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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.51 n.6 Belo Horizonte Dec. 1999

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09351999000600011 

Análise de polimorfismo do gene da somatotropina em vacas Nelore e seu efeito sobre o peso à desmama de suas progênies

(Polimorphism analisys of somatotropin gene on Nelore cows and effect on weaning weight of the calf)

 

F.J.C. Faria1, S.E.F. Guimarães2, R.M.G. Lima1, G.B. Mourão1, L.E.L. Pinheiro3

1Escola de Veterinária da UFMG
Caixa Postal 567
30123-970 – Belo Horizonte, MG
2Universidade Federal de Viçosa
3Colégio Brasileiro de Reprodução Animal

 

Recebido para publicação em 23 de fevereiro de 1999.
E-mail: fariafjc@dedalus.lcc.ufmg.br
Suporte financeiro: PADCT/FINEP e CNPq

 

 

RESUMO

Informações sobre peso à desmama de um rebanho Nelore foram utilizadas após ajuste para idade padrão de 205 dias, sexo da cria, idade da mãe, touro e mês de desmama, para separar as reprodutrizes em dois grupos, cujos filhos diferiam nesse peso. As médias ajustadas pelo método dos quadrados mínimos foram para os grupos pesado (P) e leve (L) de 163,21± 2,18kg e 134,44± 2,18kg, respectivamente, com 41 animais em cada grupo. Essas reprodutrizes foram submetidas à coleta de sangue para estudo de polimorfismos do gene da somatotropina bovina, pela técnica de PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism). A amplificação de uma região entre o éxon III e V do gene da somatotropina permitiu analisar dois sítios de restrição. Para o sítio do éxon V, todos os animais foram identificados como monomórficos (Leu-Leu). Quanto ao sítio do íntron 3, foi possível identificar os seguintes genótipos 21 (+/-) e 60 (-/-), com as freqüências de 0,13 e 0,87 para os alelos (+) e (-), respectivamente. O peso dos filhos dos animais com o genótipo +/- foi de 152,42± 4,41kg e os -/- 147,60± 2,61kg. Os grupos P e L não diferiram entre si quanto às freqüências alélicas apresentadas. O genótipo das reprodutrizes não afetou o peso à desmama de suas crias, existindo portanto outros efeitos genéticos e não genéticos de maior magnitude.

Palavras-chave: Bovino, somatotropina, PCR, RFLP, polimorfismo genético

 

ABSTRACT

Data from a Nelore herd were used after adjustment of the weaning weight for 205 days of age, sex, age of dam, sire and weaning month and resulted into two groups of cows according to the in weaning weight of their calves (heavy and light groups). The least square means (LSM) for weaning weights were 163.21± 2,18kg and 134,44± 2.18kg, for heavy (H) and light (L) groups, with 41 animals each one. These animals were genotyped for DNA polymorphisms of the bovine somatotropin gene, using PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism). Amplification of a region between exons III and V of somatotropin gene allowed analysis of two restriction sites. All animals showed monomorphism for the V exon site, showing the (Leu-Leu) genotype. At intron 3 site, there were identified the 21+/- and 60 -/- genotypes, with 0.13 and 0.87 frequencies to (+) and (-) alleles, respectively. The calves from +/- counts was of 152.42± 4.41kg and of calves from -/- cows was 147.60± 2.61kg. Heavy and light groups were similar for the allelic frequencies. The dam’s genotype did not affect the weaning weight of the calves. This suggests the existence of another genetic or non-genetic factors with major magnitude.

Keywords: Cattle, somatotropin, PCR, RFLP, genetic polymorphism

 

 

INTRODUÇÃO

A identificação e o uso de marcadores moleculares vêm recebendo grande atenção por parte dos pesquisadores. Apesar disso, em marcadores clássicos como grupos sangüíneos e BoLA ainda não se conhece a ligação entre estes e os respectivos locos que afetam as características de produção (Hoj et al., 1993). A detecção dos marcadores de DNA segue em conjunto com o desenvolvimento de mapas gênicos e apresenta possibilidade de aplicação futura para as espécies domésticas (Coutinho & Regitano, 1995).

O reconhecimento de ligação entre efeitos gênicos e segmentos cromossômicos que apresentam herança mendeliana é necessário, pois podem aumentar a acurácia na determinação de valores genéticos e tornar mais eficiente a manipulação genética de características que não são diretamente medidas, tais como resistência a doenças, características de carcaça, características limitadas pelo sexo e de baixa herdabilidade (Rocha et al., 1992). Assim a seleção assistida por marcadores poderá reduzir o tempo de identificação de genótipos superiores e aumentar a intensidade de seleção (Coutinho & Regitano, 1995).

Ao avaliar o potencial do marcador genômico, deve-se fazer distinção entre o gene candidato e a aproximação que utiliza polimorfismos neutros como marcadores ligados a loci de características quantitativas (Quantitative Trait Loci-QTL). A identificação do gene candidato é geralmente mais trabalhosa e consome mais tempo, pois o gene candidato deve apresentar: 1) polimorfismo 2) possibilidade de detecção mediante técnicas moleculares, e 3) efeito direto sobre a característica por mecanismo endócrino-fisiológico (Notter, 1995).

O conhecimento de polimorfismos em genes que regulam a produção hormonal e, por conseguinte, o metabolismo e a performance animal é interessante em alguns pontos. Primeiro, esses polimorfismos contribuem para a caracterização genética de populações, podendo identificar possíveis hibridizações que ocorreram no passado. Segundo, e talvez o mais importante, seria a possibilidade de sua inclusão em programas de melhoramento genético de populações (Mitra et al., 1995).

O presente trabalho teve como objetivo determinar as freqüências dos sítios polimórficos do éxon V e do íntron 3 do gene do hormônio do crescimento bovino (bGH), e verificar a associação dos genótipos de reprodutrizes com o peso à desmama de suas crias.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados animais registrados da raça Nelore (Puro de Origem e Livro Aberto). Os animais são mantidos em pastagens de braquiária e recebem suplemento mineralizado ad libitum durante todo o ano. De uma população de 398 reprodutrizes, foram selecionadas fêmeas para comporem a amostra inicial. A seleção dessas fêmeas foi baseada no peso à desmama, calculado para 205 dias, de seus filhos nascidos na estação de 1995.

Foram excluídos da amostra inicial os bezerros que não atingiram 120kg à desmama, ou quando o pai não era conhecido, permanecendo para análise dados referentes a 383 bezerros. Os bezerros nasceram entre os meses de agosto de 1994 e janeiro de 1995 e não foram pesados ao nascer. A desmama e pesagem ocorreram entre os meses de março e agosto de 1995. As análises foram realizadas sobre os pesos calculados para 205 dias de idade.

Devido à distribuição inadequada da idade das reprodutrizes, elas foram divididas em três classes, a saber: classe 1, fêmeas com idade superior a 2,9 anos e até 5,9 anos; classe 2, fêmeas com idade superior a 5,9 anos e até 9,9 anos; classe 3, fêmeas com idade superior a 9,9 anos e inferior a 14,1 anos.

O peso à desmama foi ajustado pelo seguinte modelo:

, em que:

Yijklm = peso à desmama calculado para 205 dias de idade;
m = média geral da característica;
Pi = efeito fixo do iésimo reprodutor, pai do bezerro (i=1,2,...,12);
Sj = efeito fixo do jésimo sexo do bezerro (j=1,2);
Mk = efeito fixo do késimo mês de desmama do bezerro (k=1,2,...,5);
Cl = efeito fixo da lésima classe de idade da reprodutriz (l=1,2,3);
eijklm = erro aleatório.

Após o ajuste foram obtidos dois grupos de fêmeas, denominados pesado (P) e leve (L), com 41 animais cada, que diferiram substancialmente (P<0,0001) quanto ao peso à desmama de seus produtos. Os grupos apresentaram médias ajustadas pelo método dos quadrados mínimos e erros padrão de 163,21± 2,18kg e 134,44± 2,18kg para P e L, respectivamente, com média geral de 148,83kg para os 82 animais. A amostra foi composta pelas progenitoras, mães dos bezerros, em função da referida classificação, as quais foram submetidas à colheita de sangue para a genotipagem. Com base nessa diferença de grupo, analisou-se o genótipo das mães na intenção de identificar marcadores genéticos que pudessem estar associados às diferenças no peso à desmama de suas crias.

Foram coletados da circulação periférica de cada vaca aproximadamente 10ml de sangue, em tubos vacutainer heparinizados e estéreis, resfriados, em seguida, a 4ºC. O DNA da amostra foi extraído segundo o protocolo descrito por Walsh et al. (1991). Os oligonucleotídeos iniciadores (primers) foram sintetizados pela NBI (National Biosciences através da Incibrás Biotecnologia) conforme descrição de Hoj et al. (1993). Esses primers amplificam uma região de 768 pares de bases desde o éxon III (posição +743) até o éxon V (posição +1511) do gene do hormônio do crescimento bovino.

Em todas as reações de amplificação foi utilizado controle (branco/sem DNA), para confirmar a ausência de contaminação. Cada reação de amplificação consistiu de tampão da PCR 1X (KCl 500 mM, Tris-Cl pH 8.3 100 mM), de 0,5pmol de cada primer (NBI), de 0,2mM de dNTP (Promega), de 1U Taq Polimerase (Cenbiot/RS, PHN/MG), 2,0 mM MgCl2 (Promega), de 4,0mL de DNA genômico e água mili-Q q.s.p. 20mL.

As amplificações foram realizadas em termociclador PTC 100-MJ Research com capacidade para 60 tubos. O programa utilizado para amplificação do fragmento entre éxon III e V do gene do hormônio do crescimento bovino segue descrito: 1º ciclo 95ºC por 45 seg, 2º ciclo 65ºC por 1 min 30 seg, 3º ciclo 72ºC por 1 min e 30 seg, repetido 33 vezes.

O material amplificado foi analisado em gel de poliacrilamida a 4%. Após a amplificação, o produto foi digerido com enzima de restrição e visualizado em gel de poliacrilamida a 8%. Para identificação das bandas, utilizou-se um padrão de peso molecular pGEM (Promega). Dessa maneira foram feitas as eletroforeses das amostras em cuba vertical de acrílico com tampão de corrida TBE 1X a 100 volts por 1 hora. Foram usadas duas endonucleases de restrição, Alu I e Msp I. O sistema de digestão para a enzima Alu I consistiu de tampão 10X One-phor-all (Pharmacia) 1mL, enzima Alu I (Pharmacia) 5.000UI/mL 1,5UI, DNA amplificado 2m L e água mili-Q q.s.p. 10mL.

Depois de preparado o sistema, o material foi homogeneizado e incubado a 37ºC por 6 horas. Essa endonuclease identifica um polimorfismo que é devido à troca de uma citosina (C) por uma guanina (G) (CTG ® GTG) na quarta base nitrogenada do éxon V do gene da somatotropina (Lucy et al., 1991). A substituição desses nucleotídeos gera uma troca de aminoácidos na cadeia do hormônio de crescimento na posição 127, onde podem estar presentes uma leucina ou uma valina. O fragmento amplificado é clivado em 264, 174, 85, 81, 77, 51 e 38pb alelo L (leucina), 264, 174, 132, 85, 77 e 38pb alelo V (valina), ou uma combinação dos dois, identificando os heterozigotos (L/V) 264, 174, 132, 85, 81, 77, 51 e 38pb. Após a digestão, o material foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida 8% por 2 horas a 100 volts.

A enzima Msp I foi utilizada para identificar o polimorfismo do íntron 3, conforme descrição de Hoj et al. (1993). Após preparo do sistema de digestão, o material foi homogeneizado e incubado a 37ºC por 6 horas. O sistema de digestão para a enzima Msp I consistiu de: tampão B-10X (Promega) 1mL, enzima Msp I (Promega) 20.000UI/ml 1,5UI, DNA amplificado 2mL e água mili-Q q.s.p. 10mL.

Essa enzima cliva o fragmento amplificado em 706 e 63pb alelo (-), 612, 93 e 63pb alelo (+), ou uma combinação dos dois identificando os heterozigotos (+/-) 705, 612, 93 e 63pb. Após a digestão, o material foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida 8% por 2 horas a 100 volts.

Para visualizar as bandas de DNA do material amplificado ou digerido, procedia-se à coloração dos géis pelo método da prata. Após a identificação dos polimorfismos genéticos do bGH, obtiveram-se as freqüências genotípicas e alélicas para cada um dos grupos (P e L) de acordo com a enzima utilizada. Aplicou-se um teste de dispersão de freqüência (qui-quadrado) para a verificação do equilíbrio de Castle-Hardy-Weinberg da amostra geral e dentro de cada grupo. Este teste também foi utilizado para se compararem as freqüências alélicas e genotípicas entre os grupos.

Adicionalmente, foram realizadas análises de variância por meio do "Statistical Analyses System" (SAS, 1994) para averiguação do efeito do genótipo materno sobre o peso à desmama dos bezerros. Neste caso específico foi desconsiderado durante a análise o polimorfismo do éxon V, pois a amostra apresentou-se monomórfica (leucina). O modelo estatístico utilizado para verificação de efeito dos genótipos do bGH relativos ao íntron 3 (-/- e -/+) foi:

, em que:

Yij = peso à desmama ajustado;
m = média geral;
Gi = efeito fixo do iésimo genótipo;
eij = erro aleatório.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Não foi possível determinar o genótipo de um animal devido a problemas no processo de amplificação, restando apenas 81 animais na amostra. Todos os animais genotipados com a enzima Alu I se apresentaram homozigotos para o alelo L. Na Fig. 1 pode-se observar o padrão de bandas apresentados pelas amostras digeridas com a enzima Alu I.

 

 

De acordo com Falconer & Mackay (1996), um loco para ser considerado polimórfico deve apresentar a freqüência do alelo mais comum inferior a 0,99. Neste estudo, como todo os animais foram homozigotos para um alelo, este loco apresentou-se monomórfico.

O resultado encontrado foi semelhante ao relatado por Rodrigues et al. (1997) na mesma raça. Rodriguez (1996) encontrou o mesmo alelo fixado em amostra de animais Gir. Em outro trabalho com animais zebuínos, Mitra et al.(1995) encontraram baixos valores para o alelo V. Esses resultados podem ser sugestivos de baixa freqüência do alelo V nesses animais, ou que o alelo L esteja fixado. Para comprovar esta suposição, é necessária uma genotipagem de maior abrangência. Quanto às freqüências relatadas por Zhang et al. (1992) e Lucy et al. (1993) em taurinos, pode-se verificar variabilidade entre as raças descritas, e que as maiores freqüências do alelo V foram determinadas em Jersey e Ayrshire.

Os resultados obtidos com a enzima Msp I podem ser vistos na Tab. 1, e na Fig. 2 podem-se visualizar os genótipos encontrados. O teste do qui-quadrado não foi significativo (P>0,05), revelando portanto o equilíbrio da amostra e que os grupos não diferem quanto às freqüências genotípicas e alélicas encontradas.

 

 

 

 

As freqüências alélicas observadas no íntron 3 são similares aos valores citados por Mitra et al. (1995), Rodriguez (1996) e Rodrigues et al. (1997) para zebuínos. Comparando com os valores descritos por Hoj et al. (1993), Zhang et al. (1993) e Rodrigues et al. (1997) em animais taurinos, observa-se inversão nas freqüências dos alelos, com maior freqüência para o Msp I (+).

Apesar desse polimorfismo apresentar-se no íntron, não afetando a seqüência de aminoácidos da molécula madura do hormônio do crescimento, este sítio poderia estar segregando ligado a um marcador. Após a obtenção dessas freqüências, utilizou-se o modelo previamente descrito para verificar o efeito do genótipo sobre o peso à desmama. O efeito do genótipo da mãe não foi significativo (P>0,05) sobre o peso à desmama de suas crias. Para os animais cujas mães apresentaram o genótipo +/- a média ajustada de peso foi de 152,42± 4,41kg e a dos homozigotos -/- foi de 147,60± 2,61kg.

Devido à grande importância do hormônio do crescimento, tem-se observado muito interesse no gene que o codifica; entretanto, não foi possível neste estudo associar as variações genéticas desse gene e sua atuação sobre características de crescimento. Por conseguinte, deve-se considerar que podem existir interações entre outros genes importantes, que não puderam ser quantificadas, e até mesmo de proteínas reguladoras da expressão gênica.

 

CONCLUSÕES

Não foi possível detectar variação genética no loco que codifica para as formas leucina/valina do hormônio do crescimento bovino. Portanto, é necessário analisar maior número de animais para verificar a existência ou não da forma valina na raça Nelore.

Existe variabilidade para o sítio de restrição detectado no íntron 3 na amostra estudada, e os alelos parecem estar segregando em equilíbrio de Castle-Hardy-Weinberg, apesar de o rebanho estar sob seleção.

O genótipo das reprodutrizes não afetou o peso à desmama de suas crias, existindo portanto outros efeitos genéticos e não genéticos de maior magnitude.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Arley C. da Silveira pela cessão dos dados e rebanho para este estudo.

 

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