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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.52 n.1 Belo Horizonte Feb. 2000

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352000000100002 

Detecção da toxina-1 da síndrome do choque tóxico em amostras de Staphylococcus aureus isoladas de mastite bovina

(Detection of toxic shock syndrome toxin by Staphylococcus aureus strains isolated from bovine mastitis)

 

H.F.T. Cardoso1, L.S. Carmo2, N. Silva1*

1Escola de Veterinária da UFMG
Caixa Postal 567
30123-970 - Belo Horizonte, MG
2 Laboratório de Staphylococci - Fundação Ezequiel Dias (FUNED), Belo Horizonte

 

Recebido para publicação, após modificação, em 19 de outubro de 1999.
*Autor para correspondência
E-mail: nivsilva@dedalus.lcc.ufmg.br

 

 

RESUMO

Este trabalho teve por objetivo caracterizar a produção da toxina da síndrome do choque tóxico (TSST-1) e de enterotoxinas estafilocócicas (SE) A, B, C e D em 127 amostras de S. aureus, isoladas de amostras de leite proveniente de vacas com mastite no Estado de Minas Gerais, entre 1994 e 1997. A verificação da produção de toxinas foi feita pela técnica de sensibilidade ótima em placa. Das 127 amostras testadas, 60 (47%) eram produtoras de TSST-1 e 54 (43%) produtoras de SE, 38 amostras produziram SED (30%), 24 SEB (19%), 8 SEC (6%) e 4 SEA (3%). Estes resultados trazem preocupações quanto à saúde pública pela alta prevalência de amostras de S. aureus produtoras de TSST-1 e de enterotoxinas em isolamentos a partir de leite de vacas com mastite.

Palavras-chave: Staphylococcus aureus, TSST-1, enterotoxina, mastite

 

ABSTRACT

A total of 127 strains of Staphylococcus aureus were examined for the production of toxic shock syndrome toxin (TSST-1) and staphylococcal enterotoxins (SE) A, B, C and D. The strains were isolated from milk samples from cows with mastitis in dairy herds of Minas Gerais State, Brazil, from 1994 to 1997. The toxins were detected using the optimum-sensitivity plate method. Of 127 isolates, 60 (47%) produced TSST-1 and 54 (43%) produced SE, 38 (30%) produced SED, 24 (19%) SEB, 8 (6%) SEC and 4 (3%) enterotoxin A.

Keywords: Staphylococcus aureus, TSST-1, enterotoxins, bovine mastitis

 

 

INTRODUÇÃO

Staphylococcus aureus está principalmente envolvido em infecções intramamárias de fêmeas em lactação, sendo o principal agente causador de mastite em bovinos. Esse microrganismo produz grande variedade de toxinas extracelulares e de fatores de virulência que estão relacionados à sua patogenicidade, além de oferecer grande resistência aos antimicrobianos existentes (Matsunaga et al., 1993). Entre esses fatores destaca-se a toxina 1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1), reconhecida como a principal causa da síndrome do choque tóxico (TSS) em seres humanos, caracterizada por febre, hipotensão, congestão em vários órgãos e choque letal (Bergdoll & Chesney, 1991). TSST-1 é um polipeptídeo de cadeia simples, com propriedades biológicas comuns a outras exotoxinas pirogênicas, como capacidade de induzir febre (Igarashi et al., 1986), aumentar a letalidade do choque endotóxico (Fast et al., 1988), estimular a proliferação inespecífica de células T (Ikejima et al., 1988), e induzir a produção de interleucina-1 (Micusan et al., 1989), de gama interferon e do fator alfa de necrose tumoral (Ellis et al., 1993).

O primeiro relato de detecção de TSST-1 produzida por staphylococci de origem animal foi feito por Jones & Wieneke (1986). Estudos recentes, realizados com S. aureus isolados de casos clínicos e subclínicos de mastite bovina, demonstraram que entre 20% e 77% dos isolados produziram TSST-1 e enterotoxinas estafilocócicas (Kenny et al., 1993; Matsunaga et al., 1993; Ichikawa et al., 1996; Takeuchi et al., 1998). Em tanques de expansão, utilizados para resfriamento e armazenamento de leite, 75,4% das amostras de S. aureus isoladas demonstraram capacidade de produzir essas toxinas (Takeuchi et al., 1998).

A presença de S. aureus e suas toxinas no leite usado pelas indústrias e pelas laticínios representa sério problema de saúde pública (Bergdoll, 1989; Ichikawa et al., 1996). Segundo dados do Ministério da Saúde (Brasil, 1998), foram registrados 593.212 casos de intoxicação alimentar entre 1984 e 1997, porém sem especificar as toxinas, os microrganismos ou as fontes envolvidas. Dessa maneira, pouco se conhece sobre relatos de isolamentos de amostras de staphylococci de origem animal produtoras de TSST-1 no País.

O objetivo deste trabalho foi identificar a produção de TSST-1 e de enterotoxinas por amostras de S. aureus isoladas de leite provenientes de vacas com mastite, em algumas bacias leiteiras do Estado de Minas Gerais.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 127 biótipos de S. aureus, isolados de casos de mastite bovina clínica e subclínica, obtidos de 23 municípios pertencentes a importantes regiões produtoras de leite no Estado de Minas Gerais. As coletas foram realizadas no período de outubro de 1994 a outubro de 1997. As amostras foram isoladas após semeadura em ágar sangue desfibrinado de ovino a 5% (v/v) com incubação em estufa a 37ºC, por um período de 24-48 horas. As amostras foram mantidas em ágar fosfatado a 4ºC e em caldo brain heart infusion broth (BHI) - OxoidÒ com glicerol a 50%, em temperatura de 80ºC negativos, até a realização dos testes.

S. aureus foram identificados por coloração pelo método de Gram, fermentação de glicose e manitol em aerobiose e anaerobiose, produção de pigmento, semeadura em ágar seletivo[Staph.110 - DifcoÒ ] e pelas provas de acetoína, catalase, coagulase e de termonuclease (Tnase), segundo Kloos & Lambe (1991), Varnam & Evans (1991) e Quinn et al. (1994).

As amostras a serem testadas, já isoladas e identificadas, foram inoculadas em 2ml de caldo BHI - OxoidÒ e incubadas em estufa a 37ºC por 24 horas. Para se proceder à extração das toxinas, foi empregado o método da membrana sobre ágar (Robbins et al., 1974) utilizando-se de placas de Petri de 100mm com 20ml de ágar BHI - OxoidÒ , recobertas com disco de membrana de diálise Spectra/Por® [Spectrum Labs., EUA]. Um inóculo de 0,5ml da cultura em caldo foi espalhado com o auxílio de uma alça de Drigalski sobre a superfície da membrana e as placas incubadas a 37°C por 24 horas. Os cultivos assim obtidos foram lavados com 2,5ml de Na2HPO4 20mm e pH 7,4, em duas etapas. A primeira utilizou 1,5ml e a segunda, logo após a primeira, 1,0ml do tampão fosfato. Os lavados das culturas foram centrifugados a 10.000´ g/10 min a 4°C e os sobrenadantes utilizados para verificação da produção de TSST-1 e de enterotoxinas, por meio da técnica de sensibilidade ótima em placa (OSP), descrita por Robbins et al. (1974). As toxinas-padrão e os anti-soros específicos foram gentilmente cedidos pelo Dr. Luiz Simeão do Carmo (Laboratório de Pesquisas em Staphylococci da FUNED). As reações positivas foram determinadas pela formação de linhas de precipitação dos sobrenadantes das culturas-teste com os anti-soros controle.

 

RESULTADOS

Do total de 127 amostras testadas, 83 (65%) apresentaram produção de pelo menos um tipo de toxina, isolado ou em combinação, revelando alto grau de toxigenicidade. Algumas amostras eram produtoras de até quatro toxinas diferentes ao mesmo tempo. Apenas 35% das amostras testadas foram negativas para qualquer tipo de toxina produzida. A distribuição da produção das toxinas isoladamente, desprezando-se as combinações, é apresentada na Fig. 1. A TSST-1 foi a toxina mais produzida entre as 127 amostras, com 60 (47%) das amostras positivas.

 

 

Na Fig. 2 pode-se verificar a produção das enterotoxinas estafilocócicas entre as amostras de S. aureus TSST-1 positivas e negativas. Entre 60 amostras TSST-1 positivas, 24 (40%) produziram SED e entre 67 amostras TSST-1 negativas, apenas 14 (21%) produziram SED.

 

 

DISCUSSÃO

Das toxinas identificadas no presente trabalho, houve predomínio da TSST-1 e da SED em relação às outras toxinas estafilocócicas, sendo estes resultados similares aos descritos por Kenny et al. (1993). Outros pesquisadores, entretanto, associam TSST-1 e SEC às amostras causadoras de mastites agudas e subclínicas em bovinos (Jones & Wieneke, 1986; Matsunaga et al., 1993; Ichikawa et al., 1996; Bogni et al., 1997; Takeuchi et al., 1998) e em caprinos (Morgan et al., 1986; Bezek & Hull, 1995). Segundo Kenny et al. (1993), essas diferenças podem ser atribuídas ao método de detecção das toxinas ou refletir diferenças entre amostras de S. aureus isoladas de diferentes origens. Assim, justifica-se a variação na freqüência e no tipo de toxinas extracelulares encontradas neste trabalho e em outros descritos na literatura citada.

A mesma amostra de S. aureus pode produzir mais de um tipo de enterotoxina, como observado neste trabalho. Resultados similares foram descritos por autores acima citados, porém eles não discutem a importância desses achados. A co-produção de diferentes tipos de toxinas pode aumentar os efeitos toxigênicos desses antígenos, sugerindo que essa co-produção de toxinas seja importante na patogenia das infecções produzidas por esse microrganismo (Soares et al., 1997). Refai et al. (1988) demonstraram que existe associação entre a atividade enzimática específica, a enterotoxigenicidade e a resistência de S. aureus a vários antibióticos, principalmente naquelas amostras produtoras de mais de um tipo de enterotoxina. Neste trabalho foi observada maior produção de enterotoxinas nas amostras TSST-1 positivas do que nas amostras TSST-1 negativas. Matsunaga et al. (1993) obtiveram resultados semelhantes, sendo este fato relacionado à maior patogenicidade das amostras de S. aureus causadoras de mastite bovina.

Com relação à TSST-1, deve-se ressaltar que essa toxina ganhou notoriedade por ser detectada com freqüência em amostras causadoras de mastites bovinas, ovinas e caprinas, muitas vezes relacionadas a infecções agudas (Jones & Wieneke, 1986; Matsunaga et al., 1993; Bezek & Hull, 1995). Ela parece ter grande importância na virulência das amostras de S. aureus, e sugere estabelecer uma relação entre sua produção e a gravidade dos casos de mastites. Neste trabalho não foi possível estabelecer esse tipo de relação, uma vez que as amostras foram isoladas a partir de leite enviado ao Laboratório de Pesquisas em Bacterioses do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária da UFMG, para diagnóstico bacteriológico, não constando o histórico clínico ou a fase evolutiva do processo infeccioso da glândula mamária. Apesar disso, os resultados aqui registrados são importantes, uma vez que não foram encontrados dados na literatura brasileira sobre detecção de TSST-1 de origem animal, assim como da detecção das enterotoxinas D e B. No trabalho realizado por Lopes et al. (1990) foram detectadas apenas as enterotoxinas A e C produzidas por amostras de S. aureus isoladas de mastite bovina. Dessa maneira, este é, possivelmente, o primeiro relato de detecção da TSST-1 produzida por S. aureus de origem animal, no Brasil.

O alto índice de amostras enterotoxigênicas descritas deve ser considerado principalmente pela saúde pública, pois tratamentos térmicos do leite, como a pasteurização, não são capazes de inativar essas toxinas (Bergdoll, 1989), sendo um risco em potencial para o consumidor. Vale ressaltar que não foram encontradas referências no que diz respeito à inativação de enterotoxinas pelo processo industrial de esterilização do leite. A simples presença de amostras toxigênicas de S. aureus no leite não implica na ocorrência de intoxicações, porém o risco existe, principalmente se se considerar que esse microrganismo é o mais envolvido nas infecções intramamárias dos bovinos, que o leite é um excelente meio de crescimento para S. aureus, que a temperatura da glândula mamária é a ideal para a produção de TSST-1 e de enterotoxinas, e que apenas pequenas concentrações de toxinas são suficientes para causar doença em seres humanos, principalmente em crianças.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a efetiva colaboração dos profs. Geraldo Márcio da Costa (Universidade Federal de Lavras) e Maria José de Sena (Universidade Federal Rural de Pernambuco) durante a realização desta pesquisa.

 

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