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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.51 no.3 Belo Horizonte June 1999

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09351999000300001 

Microbiota anaeróbia isolada de bovinos com pododermatite

(Anaerobic bacterial species isolated from bovines with pododermatitis)

 

C.A. Silva1, L.A.F. Silva2, A.J. Mesquita2 , M.C.S. Fioravanti2, C.S. Acypreste3

1Estudante de Pós-Graduação da Escola de Veterinária da UFMG
2Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás
Caixa Postal 131
CEP 74001-970 - Goiânia, GO
3Estudante de Pós-Graduação da Escola de Veterinária da UFG

 

Recebido para publicação em 7 de agosto de 1998.
Colaborador: G.T. Borges

 

 

RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo isolar e identificar espécies bacterianas anaeróbias presentes nos pés de bovinos portadores de vários graus de pododermatite. Foram utilizados 60 bovinos, distribuídos em quatro grupos de 15. O grupo I foi constituído por animais saudáveis e serviu de controle; o grupo II, por bovinos na fase inicial do processo; o grupo III, por animais portadores de pododermatite interdigital vegetativa e o grupo IV, por bovinos portadores de pododermatite necrosante. Foram colhidos fragmentos de tecido interdigital para cultura e as principais espécies bacterianas isoladas foram: Dichelobacter nodosus nos grupos II, III e IV e Fusobacterium necrophorum nos grupos III e IV, com freqüências de 26,7%, 6,7%, 20,0%, 6,7% e de 13,3%, respectivamente. Encontraram-se também Fusobacterium symbiosum em 40,0% no gb>rupo I, 6,7% no grupo II, 13,3% no grupo III e 13,3% no grupo IV, Bacteroides sp. em 6,7% nos grupos I e IV, Bacteroides ruminatus em 33,3% no grupo I, 6,7% no grupo II, 33,3% no grupo III e 13,3% no grupo IV, Bacteroides oralis em 6,7% no grupo III e Fusobacterium mortiferum em 6,7% no grupo IV.

Palavras-Chave: Bovino, pododermatite, bactéria anaeróbia

 

ABSTRACT

The objective of this study was to isolate and identify the anaerobic bacteria species in bovine with different degrees of pododermatitis. Sixty bovines were divided into four groups of 15 as follows: group I included healthy animals, used as control; group II with animals in the initial phase of the process; group III, with animals displaying interdigital skin hyperplasia and group IV with animals with footrot. Interdigital tissue fragments were collected and processed for isolation and identification of anaerobic agents. The bacteria species isolated were: Dichelobacter nodosus in groups II, III and IV and Fusobacterium necrophorum only in groups III and IV, with frequencies of 26.7%, 6.7%, and 20.0% for the former and 6.7% and 13.3% for the latter, respectively. In addition, Fusobacterium symbiosum was present in 40.0% of group I, 6.7% of group II, 13.3% of group III and 13.3% of group IV; Bacteroides sp. in 6.7% of groups I and IV; Bacteroides ruminatus in 33.3% of group I, 6.7% of group II, 33.3% of group III and 13.3% of group IV; Bacteroides oralis in 6.7% of group III, and Fusobacterium mortiferum in 6.7% of group IV.

Keywords: Bovine, pododermatitis, anaerobic bacteria

 

 

INTRODUÇÃO

Nos bovinos, as doenças dos dígitos como dermatite interdigital, erosão ungular, dermatite verrucosa, dermatite digital, flegmão interdigital, pododermatite asséptica (laminite), pododermatite circunscrita (úlcera de sola), fissuras longitudinais e transversais, deformação ungular, pododermatite séptica (necrobacilose interdigital, "footrot") e hiperplasia interdigital são consideradas causadoras de claudicação, sendo a pododermatite séptica a mais comum (Nocek, 1993).

A fase inicial da doença caracteriza-se por tumefação na pele do espaço interdigital, acompanhada de claudicação, aumento de volume da extremidade do membro e, em alguns casos, fistulação com exsudação de líquido sanguinolento de odor desagradável, sem lesões macroscopicamente visíveis no estojo córneo, espaço interdigital, perioplo, sola e talão (Silva et al., 1998). Segundo Mgasa (1987), após instalado, o processo infeccioso desencadeia várias alterações no tecido interdigital que resultam em claudicação severa e queda de produção. Para Greenough (1994), os sinais clínicos variam com a localização da infecção, porém a claudicação aguda é o principal sintoma.

A etiologia e descrição das diversas formas das afecções do casco foram estudadas por vários autores (Saraiva, 1984b; Greenough, 1987; Pesce et al., 1992; Edmonson, 1994; Blowey & Done, 1995), sendo Dichelobacter nodosus e Fusobacterium necrophorum os principais agentes infecciosos envolvidos (Pesce et al., 1992).

O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar a microbiota anaeróbia dos pés de bovinos saudáveis e portadores de três formas de apresentação clínica de pododermatite: fase inicial do processo, pododermatite interdigital vegetativa e pododermatite necrosante.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 60 bovinos com idade entre 15 e 156 meses, de peso corporal, sexo, raça, aptidão e manejo variados, provenientes de propriedades rurais com casos de pododermatite. Os animais foram separados, após realização de exame clínico, em quatro grupos de mesmo número, sendo o grupo I constituído por animais clinicamente saudáveis (controle); o grupo II, por animais na fase inicial da doença, com claudicação porém sem lesão macroscópica aparente do estojo córneo e da pele; o grupo III, por animais com a patologia estabelecida, portadores de fibrose interdigital (pododermatite interdigital vegetativa) e o grupo IV, por animais com lesões do tipo ulcerativas, com fissura e necrose evidente (pododermatite necrosante).

Os animais foram atendidos e tratados nas propriedades de origem. Os bovinos foram contidos em decúbito lateral e submetidos a biópsia. A extremidade do membro locomotor foi lavada com água e sabão e a anti-sepsia completou-se com aplicação de solução à base de iodophor (BIOCID - Pfizer Química Ltda. - Guarulhos, São Paulo.). Para a colheita do fragmento do tecido interdigital, primeiramente removeu-se a camada superficial da pele íntegra nos animais dos grupos I e II, e nos do grupo III, quando não existia necrose na área fibrosada. Nos bovinos do grupo IV retirou-se todo o tecido necrosado. Imediatamente após, trocou-se a lâmina do bisturi e colheram-se fragmentos de aproximadamente 0,5cm2 com que foram depositados em tubos de ensaio com caldo de carne cozida e selados com óleo mineral.

O meio para colheita de material, caldo de carne cozida, foi preparado segundo Métodos... (1981), esterilizado a 121ºC por 15 minutos e acondicionado a 4ºC em geladeira. Para cada 10ml de água destilada foram adicionados 1,18g de coração de boi, 0,052g de peptona bacteriológica, 0,005g de glicose e 0,013g de cloreto de sódio.

Os meios de cultura utilizados na repicagem do material eram preparados em pequena quantidade, sempre que necessário, com o objetivo de manter um nível propício de umidade para o crescimento bacteriano. Utilizaram-se dois meios de cultura, conforme metodologia proposta por Saraiva (1984a,b), um seletivo (ágar sangue com cristal violeta) e outro para isolamento (ágar sangue). Os procedimentos metodológicos foram adaptados visando o eficaz isolamento bacteriano. Seguindo este princípio, da menor complexidade possível desse processo, o Centro de Pesquisa em Alimentos (CPA) da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás desenvolveu uma síntese do prescrito por Saraiva (1984a,b). O ágar sangue com cristal violeta foi usado como meio seletivo para Gram-negativo e continha um litro de água destilada, 52g de ágar cérebro-coração, 0,1% de cloridrato de cisteína, 0,01% de cristal violeta, 5% de sangue desfribinado de ovino e pH 7,4. O ágar sangue, utilizado como meio de isolamento, foi preparado com um litro de água destilada, 52g de ágar cérebro-coração, 5% de sangue desfibrinado ovino e pH 7,4. Os meios foram autoclavados a 121ºC por 15 minutos.

Todo o material colhido do espaço interdigital foi inoculado em caldo de carne cozida e mantido em temperatura ambiente até chegar ao laboratório para, em seguida, ser incubado à temperatura de 37ºC, por 48 horas. Fez-se a primeira repicagem em ágar sangue com cristal violeta e a incubação em jarra de anaerobiose a 37ºC, por 48 horas. Ao término desse período, as colônias típicas foram repicadas em ágar sangue e as placas incubadas em anaerobiose a 37ºC, por 48 horas. O ambiente de anaerobiose foi obtido por meio de sachês (Anaerocult A Microbiologie - Merck, Alemanha) e o grau de anaerobiose medido por meio de fitas (Anaerotest Microbiologie - Merck, Alemanha) afixadas com fita adesiva à parede da jarra.

A morfologia das colônias bacterianas e a motilidade do D. nodosus e do F. necrophorum foram estudadas e caracterizadas de acordo com Saraiva (1984a,b), Holdeman et al. (1986) e Baron et al. (1994).

Após o isolamento das colônias, procedeu-se ao teste do KOH a 3%, realizado para classificar a bactéria em Gram-negativa ou positiva, conforme as recomendações de Baron et al. (1994).

Obtidos os resultados das provas acima descritas, as colônias foram diluídas em meio basal anaeróbio API e em seguida distribuídas em fitas API 20A (API 20A - Analytica Profile Index 1981, Alemanha) com as seguintes provas bioquímicas: indol (IND), uréia (URE), glicose (GLI), manitol (MAN), lactose (LAC), sacarose (SAC), maltose (MAL), salicina (SAL), xilose (XIL), arabinose (ARA), esculina (ESC), glicerol (GLY), celobiose (CEL), manose (MNE), melizitose (MLZ), rafinose (RAF), sorbitol (SOR), rhamnose (RHA), trealose (TRE) e catalase (CAT). Foram identificadas e incubadas por 48 horas, a 37ºC, em anaerobiose, após o que, procedeu-se à leitura.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A caracterização clínica da pododermatite utilizada neste trabalho foi definida por Silva et al. (1998) e fundamentou-se na sintomatologia descrita por Saraiva (1984a, b), Magsa (1987), Nocek (1993), Greenough (1994), Edmonson (1994) e Silva et al. (1996).

A detecção da bactéria na pele do tecido interdigital pode ser feita por "swab" (Duran et al., 1990), cultura tecidual ou por esfregaços corados pelo método de Gram (Depiazzi et al., 1998). Neste trabalho utilizou-se somente a cultura, uma vez que se optou por verificar a presença de bactérias em camadas mais profundas do tecido.

A metodologia utilizada para a colheita do material para a cultura foi eficiente, pois permitiu o crescimento da microbiota esperada. Esse procedimento é similar ao proposto por Saraiva (1984a, b), Duran et al. (1990) e Carter et al. (1995). O meio de enriquecimento preparado com caldo de carne cozida também mostrou-se eficiente para o crescimento de bactérias anaeróbias, podendo ser utilizado como método alternativo. Este meio também é recomendado pelo Métodos... (1981), entretanto, os autores acima não mencionam qualquer método de selagem, medida que foi considerada de grande importância, pois manteve o meio de cultura com baixa tensão de oxigênio.

Muitos meios de cultura são utilizados para o isolamento do D. nodosus e do F. necrophorum. Duran et al. (1990) utilizaram seis diferentes meios de cultura e o que produziu melhor resultado para o primeiro agente foi o ágar brucela enriquecido com G-N suplemento anaeróbio e, para o segundo, foi o ágar gema de ovo Fusobacterium. Ambos foram incubados em jarra de anaerobiose a 37ºC por três dias. Thomas (1978), citado por Saraiva (1984b), recomenda para D. nodosus a utilização do meio de casco ovino composto por extrato de carne, extrato de levedura, protease peptona, ágar e água; o pH deve ser de 7,4 e a incubação a 37ºC por 48 horas em anaerobiose. Pesce et al.(1992) recomendam para D. nodosus o ágar prezunho a 4% com incubação em anaerobiose a 37ºC, por 96 horas. Scanlan et al. (1986) conseguiram isolar F. necrophorum em ágar BHI (infusão de cérebro-coração). Entretanto, optou-se pelos meios de cultura ágar sangue com cristal violeta e ágar sangue (Saraiva, 1984a,b), preparados segundo metodologia do CPA, devido à praticidade na elaboração e à sua eficiência no isolamento dos agentes bacterianos estudados.

Nas culturas foram isolados e identificados três gêneros de bactérias anaeróbias: Dichelobacter, Fusobacterium e Bacteroides. A identificação das colônias foi realizada de acordo com as características morfológicas e tintoriais de cada agente, descritas por Holdeman et al. (1986) e Baron et al. (1994).

A realização das provas bioquímicas foi o último passo para a identificação bacteriana. As principais provas utilizadas para a caracterização do Dichelobacter nodosus e do Fusobaterium necrophorum foram a produção de indol e de urease, a fermentação da glicose, do manitol, da lactose, da sacarose, da maltose, da salicina, da xilose, da arabinose, da esculina, do glicerol, da celobiose, da manose, da melizitose, da rafinose, do sorbitol, da rhamnose e da trealose, e a produção da catalase (Virginia..., 1975). Nesse experimento, as provas bioquímicas para a classificação bacteriana em espécie mostraram-se eficazes e proporcionaram confiabilidade nos resultados. Virginia... (1975) e Holdeman et al. (1986) recomendam, ainda, o uso de outras provas como a liquefação da gelatina, a digestão da carne e a utilização do adonitol. No experimento piloto, a utilização das provas bioquímicas citadas inicialmente foi suficiente para identificar as bactérias estudadas, fato que determinou a preterição das três últimas. A diminuição no número de provas efetuadas na classificação é importante uma vez que reduz o custo final do diagnóstico

As diferentes espécies bacterianas encontradas nos diferentes grupos experimentais estão relacionadas na Tab. 1.

 

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D. nodosus foi encontrado com maior freqüência no grupo II, ou seja, nos animais na fase inicial da doença, o que pode significar uma possível participação desta bactéria na etiopatogenia do processo patológico em questão, apesar de, macroscopicamente, não se observarem lesões no espaço interdigital, no perioplo ou no estojo córneo. A ocorrência de lesões é considerada por Duran et al. (1990) fator essencial para a entrada dos agentes bacterianos. Dessa forma, acredita-se que, pelo fato de não se observar qualquer lesão aparente nesse local, seria necessária a realização de exames histopatológicos do tecido cutâneo interdigital, de modo a identificar a presença de reações inflamatórias e/ou infecciosas nas camadas mais profundas do tecido, o que possibilitaria a indicação da participação do D. nodosus como agente desencadeante do processo. Esses achados estão de acordo com os resultados obtidos por Ribeiro (1980), Saraiva (1984b), Fajardo et al. (1987) e Baron et al. (1994), os quais afirmam ser o D. nodosus o agente etiológico da pododermatite bovina. Blowey (1992) relata que a necrobacilose interdigital está associada ao F. necrophorum, o que confirma os achados deste experimento, pois foi possível isolá-lo nos animais dos grupos III e IV, com os bovinos do último grupo apresentando necrose característica advinda da presença desse agente.

Para Ribeiro (1980), Holdeman et al. (1986), Pesce et al. (1992), Baron et al. (1994) e Carter et al. (1995), a pododermatite bovina resulta da ação sinérgica do D. nodosus e do F. necrophorum. Todavia, diante dos resultados obtidos, a pequena porcentagem dos dois agentes encontrada nos animais portadores de pododermatite não foi considerada suficiente para afirmar que eles eram os principais agentes desencadeadores da doença. No entanto, como se trata de agentes anaeróbios exigentes, pode não ter sido possível recuperar todas as bactérias presentes no tecido interdigital. Além disso, na pododermatite interdigital vegetativa, o tecido fibroso é protegido pela pele e, nos casos onde não existe solução de continuidade, as condições não são adequadas para a penetração e desenvolvimento do agente microbiano. Blowey & Done (1995) não conseguiram isolar D. nodosus e F. necrophorum de animais portadores de pododermatite. Clark et al. (1985) não reproduziram a doença por meio de injeções subcutâneas de culturas puras de F. necrophorum e de B. melaninogenicus. Duran et al. (1990) isolaram, de ovinos portadores de pododermatite necrosante, D. nodosus em 56,8% dos animais estudados e F. necrophorum em 19,2%. A avaliação desses dados permite concluir que, mesmo nos casos clínicos da doença, nem sempre é possível isolar as bactérias a partir das lesões de pododermatite.

Como no presente experimento utilizaram-se somente meios de cultura específicos para bactérias anaeróbias e não se realizaram esfregaços, não foi possível verificar a presença de espiroquetas, microrganismos encontrados por Peterse (1992), Borgman et al. (1996) e Doherty et al. (1998) em lesões de pododermatite. Entretanto, isolaram-se e identificaram-se microorganismos como Fusobacterium symbiosum, 40,0% no grupo I, 6,7% no grupo II, 13,3% no grupo III e 13,3% no grupo IV; Bacteroides sp., 6,7% nos grupos I e IV; Bacteroides ruminatus, 33,3% no grupo I, 6,7% no grupo II, 33,3% no grupo III e 13,3% no grupo IV; Bacteroides oralis, 6,7% no grupo III e Fusobacterium mortiferum 6,7% no grupo IV.

Duran et al. (1990) também isolaram inúmeras espécies do gênero Bacteroides e concluíram que a pododermatite é, provavelmente, um processo multifatorial, resultante da invasão de uma lesão prévia do casco por bactérias presentes no solo. No entanto, os animais estudados por esses autores eram portadores de pododermatie necrosante e, como nesses casos a integridade do casco encontra-se comprometida, a invasão por inúmeras espécies bacterianas é inevitável.

 

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