Composição da matriz de encapsulamento na formação e conversão de sementes sintéticas de pimenta-longa

Composition of the encapsulation matrix on the formation and conversion of synthetic seeds of long pepper

COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA

Composição da matriz de encapsulamento na formação e conversão de sementes sintéticas de pimenta-longa

Composition of the encapsulation matrix on the formation and conversion of synthetic seeds of long pepper

Jonny ES Pereira^{I , V}; Rodrigo da S Guedes^{II , V}; Frederico Henrique da S Costa^{III , V}; Gottfried Cristian B Schmitz^IV

^IEmbrapa Recursos genéticos e Biotecnologia, C. Postal 02372, 70770-900 Brasília-DF

^IIUFAC Depto. Produção Vegetal, 69901-180 Rio Branco-Acre

^IIIUFLA - Dep^to Fitotecnia, 37200-000 Lavras-MG

^IVEng. Agrônomo, Rio Branco-Acre

^VBolsista CNPq; [e-mail]

RESUMO

A pimenta-longa (Piper hispidinervium C. DC.) é uma planta nativa caracterizada pela produção de safrol, um metabólito secundário usado na produção de perfumes, cosméticos e inseticidas. Neste trabalho avaliou-se o uso potencial da tecnologia de sementes sintéticas como alternativa à propagação in vitro de pimenta-longa. Foi estudada a influência da constituição da cápsula sobre a formação e conversão in vitrode unidades encapsuláveis. Sementes pré-germinadas de pimenta-longa com 21 dias de cultivo em meio de cultura de MS foram utilizadas como material de encapsulamento. A concentração de alginato de sódio utilizada na matriz de encapsulamento foi de 1,5% (p/v) e a esta consistência se testou na água e o meio de MS nas concentrações plena (100%), 3/4 (75%) e 1/2 (50%) dos sais e vitaminas, associado ou não a carvão ativado (3 g L^-1) como elementos da cápsula. Após encapsulamento, os cultivos foram mantidos em sala de crescimento a 25±2ºC, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 30 mmol m^-2 s^-1, onde a taxa de conversão e a altura das plantas foram avaliadas quinzenalmente até 30 dias de cultivo. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, em fatorial 2 x 4, com cinco repetições e dez unidades encapsuláveis por parcela. Verificou-se que o emprego de um endosperma sintético constituído por 3/4 dos sais e vitaminas de MS, acrescido de carvão ativado (3 g L^-1) (85,8% de taxa de conversão) ou a utilização de MS pleno, independente do uso de carvão ativado (76,5%) promoveram as melhores taxas de conversão de sementes sintéticas de pimenta-longa. A altura das plantas não foi afetada pelas concentrações de MS e adição de carvão ativado à cápsula.

Palavras-chave:Piper hispidinervum, micropropagação, sementes artificiais, unidades encapsuláveis, alginato de sódio, carvão ativado.

ABSTRACT

Long pepper (Piper hispidinervumC. DC.) is a native plant characterized by the production of safrol, a secondary metabolite used in the production of perfumes, cosmetics and insecticides. In the present work the potential use of synthetic seeds technology as an alternative to in vitropropagation of long pepper was evaluated. The influence of capsule constitution on formation and conversion of in vitroencapsulated units was also studied. Long pepper pre-germinated 21-day old seeds were used as material for encapsulation. The concentration of sodium alginate used in the encapsulation matrix was 1,5% (p/v) and this consistency was tested in water or MS at full (100%), 3/4 (75%) and ½ (50%) concentration of salt and vitamins, associated or not to active charcoal (3 g L^-1), as nutritional elements of the capsule. After encapsulation, cultures were maintained in a growth room at 25±2ºC and a photoperiod of 16 h at 30 mmol m^-2s^-1, where the conversion rate and height of the plants were evaluated for a month. The experimental design was of randomized blocks arranged in a 2 x 4 factorial scheme, with five replicates and ten encapsulated units for replicate. It was verified that The employment of a synthetic endosperm constituted by MS at ¾ concentration, enriched with active charcoal (3 g L^-1) (85.8% of conversion) or MS at full concentration, independently of active charcoal (76.5%), promoted the best results on the conversion of synthetic seeds of long pepper. The height of the plants was not affected by the MS concentrations and addition of active charcoal to the capsule.

Keywords:Piper hispidinervum, micropropagation, artificial seeds, encapsulated units, sodium alginate, active charcoal.

Uma espécie vegetal que tem despertado o interesse de empresários do ramo de fitoquímicos utilizados nas indústrias de cosméticos e bioinseticidas é a pimenta-longa (Piper hispidinervumC. D.C.), planta pertencente à família Piperaceae, encontrada naturalmente como vegetação secundária em regiões da Amazônia. Seu grande valor comercial reside na produção de um óleo essencial com elevado teor de safrol, um importante metabólito secundário usado pela indústria química na obtenção de heliotropina, amplamente utilizada como fragrância, e butóxido de piperonila (PBO), um ingrediente essencial para inseticidas biodegradáveis à base de piretrum (Wadt, 2001).

Contudo, por ainda se tratar de uma espécie em fase de domesticação e praticamente desconhecida do ponto de vista científico, pesquisas envolvendo métodos mais eficientes de propagação e conservação e que possibilitem avanços no melhoramento vegetal desta espécie ou que favoreçam a síntese de safrol, se fazem necessários (Guedes & Pereira, 2006). Nesse contexto, poucas são as pesquisas já realizadas com o emprego de técnicas biotecnológicas para a pimenta-longa, sendo que as existentes se restringem a poucos trabalhos sobre calogênese e cultivo de células em meio líquido (Pescador et al., 2000; Valle, 2003; Costa & Pereira, 2005; Silva et al., 2006).

A tecnologia de produção de sementes sintéticas vem se revelando como importante ferramenta em trabalhos de micropropagação e conservação in vitrode germoplasma. Além de permitir a manutenção da identidade genética do material vegetal e a rápida multiplicação dos propágulos, a técnica facilita a troca de germoplasma entre instituições de pesquisa e a conservação de genótipos desejáveis a baixos custos sob condições in vitro, além de permitir o estabelecimento de propágulos diretamente no campo (Maruyama et al., 1997; Nassar, 2003; Rech Filho, 2004).

Em geral, os estudos sobre encapsulamento envolvem o emprego de embriões somáticos como fonte de explantes (Castillo et al., 1998; Ara et al., 1999), havendo poucas pesquisas utilizando outros tipos de explantes como unidades encapsuláveis (Ganapathi et al., 1992; Sandoval & Guerra, 2002; Soneji et al., 2002; Nassar, 2003; Guedes et al., 2007). Como agente encapsulante, o alginato de sódio tem sido o mais utilizado, devido à sua solubilidade à temperatura ambiente, habilidade de gel permeável com o cloreto de cálcio, boa propriedade gelificante, baixo custo, facilidade de uso e ausência de toxicidade (Guerra et al., 1999).

Entretanto, apesar dos resultados positivos já obtidos com esta tecnologia, há ainda necessidade de inovações e, sobretudo, melhorias quanto à adequação dos tipos e concentrações dos constituintes a serem introduzidos à matriz de encapsulamento ou endosperma sintético (Guerra et al., 1999; Guedes et al., 2007). Vários são os elementos comumente utilizados durante a produção de sementes artificiais, como macro e micronutrientes, vitaminas, fungicidas e sacarose (Saiprasad, 2001; Sandoval & Guerra, 2002; Martin, 2003). No entanto, outros compostos também têm sido introduzidos na matriz de alginato com o objetivo de melhorar a conversão das unidades encapsuladas em plantas, entre os quais, citam-se osmorreguladores como sorbitol e manitol e fitorreguladores como BAP, ABA e AG₃ (Nieves et al., 1998; Ara et al., 1999; Inocente, 2002).

Este trabalho objetivou avaliar a possibilidade de uso da tecnologia de sementes sintéticas como ferramenta alternativa à produção in vitro de propágulos de pimenta-longa (Piper hispidinervum C. DC.), visando estudos futuros de conservação in vitroda espécie. Para tanto, a influência da composição da matriz de encapsulamento na formação e conversão de sementes sintéticas de pimenta-longa, a partir de sementes pré-germinadas, foi avaliada.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no Laboratório de Morfogênese e Biologia Molecular da Embrapa Acre, Rio Branco. Para o encapsulamento, utilizaram-se como unidades encapsuláveis sementes pré-germinadas de pimenta-longa com 21 dias de cultivo (Guedes et al., 2006). Para tanto, as sementes foram desinfestadas por imersão em álcool 70% (v/v) por 1 minuto, seguido por hipoclorito de sódio 50% (v/v) da concentração comercial por 20 minutos e, então, lavadas por três vezes em água destilada e autoclavada. Em seguida, foram colocadas para germinar em meio constituído pelos sais e vitaminas de MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido de 30 g L^-1 de sacarose e solidificado com 6 g L^-1 de ágar. O pH do meio foi ajustado para 5,8±0,1 anteriormente à adição do agente gelificante, sendo em seguida autoclavado a 121ºC e 1,5 atm por 15 minutos para esterilização.

Após três semanas de cultivo, as sementes pré-germinadas foram inicialmente selecionadas, e então misturadas à matriz de alginato de sódio (1,5% p/v). Posteriormente, com o auxílio de uma pipeta automática com ponteira autoclavada (ajustada para 350 µL), as unidades encapsuláveis foram individualmente resgatadas e gotejadas em solução de CaCl₂.2H₂O (50 mM), na qual permaneceram por 20 minutos para complexação. Em seguida, as sementes sintéticas, individualmente formadas por uma semente pré-germinada envolta na matriz de encapsulamento (Figura 1), foram submetidas a três lavagens em água destilada e esterilizada para a retirada do excesso de CaCl₂.2H₂O. Sequencialmente, as sementes artificiais foram imersas em solução de KNO₃ (100 mM) por 20 minutos para a descomplexação, sendo em seguida novamente lavadas em água destilada e esterilizada, e colocadas em frascos de vidro de 250 mL de capacidade com 40 mL de meio de MS para emergência e desenvolvimento. Tanto a solução de alginato de sódio (Synth^®) com os respectivos tratamentos, como as soluções de CaCl₂.2H₂O e de KNO₃ foram esterilizadas por autoclavagem a 121ºC durante 15 minutos e 1,3 atm de pressão.

Os tratamentos consistiram da influência da constituição da cápsula (água ou sais e vitaminas de MS nas concentrações 1/2, 3/4 e plena do meio de MS), associado à adição ou não de carvão ativado (3 g L^-1). O delineamento experimental empregado foi inteiramente casualizado, em fatorial 2 x 4, sendo cada tratamento representado por cinco repetições, e dez unidades encapsuladas por parcela. Quinzenalmente foi avaliada a conversão (emergência das unidades encapsuláveis) e altura das plantas por um período de 30 dias.

Para isso, após descomplexação, o material foi mantido em sala de crescimento, à temperatura de 25±2ºC, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 30 mmol m^-2 s^-1. Os dados obtidos foram analisados com o emprego do programa estatístico SANEST (Zonta & Machado, 1984) e, as médias, comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Dados expressos em percentagem (x) foram transformados para raiz quadrada do arco seno (x/100)^0,5.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A adição de concentrações mais elevadas do meio MS (3/4 e pleno) na matriz de encapsulamento proporcionou percentuais de conversão das sementes pré-germinadas de pimenta-longa significativamente superiores ao tratamento onde se utilizou a água como constituinte do endosperma artificial (Tabela 1). Resultados semelhantes aos obtidos neste trabalho foram observados por Sandoval & Guerra (2002) com microbrotos de bananeira e por Rao & Singh (1999), trabalhando com Solanum melongena. Ao contrário, Castillo et al. (1998), estudando o encapsulamento de embriões somáticos de mamão, observaram que a freqüência de regeneração dos embriões encapsulados foi significativamente afetada pela presença de sais nutritivos na cápsula, sendo os melhores resultados obtidos em unidades encapsuladas em matriz de alginato com MS na concentração ½, com 77,5% de germinação dos embriões.

Para os tratamentos onde se utilizou os sais e vitaminas de MS nas concentrações 1/2 e 3/4, o acréscimo de carvão ativado (3 g L^-1) à matriz de encapsulamento promoveu resultados significativamente superiores no percentual de conversão das plantas quando comparado aos tratamentos sem a presença de carvão ativado. Por outro lado, no tratamento que se testou a concentração plena dos sais e vitaminas de MS, não foram observadas diferenças significativas na taxa de conversão das plantas de pimenta-longa com a inclusão de carvão na matriz de alginato, sugerindo que a alta concentração de sais proporcionada pelo MS na sua concentração plena foi suficiente para garantir o desenvolvimento do material. Estudando o efeito do carvão ativado e do fungicida benlate como constituintes da matriz de encapsulamento na conversão de microbrotos de bananeira cv. Grande Naine, Sandoval & Guerra (2002) verificaram que o carvão ativado (1,5 g L^-1), associado a 1 g L^-1 de benlate, além de promover o maior percentual de conversão das unidades encapsuláveis, reduziu a oxidação dos explantes, melhorando o vigor das plantas. Segundo Saiprasad (2001), outro efeito importante promovido pela adição de carvão ativado à matriz de alginato é o incremento na respiração dos explantes encapsulados e a adsorção de aglomerados de nutrientes que são gradativamente liberados para o explante, favorecendo assim o desenvolvimento dos cultivos. Antonietta et al. (1999) reportaram que a utilização de um endosperma sintético contendo adequada concentração de nutrientes e uma fonte de carbono promoveu ótima germinação e conversão de embriões somáticos de Citrus reticulata.

Já em relação à época de avaliação, o maior percentual médio de conversão foi obtido após 30 dias de cultivo, independente da constituição e adição de carvão ativado à matriz de alginato (Tabela 1). Quanto à altura das plântulas emergidas (convertidas), nenhuma diferença significativa foi observada para a constituição do endosperma sintético, diferentemente do fator época de avaliação. Desse modo, passados 30 dias da descomplexação das unidades encapsuláveis de pimenta-longa em KNO₃, a altura média das plântulas alcançou 0,7 cm, valor significativamente superior àquele observado aos 15 dias de avaliação, 0,4 cm (Tabela 1). Em relação à presença ou ausência de carvão ativado no endosperma sintético, não foram constatados efeitos significativos sobre a altura das plantas.

Conclui-se que o emprego de um endosperma sintético constituído por 75% dos sais e vitaminas de MS, acrescido de carvão ativado (3 g L^-1), ou pela concentração plena do meio MS promoveram as mais altas taxas de conversão de sementes sintéticas de pimenta-longa. A altura das plântulas não foi afetada pelas concentrações de MS e de carvão ativado na matriz de encapsulamento, após 30 dias da semeadura em meio de MS.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pela concessão das bolsas de estudos.

Recebido para publicação em 13 de março de 2007; aceito em 19 de fevereiro de 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Maio 2008
• Data do Fascículo
  Mar 2008

Histórico

• Aceito
  19 Fev 2008
• Recebido
  13 Mar 2007