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Horticultura Brasileira

Print version ISSN 0102-0536

Hortic. Bras. vol.30 no.3 Vitoria da Conquista July/Sept. 2012

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-05362012000300006 

PESQUISA RESEARCH

 

Seleção de isolados de Beauveria bassiana potenciais para o controle da traça-das-crucíferas

 

Selection of Beauveria bassiana isolates potential for diamondback moth control

 

 

Vando M RondelliI; Dirceu PratissoliII; Edmilson J MarquesI; Hugo JG dos Santos JuniorII; João Rafael de CC de AlencarIII; Gustavo M SturmII; João Paulo P PaesII

IUFRPE, Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900 Recife-PE; rondellimiossi@hotmail.com; emar@depa.ufrpe.br
IIUFES- CCA, Depto. Prod. Vegetal, Alto Universitário s/n, 29500-000 Alegre-ES; pratissoli@cca.ufes.br; hugo@cca.ufes.br; gustavosturm@hotmail.com; joaopauloppaes@hotmail.com
IIIUNESP, Depto. Fitossanidade, Rodov. Prof. Paulo Donato Castellane s/n, 14884-900 Jaboticabal-SP; jralencar@gmail.com

 

 


RESUMO

A traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae), é considerada a principal praga das brássicas no mundo, sendo o uso de inseticidas o método mais usado para o seu controle. Assim, o objetivo desta pesquisa foi selecionar isolados de Beauveria bassiana com viabilidade para utilização no controle da traça-das-crucíferas. Dezessete isolados e um produto comercial de B. bassiana foram testados. Lagartas de segundo ínstar da traça-das-crucíferas foram pulverizadas com suspensão de conídios na concentração de 107 conídios mL-1. Para o bioensaio de concentração letal (CL) sete concentrações espaçadas em escala logarítmica foram testadas. Os isolados CCA/UFES-4, 18, 31 e 35 foram selecionados para o bioensaio de CL por causarem mortalidade confirmada superior a 90%. O isolado padrão ESALQ-447 e o produto comercial tiveram resultados semelhantes e também foram selecionados para o bioensaio de CL. Com base nas estimativas da CL50, os isolados CCA/UFES-4, 18, 31, ESALQ-447 e o produto comercial podem ser selecionados para utilização no controle da traça-das-crucíferas.

Palavras-chave: Plutella xylostella, controle microbiano, fungo entomopatogênico, entomologia agrícola.


ABSTRACT

Diamondback moth (DBM), Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae), is considered the most important pest of brassicas worldwide and the use of insecticides is the most used method to control this pest. Thus, the objective of this research was to select isolates of Beauveria bassiana with viability to control DBM. Seventeen isolates and one commercial product of B. bassiana were tested. DBM 2nd instar larvae were treated with conidial suspension at concentration of 107 conidia mL-1. For lethal concentration (LC) bioassay seven concentrations spaced on logarithmic scale were tested. The isolates CCA/UFES-4, 18, 31 and 35 were selected for LC bioassay because they caused over 90% confirmed mortality. The standard isolate ESALQ-447 and the commercial product had similar results and were also selected for LC bioassay. Based on the values estimated for LC50, the isolates CCA/UFES-4, 18, 31, ESALQ-447 and the commercial product can be selected for use in DBM control.

Keywords: Plutella xylostella, microbial control, entomopathogenic fungus, agricultural entomology.


 

 

A traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae), é considerada a principal praga em todas as regiões que cultivam espécies da família Brassicaceae. Isso devido ao seu alto potencial reprodutivo e ciclo de vida curto, o que lhe proporciona várias gerações por ano (Talekar & Shelton, 1993; Castelo Branco & Gatehouse, 2001; Castelo Branco & Medeiros, 2001; Ulmer et al., 2002; Torres et al., 2006). Os prejuízos ocasionados por essa praga são relacionados à alimentação das lagartas, as quais perfuram as folhas causando desvalorização, além de retardar o crescimento da planta e causar sua morte se medidas de controle não forem adotadas (Monnerat et al., 2004).

O método químico é o mais adotado para o controle de P. xylostella, sendo os piretróides e os fosforados os grupos mais utilizados (Castelo Branco & Medeiros, 2001; Monnerat et al., 2004). Quando utilizados sem critérios, os agrotóxicos podem selecionar populações resistentes desta praga às moléculas sintéticas (Godonou et al., 2009), além de causar efeitos tóxicos ao homem e a outros animais (Monnerat et al., 2004). Portanto, em virtude da contaminação ambiental, humana e a crescente preocupação da sociedade em consumir alimentos livres de resíduos químicos surgiu o Manejo Integrado de Pragas (MIP), que visa à manutenção das pragas abaixo do nível de dano econômico, utilizando para isso, métodos alternativos de controle, como também a associação deles (Gallo et al., 2002).

Entre as táticas de controle da traça-das-crucíferas, o controle biológico oferece uma solução sustentável para o manejo desta praga nos mais diversos agroecossistemas (Godonou et al., 2009). Dessa forma, o uso de agentes biológicos é considerado essencial para restabelecer o equilíbrio natural. Entre estes se destacam os entomopatógenos, como a bactéria Bacillus thuringiensis (Medeiros et al., 2006) e algumas espécies de fungos (Silva et al., 2003; Godonou et al., 2009).

Beauveria bassiana, uma espécie de fungo entomopatogênico amplamente utilizado no mundo, é encontrado na natureza causando doença e morte de vários insetos. Pesquisas têm demonstrado que este fungo é um agente capaz de infectar insetos em diferentes estágios de desenvolvimento, causando elevados índices de mortalidade, que podem chegar a 100% em condições de laboratório (Alves, 1998; Rohde et at., 2006). Também pode causar efeitos subletais diminuindo a viabilidade larval, a fecundidade, a viabilidade de ovos e a longevidade de adultos, como observado por Oliveira et al. (2008) para Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae).

Alguns trabalhos têm indicado a importância de B. bassiana no manejo integrado de P. xylostella, por ser virulento a essa praga (Silva et al., 2003) e também por ser possível a associação com parasitoides, como é o caso de Oomyzus sokolowskii (Hymenoptera: Eulophidae) (Santos Junior et al., 2006). Além disso, B. bassiana demonstrou apresentar efeito sinérgico quando associado em mistura com o óleo de mamona (Rondelli et al., 2011). Diante disso, e devido à grande variabilidade genética apresentada pelos fungos entomopatogênicos, destaca-se a importância da realização de bioensaios para a seleção de isolados que possam ser utilizados no controle microbiano. Assim, objetivou-se com este trabalho selecionar isolados de B. bassiana potenciais para utilização no controle microbiano da traça-das-crucíferas.

 

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido em laboratório, em câmara climatizada à temperatura de 26±1ºC, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 h e constou das seguintes etapas:

Obtenção e criação de P. xylostella - Os insetos usados nos experimentos foram provenientes da criação estoque mantida no Laboratório de Entomologia da UFES, originários de plantios de brássicas do município de Alegre (ES), criados em folhas de couve manteiga (Brassica oleracea var. acephala), de acordo com a metodologia desenvolvida por Barros & Vendramim (1999).

Obtenção, produção e revigoramento dos isolados de B. bassiana - Foram testados 17 isolados de B. bassiana oriundos do banco de entomopatógenos do Laboratório de Entomologia da UFES e do Laboratório de Patologia de Insetos da USP-ESALQ (Tabela 1), além do formulado comercial Boveril® PM (isolado ESALQ-PL63) (Itaforte, Itapetininga, SP). Por ocasião dos testes, os isolados foram reproduzidos em placas de Petri contendo meio de cultura batata-dextrose-ágar, acrescido de extrato de levedura e antibiótico (BDAY+A).

A reativação da virulência dos isolados foi feita em besouros da broca-do-café, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae), oriundos da criação do Laboratório de Entomologia da UFES (Leite et al., 2003). A viabilidade dos conídios foi aferida pelo método da germinação (Silva et al., 2003), sendo considerados viáveis quando apresentaram taxa de germinação superior a 90%.

Avaliação da patogenicidade de B. bassiana - As suspensões foram preparadas adicionando-se 10 mL de água destilada esterilizada (ADE) mais espalhante adesivo Tween® (E) 80 a 0,01% (ADE+E), em placas de Petri contendo meio de cultura e o fungo. Estas placas foram submetidas à agitação manual e raspagem com um pincel de cerdas macias esterilizado. Para preparar a suspensão com o formulado Boveril® PM misturaram-se 20 g do produto em 100 mL de ADE+E. As suspensões foram coadas com gaze esterilizada, quantificadas em câmara de Neubauer e ajustadas para a concentração de 107 conídios mL-1. Essa concentração foi escolhida com base em ensaios preliminares. Na testemunha foi utilizada ADE+E.

Dez lagartas de P. xylostella de segundo ínstar foram transferidas para placas de Petri (repetições) de 9,5 x 1,5 cm (diâmetro e altura) revestidas com papel filtro e foram pulverizadas utilizando torre de Potter com pressão de 15 lb pol-2 e 6 mL de suspensão de cada isolado, correspondendo um depósito médio de 1,62 mg cm-2. Esta quantidade está de acordo com o recomendado pela International Organization for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants/West Paleartic Regional Section (IOBC/WPRS), que é um depósito de 1,5 a 2,0 mg cm-2 (Overmeer & van Zon, 1982). Em seguida, foi colocado na placa um disco foliar de couve manteiga (B. oleracea var. acephala) de 8 cm de diâmetro com a face abaxial da folha para baixo. As placas foram tampadas e vedadas com filme de PVC transparente para prevenir a fuga das lagartas. Foram feitos três furos com um estilete pontiagudo no filme de PVC para possibilitar trocas gasosas.

A patogenicidade dos isolados foi diariamente observada, no momento em que os discos foliares eram trocados. Avaliou-se a mortalidade da fase larval até a morte do último inseto, caracterizada pela total imobilidade dos mesmos quando tocados com um pincel de cerdas macias. Foram consideradas vivas as lagartas que puparam. As lagartas mortas foram transferidas para câmara úmida para confirmação do agente causal.

Empregou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado com seis repetições (placas de Petri), contendo dez lagartas em cada repetição. A mortalidade corrigida foi calculada em relação à testemunha pela fórmula de Abbott (1925) e a mortalidade confirmada pela porcentagem de insetos nos quais ocorreu conidiogênese. Estes dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas entre si pelo teste de agrupamento de Scott-Knott, a 5% de probabilidade, utilizando o programa SAEG, v. 5.0. A sobrevivência larval em decorrência dos isolados selecionados na avaliação da patogenicidade foi comparada aos pares por meio do teste de Log-Rank utilizando-se o Proc LIFETEST do SAS (SAS Institute, 2000).

Avaliação da concentração letal (CL) dos isolados selecionados - Foram selecionados para a avaliação da concentração letal os isolados que proporcionaram mortalidade confirmada superior a 90%, além do isolado padrão ESALQ-447 e do formulado comercial (Boveril® PM). Esses isolados foram novamente revigorados na broca-do-café para serem novamente reproduzidos para a produção de conídios. A preparação e a aplicação das suspensões fúngicas foram realizadas adotando-se os mesmos procedimentos descritos na etapa destinada à avaliação da patogenicidade de B. bassiana.

Para a estimativa das concentrações letais foram utilizadas sete concentrações espaçadas em escala logarítmica, sendo os limites inferiores e superiores determinados mediante ensaios preliminares. Na testemunha foi utilizada ADE+E.

A virulência dos isolados foi avaliada conforme descrito na etapa destinada à avaliação da patogenicidade de B. bassiana. Foi utilizado o delineamento experimental inteiramente casualizado com cinco repetições, contendo dez insetos em cada repetição, totalizando 50 insetos por concentração e 350 insetos por isolado. As concentrações letais foram estimadas utilizando a análise de Probit com o auxílio do programa Polo-PC (LeOra Software, 1987).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Avaliação da patogenicidade de B. bassiana - Os isolados apresentaram diferença quanto à mortalidade corrigida (F17, 90= 60,12; p<0,0001). Os isolados CCA/UFES-18, CCA/UFES-24, CCA/UFES-31 e ESALQ-610 causaram mortalidade corrigida de 100% das lagartas de P. xylostella. Estes, no entanto, não diferiram dos isolados ESALQ-760, CCA/UFES-35, CCA/UFES-4 e CCA/UFES-29, os quais proporcionaram taxa de mortalidade corrigida entre 95,2% e 98,3%. Os demais isolados causaram taxas de mortalidade variando de 11,7% a 93,8% (Tabela 2).

 

 

Considerando a mortalidade confirmada, também houve diferença significativa entre as médias dos tratamentos (F17, 90= 20,04; p<0,0001). Os isolados que causaram mortalidade larval superior a 90% foram CCA/UFES-18 (93,9%), CCA/UFES-4 (92,1%), CCA/UFES-35 (91,4%) e CCA/UFES-31 (91,3%), entretanto sem diferir dos tratamentos CCA/UFES-24 (87,0%), Boveril® PM (86,4%), ESALQ-447 (85,8%), CCA/UFES-11 (84,8%), ESALQ-610 (84,2%), CCA/UFES-15 (83,0%) e ESALQ-760 (81,3%). Os demais isolados foram menos eficientes às lagartas de P. xylostella, proporcionando taxa de mortalidade confirmada variando de 4,5% a 77,3% (Tabela 2).

Esses resultados são semelhantes aos obtidos por Silva et al. (2003) que pulverizaram 2 mL de suspensão de conídios dos isolados ESALQ-634, ESALQ-447, IPA-205, ESALQ-900 e ESALQ-760 de B. bassiana na concentração de 108 conídios mL-1 sobre lagartas de P. xylostella e observaram mortalidade de 70 a 96%. Em outro estudo, foi pulverizado 2 mL do isolado ESALQ-447 na concentração de 107 conídios mL-1 em lagartas de P. xylostella no terceiro estádio obtendo mortalidade na fase larval de 55% (Santos Junior et al., 2006). A aplicação de suspensão menos concentrada e a utilização de insetos em estádios mais avançados tendem a proporcionar menores taxas de mortalidade, enquanto que suspensões mais concentradas tendem a causar índices de mortalidade maiores. O volume e a concentração da suspensão de conídios, em pulverização de insetos estão relacionados ao depósito do número de conídios no corpo do inseto. Contudo, quando se utiliza insetos mais velhos, o patógeno tem menos tempo para agir naquele estágio, podendo ser obtidas menores taxas de mortalidade (Silva, 2001).

No estudo de Godonou et al. (2009), lagartas da traça-das-crucíferas foram expostas a folhas de couve mergulhadas em suspensão de conídios (108 conídios mL-1) de oito isolados dos fungos B. bassiana e Metarhizium anisopliae por um minuto. Foi observada mortalidade variando de 20 a 94%, sendo os isolados Bba5653 de B. bassiana e Ma182 de M. anisopliae os que causaram maior mortalidade larval (94 e 90%, respectivamente), sendo a maior mortalidade confirmada observada para o isolado Bba5653 (31%).

A morte das lagartas pulverizadas com os isolados selecionados na concentração de 107 conídios mL-1 inicia-se a partir do primeiro dia. Com o passar do tempo houve acréscimo na mortalidade larval para todos os isolados avaliados. Em média, quatro dias é o tempo necessário para o fungo matar 50% das lagartas. A menor sobrevivência média das lagartas foi observada para os isolados CCA/UFES-35 e CCA/UFES-4 (3,66 e 3,74 dias, respectivamente), sendo a maior sobrevivência média para os isolados ESALQ-447 e o Boveril® PM (5,13 e 5,61 dias, respectivamente). No campo, com a morte precoce do inseto, é provável que menos injúrias sejam feitas nas plantas. Apesar do Boveril® PM ter sido o tratamento que proporcionou menor mortalidade larval, a sua curva de sobrevivência apresentou diferença quando comparada com a da testemunha por meio do teste de Log-Rank (Χ2GL=1= 66,14; p<0,0001). Também houve diferença entre os isolados (Χ2GL=5= 85,62; p<0,0001) (Figura 1).

 

 

Com relação à sintomatologia, as lagartas mortas pelo fungo normalmente adquiriam coloração rósea, resultante da produção de toxina pelo patógeno, evitando o crescimento de outros organismos sapróbios (Alves, 1998). Posteriormente apresentavam crescimento externo do fungo, geralmente após 24 a 48h, em câmara úmida. Logo após, ocorria a conidiogênese. Isso é essencial para sua rápida propagação dentro do campo de cultivo, pois outras lagartas podem ser infectadas.

Os resultados confirmaram a patogenicidade de todos os isolados, sendo que vários deles possuem grande potencial para a utilização no controle microbiano de P. xylostella. No entanto, preconizou-se utilizar no teste de concentração letal os isolados que proporcionaram mortalidade confirmada superior a 90%, os quais foram: CCA/UFES-4, CCA/UFES-18, CCA/UFES-31 e CCA/UFES-35, além do isolado padrão ESALQ-447 (85,8%) e do formulado Boveril® PM (86,4%), visando possibilitar uma comparação com outras pesquisas.

Avaliação da concentração letal (CL) dos isolados selecionados - Os menores valores de concentração letal (CL50) foram observados utilizando os isolados CCA/UFES-4 (1,69 x 105 conídios mL-1), ESALQ-447 (2,39 x 105 conídios mL-1) e Boveril® PM (3,08 x 105 conídios mL-1). No entanto, a CL50 desses isolados não diferiram dos isolados CCA/UFES-18 (3,45 x 105 conídios mL-1) e CCA/UFES-31 (4,72 x 105 conídios mL-1) de acordo com o intervalo de confiança da CL50 a 95% de probabilidade (IC a 95%). A maior CL50 foi observada para o isolado CCA/UFES-35 (8,53 x 105 conídios mL-1), que não diferiu de acordo com o IC a 95% apenas dos isolados CCA/UFES-18 e CCA/UFES-31 (Tabela 3). Maior valor de CL50 indica menor virulência, assim um isolado menos virulento necessita de maior concentração de conídios para causar a mesma mortalidade de insetos do que um isolado mais virulento. Em geral, os valores de CL50 obtidos foram baixos, demonstrando a alta suscetibilidade de P. xylostella a B. bassiana. Dessa forma, o uso de B. bassiana para o controle da traça-das-crucíferas provavelmente poderá ser um método econômico por não necessitar de pulverização de suspensão de conídios muito concentrada.

O isolado CCA/UFES-4 foi cinco vezes mais virulento para lagartas da traça-das-crucíferas do que o isolado CCA/UFES-35, demonstrando a importância de estudos de seleção de isolados em laboratório. Silva et al. (2003) obtiveram um valor de CL50 maior para o isolado ESALQ-447 (8,6 x 106 conídios mL-1) do que o observado neste estudo. Isso provavelmente ocorreu devido à diferença na metodologia de aplicação do fungo, visto que se utilizaram um mini-pulverizador manual, aplicando-se 2 mL de suspensão.

Os tratamentos que proporcionaram menores valores de CL90 foram Boveril® PM (2,53 x 106 conídios mL-1) e ESALQ-447 (4,42 x 106 conídios mL-1). Contudo, a CL90 desses isolados não diferiram dos isolados CCA/UFES-35 (6,91 x 106 conídios mL-1), CCA/UFES-4 (8,83 x 106 conídios mL-1) e CCA/UFES-31 (9,15 x 106 conídios mL-1) de acordo com o IC a 95%. A maior CL90 foi observada para o isolado CCA/UFES-18 (4,40 x 107 conídios mL-1), que não diferiu de acordo com o IC a 95% dos isolados CCA/UFES-4, CCA/UFES-31 e CCA/UFES-35 (Tabela 3).

A curva de concentração versus mortalidade do isolado CCA/UFES-35 e do Boveril® PM foram as que proporcionaram a maior inclinação, de acordo com o erro-padrão da média (1,4) (Tabela 3). Valores altos de inclinação da curva indicam que pequenas variações na concentração do fungo promovem grandes variações na mortalidade de P. xylostella.

Não foi possível identificar um isolado mais virulento para P. xylostella. No entanto, vários isolados proporcionaram baixo valor de CL50. Com isso, outros pontos importantes devem ser estudados, como a produção em larga escala sobre substrato artificial e a realização de testes em condições de campo, uma vez que microrganismos podem reagir diferentemente quando expostos a diferentes condições ambientais (Santos Junior et al., 2009). Em Benin, no campo com temperaturas diárias variando entre 21 e 31ºC e umidade relativa variando entre 66 e 99%, o isolado Bba5653 de B. bassiana controlou P. xylostella, proporcionando menor número de lagartas vivas por planta e maior peso médio das cabeças de repolho de aproximadamente três vezes (Godonou et al., 2009). Diversos estudos com outras espécies de lepidópteros comprovam a potencialidade desse fungo no manejo de pragas (Marques et al., 2000; César Filho et al., 2002), também sendo possível a sua associação com inimigos naturais no sistema produtivo das brássicas (Santos Junior et al., 2006).

Novos testes devem ser feitos com os isolados que proporcionaram menor CL50 sobre a traça-das-crucíferas, para verificar a ação sobre outras pragas-chave das crucíferas, como pulgões e outros lepidópteros, bem como a seletividade a parasitoides da traça-das-crucíferas, também importantes para a manutenção de baixos níveis da praga no campo.

Os isolados CCA/UFES-4, CCA/UFES-18, CCA/UFES-31 e ESALQ-447, bem como o formulado Boveril® PM, possuem viabilidade para serem utilizados no controle da traça-das-crucíferas, podendo ser uma alternativa eficaz ao controle convencional realizado, normalmente, com inseticidas sintéticos, objetivando o manejo da resistência de P. xylostella e, sobretudo na agricultura orgânica, na qual não são permitidos agrotóxicos.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela concessão de bolsa de estudos ao primeiro autor e de produtividade em pesquisa ao segundo autor; ao Programa de Pós-graduação em Entomologia Agrícola da Universidade Federal Rural de Pernambuco e à Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências Agrárias, pelo apoio à pesquisa.

 

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Recebido para publicação em 16 de setembro de 2011
Aceito em 6 de julho de 2012