têm potencial como agentes de biocontrole da mancha-aquosa em melão. Também, o tratamento de sementes é de grande potencial por ser método prático e simples no controle dessa doença importante para os produtores devido às perdas que causa.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq pela concessão de auxílio financeiro (Proc. 473024/2003-9) e bolsas de iniciação científica.

Recebido para publicação em 27 de julho de 2005; aceito em 11 de agosto de 2006

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Jun 2007
• Data do Fascículo
  Set 2006

Histórico

• Recebido
  27 Jul 2005
• Aceito
  11 Ago 2006