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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.51 no.4 Belo Horizonte Aug. 1999

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09351999000400015 

Análise de polimorfismos do gene da k-caseína em fêmeas da raça Nelore e efeito sobre o peso à desmama de suas progênies

(Polimorphism analysis of k -casein gene on Nelore females and effect on weaning weight of the calves)

 

F.J.C. Faria1, S.E.F. Guimarães2, R.M.G. Lima1, G.B. Mourão1, L.E.L. Pinheiro3

1Escola de Veterinária da UFMG
Caixa Postal 567
30123-970 – Belo Horizonte, MG
2Departamento de Veterinária – UFV
3Colégio Brasileiro de Reprodução Animal

 

Recebido para publicação, após modificação, em 1 de fevereiro de 1999.
E-mail: fariafjc@dedalus.lcc.ufmg.br

 

 

RESUMO

Informações sobre peso à desmama de um rebanho Nelore, após ajuste para idade padrão de 205 dias, sexo da cria, idade da mãe, touro e mês de desmama, foram utilizadas para separar as reprodutrizes em dois grupos, cujos produtos diferiam em peso. As médias ajustadas pelo método dos quadrados mínimos e erros-padrão para os grupos pesado (P) e leve (L) foram 163,21±2,18kg e 134,44±2,18kg, respectivamente, com 41 animais em cada grupo. Colheram-se amostras de sangue das reprodutrizes para o estudo de polimorfismos do gene da k-caseína, pela técnica de polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. A análise de um segmento do éxon IV do gene da k-caseína identificou os genótipos 71AA, 10AB e 1BB, com as freqüências de 0,92 e 0,08 para os alelos A e B, respectivamente. Os pesos à desmama dos produtos dos genótipos AA e AB foram, respectivamente, 147,73±2,38kg e 156,76±6,35kg. Os grupos P e L não diferiram entre si quanto às freqüências alélicas apresentadas para esse gene. O genótipo das reprodutrizes não afetou o peso à desmama de suas crias, existindo, portanto, outros efeitos genéticos e não genéticos de maior magnitude.

Palavras-chave: Bovino, Nelore, k-caseína, polimorfismo genético

 

ABSTRACT

Data from a Nelore herd were used after adjustment of the weaning weight for 205 days of age, sex, age of dam, sire and month of weaning resulting two groups of cows that differed in weaning weight of their calves. The least square means (LSM) and standard error (SE) were 163.21±2.18kg and 134.44±2.18kg, for heavy (H) and light (L) groups, with 41 animals each one. These animals were genotyped for DNA polymorphisms of k-casein gene, using PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism). The segment analysis of k-casein IV exon identified the genotypes 71AA, 10AB and 1BB, with frequencies of 0.92 and 0.08 for A and B alleles, respectively. The LSM±SE for weaning weight were 147.73±2.38kg and 156.76± 6.35kg for calves of AA and AB genotype cows. Heavy and light groups were similar for the allelic frequencies for this gene. The dam’s genotype did not affect the weaning weight of the calves. This suggests the existence of another genetic or non-genetic factors with major magnitude.

Keywords: Cattle, Nelore, k-casein, genetic polymorphism

 

 

INTRODUÇÃO

A seleção artificial praticada pelo melhoramento animal baseia-se em avaliações genéticas que predizem o mérito genético aditivo para determinada característica (Moody et al., 1994).

Nos últimos anos, com o avanço da biologia molecular, o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR-Polymerase Chain Reaction) e a descoberta de micro-satélites de DNA tornaram possível a identificação de polimorfismos em vários sítios genômicos nos animais. Estes sítios, chamados de loci marcadores, não são necessariamente determinantes de características de interesse econômico (QTL-Quantitative Trait Loci), mas podem estar ligados a eles. Várias espécies animais têm tido o seu genoma mapeado, descobrindo-se marcadores ou genes ligados aos QTL.

As técnicas moleculares aplicadas à genética, aliadas às técnicas tradicionais de melhoramento, poderão proporcionar maior ganho genético ao determinar o potencial do animal, antes que este expresse o seu fenótipo. O marcador genético serve para relacionar favoravelmente alelos de características quantitativas identificadas no mesmo cromossomo, e sua detecção, juntamente com o mapeamento do genoma, propicia informações sobre o modo de ação gênica individual e suas interações, auxiliando na compreensão da variação quantitativa e sua utilização prática na criação animal.

Assim, os marcadores de DNA apresentam duas possíveis aplicações futuras na seleção animal, a combinação dos melhores alelos de duas ou mais raças e a seleção dos melhores alelos dentro de uma raça ou linhagem (Haley, 1995).

O presente trabalho teve como objetivos determinar as freqüências alélicas da k-caseína em fêmeas da raça Nelore e verificar a associação dos genótipos das reprodutrizes com o peso à desmama de suas crias.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados animais registrados da raça Nelore (Puro de Origem e Livro Aberto). Os animais são mantidos em pastagens de braquiária e recebem suplemento mineralizado ad libitum durante todo o ano. De uma população de 398 reprodutrizes foram selecionadas fêmeas para comporem a amostra inicial. A seleção dessas fêmeas foi baseada no peso à desmama de seus filhos, ajustado para 205 dias, nascidos na estação de 1995.

Nas análises, foram excluídos da amostra inicial os bezerros que não atingiram 120kg à desmama ou a progênie cujo pai era desconhecido, permanecendo dados referentes a 383 bezerros. Os bezerros nasceram entre os meses de agosto de 1994 e janeiro de 1995 e não foram pesados ao nascer. A desmama e pesagem ocorreram entre os meses de março e agosto de 1995. As análises foram realizadas sobre os pesos ajustados para 205 dias.

Devido à distribuição inadequada entre as idades das reprodutrizes, elas foram divididas em três classes de idade, a saber: classe 1; fêmeas com idade superior a 2,9 anos e até 5,9 anos; classe 2; fêmeas com idade superior a 5,9 anos e até 9,9 anos; classe 3; fêmeas com idade superior a 9,9 anos e inferior a 14,1 anos.

O modelo estatístico utilizado para o ajuste do peso à desmama (P205) foi:

Yijklm= m + Pi + Sj + Mk + Cl + eijklm, em que:

Yijklm = peso à desmama calculado para 205 dias de idade;
m = média geral da característica;
P = efeito fixo do iésimo reprodutor, pai do bezerro (i=1,2,...,12);
Sj = efeito fixo do jésimo sexo do bezerro (j=1,2);
Mk = efeito fixo do késimo mês de desmama do bezerro (k=1,2,...,5);
Cl = efeito fixo da lésima classe de idade da reprodutriz (l=1,2,3);
eijklm = erro aleatório.

Após ajuste pelo modelo acima foram identificados dois grupos de fêmeas, denominados pesado (P) e leve (L), com 41 animais cada, que diferiram substancialmente (P<0,0001) quanto ao peso à desmama de seus produtos. Os grupos apresentaram médias ajustadas pelo método dos quadrados mínimos e erros-padrão de 163,21±2,18kg e 134,44±2,18kg para P e L, respectivamente, com média geral de 148,83kg para os 82 animais. A amostra foi composta pelas progenitoras, mães dos bezerros, em função da referida classificação, as quais foram submetidas à colheita de sangue para a genotipagem. Com base nessa diferença de grupo, analisou-se o genótipo das mães na intenção de identificar marcadores genéticos que pudessem estar associados às diferenças no peso à desmama.

De cada animal, colheram-se da circulação periférica, aproximadamente 10ml de sangue, em tubos vacutainer heparinizados e estéreis, os quais foram resfriados a 4ºC. O DNA da amostra foi extraído segundo o protocolo descrito por Walsh et al. (1991), e os oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados neste experimento foram sintetizados pela NBI-National Biosciences, por meio da Incibrás Biotecnologia, conforme descrição de Zadworny & Kunhlein (1990). Esses primers amplificam uma região de 99 pares de base do éxon IV do gene da k-caseína bovina. A região amplificada possui as substituições de nucleotídeos responsáveis pela diferenciação das variantes genéticas A e B.

Em todas as reações de amplificação utilizou-se um controle (branco/sem DNA) para confirmar a ausência de contaminação na execução do sistema. Cada reação de amplificação consistiu de tampão da PCR 1X (KCl 500mM, Tris-Cl pH 8.3 100mM), 0,3mM de cada primer (NBI), 0,1mM de dNTP (Promega), 0,1U/ml Taq Polimerase (Cenbiot/RS, PHN/MG), 2,0mM MgCl2 (Promega), 2,0mL de DNA genômico e Água mili-Q qsp 10ml.

As amplificações foram realizadas em termociclador PTC 100-MJ Research com capacidade para 60 tubos. O programa utilizado para amplificação do gene da k-caseína segue descrito: 1º ciclo 94ºC por 3min, 2º ciclo 62ºC por 1min, 3ºciclo 72ºC por 2min, repetido 33 vezes.

O material amplificado foi analisado em gel de poliacrilamida a 4%. Após a amplificação, o produto desta foi digerido com enzima de restrição e visualizado em gel de poliacrilamida a 8%. Para identificação das bandas utilizou-se um padrão de peso molecular pGEM (Promega). Dessa maneira, foram feitas as eletroforeses das amostras em cuba vertical de acrílico com tampão de corrida TBE 1X a 100 volts por uma hora. Uma vez realizadas as amplificações (e constatadas em gel a 4%), seguia-se a digestão desse material (5ml), que era homogeneizado e incubado a 370C por seis horas. A enzima utilizada na digestão foi a Hind III, visto ser ela recomendada para a determinação dos genótipos (Pinder et al., 1991; Cronin & Cockett, 1993). Essa enzima detecta um sítio de restrição no alelo B, gerando fragmentos de 65 e 34pb. A visualização de um fragmento de 99pb permite identificar o genótipo AA, os fragmentos de 99, 65 e 34pb identificam o heterozigoto AB e a presença dos fragmentos de 65 e 34pb identifica o genótipo BB. Dessa maneira, foi necessária a utilização de um animal AB sempre que se procedia a digestão, para evitar erros na detecção do genótipo. Após a digestão, o material foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida 8% (p/v) por uma hora a 100 volts. Para visualizar as bandas de DNA do material amplificado ou digerido procedia-se à coloração dos géis pelo método da prata.

Após a identificação dos polimorfismos genéticos do gene da k-caseína por meio da técnica de PCR-RFLP, obtiveram-se as freqüências genotípicas e alélicas para cada um dos grupos (P e L). Utilizou-se o teste de dispersão de freqüência (qui-quadrado) para a verificação do equilíbrio de Castle-Hardy-Weinberg da amostra geral e dentro de cada grupo. Esse teste também foi utilizado para se compararem as freqüências alélicas e genotípicas entre os grupos.

Adicionalmente, foram realizadas análises de variância usando-se o "Statistical Analysis System" (SAS, 1994) para averiguação do efeito do genótipo materno sobre o peso à desmama dos bezerros. Neste caso específico foi desconsiderado durante a análise o genótipo BB do gene da k-caseína pois apresentava apenas um animal em toda a amostra. O nível de significância foi estabelecido em 5%.

O modelo estatístico utilizado para os genótipos de k-caseína (AA e AB) foi:

Yij = m + Gi + eij, em que:

Yij = peso à desmama ajustado;
m = média geral;
Gi = efeito fixo do iésimo genótipo;
eij = erro aleatório.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O modelo de ajuste de peso à desmama considerou os efeitos fixos de touro, mês de nascimento, sexo do bezerro e classe de idade da vaca (mãe do bezerro) e todos foram significativos (P<0,01), conforme pode ser visto na Tab. 1. Depois de feito o ajuste, foi dado prosseguimento à identificação dos genótipos.

 

 

A Fig. 1 mostra gel a 8% onde podem ser visualizados os diferentes genótipos encontrados. Após identificação dos genótipos dos animais e, por conseguinte, obtenção das freqüências alélicas, aplicou-se o teste do qui-quadrado na amostra (independente de grupo), sendo que este não mostrou significância (P>0,05), indicando, portanto, o equilíbrio de Castle-Hardy-Weinberg da amostra. Os grupos também não diferiram entre si (P>0,05). A Tab. 2 apresenta o número total de genótipos identificados, os genótipos por grupo e a freqüência alélica total.

 

 

 

Comparando-se as freqüências alélicas obtidas neste trabalho com as de outras raças zebuínas descritas na literatura nacional (Castelhano et al., 1996; Del Lama & Zago, 1996; Neves et al., 1996; Rosa et al., 1996; Valente, 1996), observa-se similaridade nos resultados. Entretanto, para animais zebuínos estudados na Índia, Juneja & Chaudhary (1973) e Jairam & Nair (1983) citam maiores freqüências do alelo B.

A freqüência do alelo B nos zebuínos criados no Brasil varia de 0,02 a 0,10 sendo, portanto, inferior às freqüências obtidas nas raças indianas (0,16-0,21). Apesar de serem raças distintas, pode-se supor que essa diferença na freqüência seja função do efeito fundador, visto ter sido o rebanho zebuíno nacional formado por poucos animais. Outro fator que poderia explicar tal freqüência é o efeito da seleção, pois os criadores, ao selecionarem algumas características quantitativas, estariam indiretamente escolhendo animais homozigotos para o alelo A ou utilizando os heterozigotos em pequenas proporções.

Valente (1996) verificou que as 47 fêmeas Gir estudadas, em rebanho com intensa seleção para leite, eram homozigotas para o alelo A. Juneja & Chaudhary (1973), trabalhando com animais indianos, não encontraram indivíduos do genótipo BB. É possível que o alelo A tenha sido selecionado indiretamente nesses casos, considerando a possibilidade de estar ele associado à maior produção leiteira (quantidade). Ao se confrontarem esses resultados com os de animais europeus, verifica-se também variação entre raças. Buchberger (1995), ao analisar as freqüências alélicas em várias raças taurinas, relatou menores freqüências do alelo A nas raças Jersey e Normanda, que variaram entre 0,49 e 0,32. Neste trabalho pode-se verificar que há variabilidade genética para esse locus tanto entre raças como dentro de raças, e que as maiores freqüências do alelo B se encontram em duas raças taurinas com maior seleção para produção de leite.

Dessa forma, a avaliação das diferenças alélicas de genes específicos entre raças distintas é de grande importância para o melhoramento animal, pois, investigações de associações entre polimorfismos e características quantitativas requerem, antes de tudo, o estudo de freqüência em uma população.

Foi realizada análise do efeito do genótipo materno sobre o peso à desmama após a exclusão de um animal de genótipo BB. Os 71 animais com genótipo AA apresentaram média ajustada e erro-padrão de peso de seus produtos de 147,73±2,38kg, e os 10 animais restantes, de genótipo AB, obtiveram média ajustada e erro-padrão de 156,76±6,35kg. Apesar de não apresentar significância (P>0,05), os heterozigotos foram aproximadamente 10kg mais pesados aos 205 dias de idade que os homozigotos. A amostra estudada foi pequena, entretanto, não se pode garantir que o aumento do número de animais resulte em efeito significativo do genótipo.

Apesar de esse gene apresentar efeito sobre as características físico-químicas do leite, não foi possível, neste experimento, verificar associação entre polimorfismos de DNA e características ponderais. Castelhano et al. (1996) não observaram efeito do genótipo sobre peso ao nascimento, peso à desmama e peso ao final da prova de ganho de peso em animais Guzerá. Vale ressaltar que características quantitativas estão sujeitas a efeitos de outros genes e do ambiente. Além disso, os genes das proteínas lácteas são especificamente expressos durante a lactação e estão sob controle multi-hormonal (prolactina, glicocorticóides, 17 b-estradiol). Por conseguinte, Muir (1997) relata ser muito baixa a probabilidade de se encontrarem genes com grandes efeitos (major genes) para características que estão sob seleção há algumas gerações.

Atualmente, existe a possibilidade de utilização de vários métodos moleculares para análise de polimorfismos, mas nenhuma consistência para esse gene foi estabelecida. Faz-se preciso considerar a baixa freqüência do alelo B, o que não permitiu utilizar o único animal BB encontrado durante o processo de análise estatística, e também aumentar o número de animais e rebanhos em análises com o objetivo de estudar a possível associação entre marcadores genéticos e características quantitativas.

 

CONCLUSÕES

Existe variabilidade para o sítio de restrição detectado no éxon IV do gene da k -caseína para esta amostra estudada e os alelos parecem estar segregando em equilíbrio de Castle-Hardy-Weinberg. Não foi possível detectar associação entre o genótipo das reprodutrizes e o peso à desmama de suas crias, existindo, portanto, outros efeitos de maior magnitude. É preciso considerar um número maior de animais e rebanhos nas análises em genética molecular para que se possa verificar, com maior precisão, se existe a associação desse gene à característica estudada.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Arley C. Silveira pela concessão dos dados e rebanho que contribuíram para este estudo. Suporte Financeiro: PADCT/FINEP e CNPq.

 

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