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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.52 n.1 Belo Horizonte Feb. 2000

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352000000100003 

Diversidade antigênica de amostras do vírus da diarréia viral bovina isoladas no Brasil: implicações para o diagnóstico e estratégias de imunização

(Antigenic diversity of Brazilian isolates of bovine viral diarrhea virus (BVDV): implications for diagnosis and immunization strategies)

 

E.F. Flores1, R. Weiblen1, L.H.V.G. Gil2, F.L. Tobias3, M. Lima4 ,D.C. Garcez4, S.A. Botton3

1Universidade Federal de Santa Maria – UFSM
97105-900 - Santa Maria, RS
2Médico Veterinário - University of Nebraska, Lincoln, USA
3Médico Veterinário. UFSM
4Acadêmico do Curso de Medicina Veterinária, UFSM

 

Recebido para publicação, após modificação, em 25 de outubro de 1999.
Trabalho realizado com recursos do MCT/Finep/CNPq e CAPES (PRONEX em Virologia Veterinária, 215/96).
E-mail: flores@creta.ccr.ufsm.br

 

 

RESUMO

Seqüenciamento e análise filogenética de 17 amostras do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) isoladas no Brasil identificaram quatro amostras (23,5%) do genótipo 1a (BVDV-1a), nove amostras (52,9%) do genótipo 1b (BVDV tipo 1b) e quatro amostras (23,5%) do genótipo 2 (BVDV tipo 2). As amostras brasileiras de BVDV tipo 2 apresentaram-se genotipicamente distintas dos BVDV tipo 2 até então identificados na América do Norte e Europa, sugerindo pertencerem a um novo subgenótipo. A caracterização antigênica dessas amostras por neutralização cruzada revelou reatividade sorológica muito reduzida com cepas vacinais do BVDV. O anti-soro produzido contra três cepas vacinais do BVDV apresentou atividade neutralizante muito reduzida contra várias amostras brasileiras de BVDV tipos 1 e 2. Diferenças de até 128 vezes nos títulos de anticorpos neutralizantes foram observadas entre cepas vacinais e amostras brasileiras do BVDV. Nos testes de soroneutralização (SN) contra o vírus dos tipos 1 e 2, de 1134 amostras testadas, 280 (24,7%) possuiam anticorpos neutralizantes anti-BVDV e dessas, 215 (76,8%) apresentaram atividade neutralizante contra ambos os vírus, 37 (13,2%) reagiram apenas contra o BVDV tipo 2 e 28 amostras (10%) foram positivas apenas contra o BVDV tipo 1. Esses resultados demonstram que testes de SN utilizando vírus de apenas um genótipo podem resultar em um número significativo de falsos-negativos e indica a necessidade da formulação de vacinas com amostras locais de BVDV e/ou contendo vírus dos dois genótipos.

Palavras-chave: Vírus da diarréia viral bovina, BVDV, diversidade antigênica, vacina, genótipo

 

ABSTRACT

Nucleotide sequencing and phylogenetic analysis of 17 Brazilian isolates of bovine viral diarrhea virus (BVDV) identified four isolates (23.5%) belonging to genotype 1a (BVDV-1a), nine isolates (52.9%) of the genotype 1b (BVDV-1b) and four isolates (23.5%) belonging to genotype 2 (BVDV-2). The Brazilian BVDV type 2 isolates were shown to be genotypically different from the BVDV type 2 identified so far in North America and Europe, suggesting they might belong to a new subgenotype. Antigenic characterization of these isolates by cross-neutralization revealed a very low serologic cross-reactivity with vaccine BVDV strains. The immune serum raised in lambs to three vaccine strains presented a very low and even negligible neutralizing activity against some Brazilian BVDV type 1 and 2 isolates. Up to 128-fold differences in serum neutralizing antibody titers were observed between the vaccine strains and some Brazilian BVDV isolates. The potential impact of the antigenic variability of BVDV on serologic diagnosis was investigated by testing field serum samples by serum-neutralization (SN) against viruses of both genotypes. Two hundred and eighty samples (24.7%) had neutralizing antibodies against BVDV. Out of these, 215 (76.8%) had neutralizing activity against viruses of both genotypes, 37 samples (13.2%) reacted only against BVDV type 2 and 28 (10%) were positive only to BVDV type 1. These results demonstrate that SN tests using only one virus may result in a significant number of false-negative results. The reduced neutralizing activity of the antisera to vaccine strains against some Brazilian isolates raises the question about the degree of protection conferred by these vaccines and indicates the need of producing vaccines based on local viruses and/or including viruses of both genotypes.

Keywords: Bovine viral diarrhea virus, BVDV, antigenic diversity, vaccine, genotype

 

 

INTRODUÇÃO

A infecção pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) tem sido associada a uma grande variedade de manifestações clínicas que incluem desde infecções inaparentes até enfermidades fatais como a doença das mucosas (Baker, 1995). Enfermidade gastroentérica ou respiratória, doença hemorrágica, perdas reprodutivas como infertilidade temporária, mortalidade embrionária, aborto ou mumificação do feto, malformações, natimorto ou nascimento de bezerros fracos e inviáveis estão entre as conseqüências da infecção pelo BVDV (Baker, 1995). O BVDV é um vírus com envelope RNA de fita simples e polaridade positiva, pertencente à familia Flaviviridae, gênero Pestivirus, do qual também fazem parte o vírus da peste suína clássica (CSFV) e o vírus da doença da fronteira de ovinos (BDV) (Francki et al., 1991).

Amostras de campo do BVDV apresentam grande variabilidade antigênica, embora o estabelecimento definitivo de sorotipos ainda não tenha sido possível (Dubovi, 1992). Essa grande diversidade antigênica tem dificultado a obtenção de um espectro satisfatório de proteção por meio de vacinação (Dubovi, 1992). No final dos anos 80 e início dos anos 90, amostras de BVDV genética e antigenicamente distintas das cepas clássicas foram isoladas de surtos severos de enfermidade aguda gastroentérica/respiratória ou hemorrágica na América do Norte (Corapi et al., 1989; Carman et al., 1998). Esses vírus foram então denominados de BVDV tipo 2, e as amostras clássicas passaram a ser denominadas de BVDV tipo 1 (Pellerin et al., 1994; Ridpath et al., 1994). Com a identificação de BVDV tipo 2, a variabilidade antigênica do BVDV revestiu-se de importância ainda maior, sobretudo em relação ao diagnóstico e formulação de vacinas (Edwards & Paton, 1995).

Estudos recentes têm demonstrado que a infecção pelo BVDV está amplamente difundida no rebanho bovino do Brasil e que as amostras brasileiras do vírus apresentam variabilidade antigênica marcante (Oliveira et al., 1996; Canal et al., 1998; Botton et al., 1998a,b). Análise filogenética dessas amostras indicou a presença de vírus dos dois genótipos no rebanho brasileiro (Canal et al., 1998; Gil, 1998). O presente artigo teve como objetivo relacionar a diversidade genética e antigênica detectada entre as amostras brasileiras do BVDV e as possíveis implicações para o diagnóstico, elaboração de vacinas e estratégias de imunização.

 

MATERIAL E MÉTODOS

A origem das amostras de BVDV caracterizadas neste estudo foi anteriormente publicada (Botton et al., 1998a). Treze amostras foram isoladas no Laboratório de Virologia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). As demais amostras foram isoladas de casos clínicos e do sangue de animais de rebanhos com problemas reprodutivos nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo. As cepas-padrão Singer, NADL e Oregon/c24v (BVDV tipo 1) e VS-253 (BVDV tipo 2) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Ruben Donis (Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, NE). As amostras de campo foram isoladas e multiplicadas em células de linhagem de rim fetal bovino (MDBK), livres de Pestivírus, mantidas em meio essencial mínimo (MEM), com penicilina (35mg/l), estreptomicina (200mg/l), suplementado com 5% de soro eqüino.

As amostras brasileiras do BVDV foram submetidas a seqüenciamento e análise filogenética, baseada em uma seqüência de 268 nucleotídeos localizada da região 5' não-traduzida (5'UTR) do genoma viral (Ridpath et al., 1994). Os primers utilizados correspondem às seqüências de nucleotídeos 90 (5´ - CATGCCCATAGTAGGAC-´3) e 368 (5´- CCATGTGCCATGTACAG) da região 5´UTR do genoma do BVDV. Para o seqüenciamento, utilizou-se o programa ABI PRISMA 373, baseado na incorporação de nucleotídeos terminadores fluorescentes [Perkin-Elmer, Foster, CA, USA]. Os produtos da reação de seqüenciamento foram purificados por cromatografia (kit Centri-Set Columns), separados por eletroforese em gel de poliacrilamida e a seqüência de nucelotídeos foi determinada automaticamente pelo programa ABI PRISMA 373. As seqüências obtidas foram comparadas com seqüências de cepas clássicas de BVDV tipos 1 e 2 e submetidas à análise filogenética através dos programas Factura e Sequencing Navigator. As seqüências genômicas e os resultados completos da análise filogenética dessas e de outras amostras sul-americanas do BVDV foram apresentados anteriormente (Gil, 1998).

Anti-soro específico para cada uma das cepas vacinais (Singer, NADL e Oregon/c24v) e amostras brasileiras de BVDV tipo 2 (SV260, LV96, SV63 e SV123.4) foram produzidos em ovinos. Cordeiros soronegativos ao BVDV foram inoculados pela via intranasal com o sobrenadante de cultivo de células infectadas, contendo aproximadamente 107DICC50 do respectivo vírus. O soro coletado 30 dias pós-inoculação foi utilizado em testes de soroneutralização (SN) contra o vírus homólogo e contra as outras amostras de vírus. Os testes de SN foram realizados em placas de poliestireno de 96 cavidades, utilizando-se diluições crescentes de soro contra doses constantes de vírus (aproximadamente 100DICC50/cavidade) e células MDBK. A leitura dos testes foi realizada após 96h de incubação, pelo monitoramento de efeito citopático ou por imunofluorescência indireta (Botton et al., 1998b). Os títulos de anticorpos neutralizantes de cada anti-soro frente aos vírus homólogos e heterólogos foram combinados para se determinar o coeficiente de similaridade antigênica (R) entre os vírus de cada par, de acordo com cálculo utilizado por Howard et al. (1987):

 

 

Amostras de soro coletadas de rebanhos leiteiros sem histórico de vacinação contra o BVDV no Estado do Rio Grande do Sul foram submetidas a testes de SN contra os vírus dos dois genótipos (BVDV tipo 1 e 2). Nesses testes, diluições 1:10 de cada amostra de soro foram preparadas em duplicata e incubadas com aproximadamente 100DICC50 do vírus BVDV Singer (tipo 1) ou VS-253 (tipo 2). A leitura dos testes foi realizada após 96h de incubação e foram consideradas positivas as amostras que neutralizaram o vírus em diluições 1:10.

 

RESULTADOS

A análise filogenética de amostras do BVDV isoladas no Brasil permitiu a identificação de vírus dos dois genótipos (BVDV-1 e BVDV-2) e subgenótipos do tipo 1 (BVDV-1a e 1b) (Tab. 1). As quatro amostras identificadas como BVDV tipo 2 (23,5% do total) despertaram especial interesse por apresentaram homologia alta entre si (Tab. 1) e homologia relativamente baixa com amostras norte-americanas e européias de BVDV tipo 2 (dados não apresentados).

 

 

A reatividade sorológica entre amostras vacinais do BVDV e as amostras brasileiras de BVDV tipo 2 foi avaliada por meio de testes de SN cruzada, utilizando-se o anti-soro produzido em ovinos para cada amostra de vírus. Esses testes revelaram variações marcantes nos níveis de reatividade sorológica cruzada entre os vírus examinados, com diferenças de até 128 vezes nos títulos de SN quando se compararam os títulos soro-vírus homólogo com alguns soro-vírus heterólogos (Tab. 2; Fig. 1). As cepas vacinais, particularmente a NADL e Oregon/c24v, também apresentaram reatividade sorológica bastante reduzida com outras amostras brasileiras de BVDV (Fig. 1).

 

 

Os títulos da SN cruzada apresentados na Tab. 2 foram transformados em coeficientes (R) que indicam os níveis de similaridade antigênica entre os vírus. Valores de R que se aproximam de 100 indicam níveis crescentes de similaridade antigênica, valores de R abaixo de 25 indicam diferenças antigênicas que são freqüentemente observadas entre diferentes cepas de vírus, e valores abaixo de 5 são indicativos de que os respectivos vírus pertencem a tipos sorológicos distintos. Três amostras brasileiras (SV63, SV260 e LV96) apresentaram valores de R menores ou próximos a 5 quando comparados com as amostras vacinais do BVDV (Tab. 3). A amostra SV123.4 apresentou valores próximos de 5 em relação a dois vírus vacinais (Tab. 4). Esses resultados confirmam os resultados da análise filogenética, demonstrando que as amostras de BVDV tipo 2 isoladas no Brasil são antigenicamente muito semelhantes entre si e distintas das principais cepas vacinais do BVDV.

 

 

 

 

Com o objetivo de determinar se as diferenças antigênicas detectadas entre amostras de BVDV tipo 1 e 2 podem influenciar nos resultados de testes sorológicos, amostras de soro de animais não vacinados foram testadas contra as cepas de BVDV tipo 1 e BVDV tipo 2. Os resultados dos testes de SN comparada são apresentados na Tab. 4. Das 1134 amostras testadas, 280 (24,7%) apresentaram anticorpos neutralizantes anti-BVDV. Dessas, 215 (76,8%) apresentaram atividade neutralizante contra o vírus dos dois genótipos, 37(13,2%) neutralizaram apenas a cepa de BVDV tipo 2 e 28 (10%) possuiam anticorpos neutralizantes apenas contra o cepa de BVDV tipo 1. Esses resultados demonstram que a baixa reatividade sorológica cruzada entre BVDV tipo 1 e 2 pode influenciar no diagnóstico sorológico da infecção por SN.

 

DISCUSSÃO

Os resultados apresentados demonstram que a diversidade genética e antigênica observada entre as amostras de BVDV isoladas no Brasil provavelmente possui implicações práticas para o diagnóstico, elaboração de vacinas e estratégias de imunização. A caracterização antigênica e molecular de 17 amostras brasileiras do BVDV revelou uma variabilidade genética e antigênica marcante, com a identificação de vírus dos dois genótipos (BVDV tipo 1 e 2) e subgenótipos (BVDV1a e 1b). As diferenças genotípicas indicam correlação com as características antigênicas desses isolados: algumas amostras brasileiras do BVDV - e em especial as amostras do tipo 2 - apresentaram reatividade sorológica muito reduzida com cepas vacinais do BVDV. Esses dados sugerem que a imunização de animais com vacinas produzidas com cepas clássicas do BVDV pode não conferir proteção adequada contra algumas amostras brasileiras do vírus.

Os níveis de anticorpos neutralizantes necessários para conferir proteção contra as manifestações clínicas causadas pelo BVDV ainda não foram inequivocamente determinados.

A variabilidade antigênica das amostras de campo, em particular, tem dificultado a obtenção de níveis e espectros satisfatórios de proteção pela vacinação (Bolin et al., 1991; Dubovi, 1992; Bolin, 1995). Estudos demonstram que rebanhos vacinados regularmente, e que mantêm níveis moderados e altos de anticorpos neutralizantes contra a cepa vacinal, continuam a gerar bezerros persistentemente infectados (Bolin et al., 1991). Isso tem sido atribuído à infecção de fêmeas prenhes com amostras antigenicamente diferentes da cepa vacinal, que ocasionalmente seriam introduzidas nos rebanhos. Títulos de anticorpos vacinais de 64 a 256 contra a cepa vacinal, por exemplo, podem traduzir-se em títulos de 2 ou menos contra amostras antigenicamente diferentes (Bolin et al., 1991). Devido a essa baixa reatividade cruzada, amostras antigenicamente diferentes provavelmente escapam à neutralização ou são neutralizadas parcialmente pelos anticorpos vacinais, resultando em proteção insuficiente.

Os testes de SN cruzada realizados no presente estudo revelaram atividade neutralizante reduzida, e até mesmo quase indetectável, do anti-soro de três cepas vacinais do BVDV contra várias amostras brasileiras do BVDV. Essa reduzida capacidade neutralizante foi mais evidente no anti-soro das cepas NADL e Oregon/c24v, sendo mais acentuada contra as amostras de BVDV tipo 2 (Tab. 2; Fig. 1). Essa baixa reatividade sorológica cruzada entre cepas vacinais e amostras brasileiras do BVDV leva ao questionamento sobre o grau de proteção conferido pelas vacinas elaboradas com essas cepas. Estudos sorológicos preliminares realizados no laboratório de virologia da UFSM têm indicado que uma grande parcela de animais vacinados contra o BVDV em rebanhos do Rio Grande do Sul apresenta títulos baixos e até mesmo indetectáveis de anticorpos neutralizantes, mesmo quando testadas contra o vírus do mesmo genótipo (E.F. Flores, dados não publicados). Considerando-se que as vacinas contra o BVDV atualmente utilizadas no Brasil são inativadas, e que induzem resposta imunológica essencialmente humoral, níveis baixos ou indetectáveis de anticorpos neutralizantes provavelmente traduzem-se em níveis inadequados de proteção.

Durante décadas, as vacinas contra o BVDV foram formuladas utilizando-se apenas uma cepa viral por vacina e os testes de eficácia eram realizados por meio do desafio com o vírus homólogo poucos meses após a vacinação (Dubovi, 1992). Com a posterior constatação da grande variabilidade antigênica do vírus, de falhas freqüentes de proteção vacinal e sobretudo da importância da proteção fetal, fez-se necessária uma reavaliação dos conceitos relativos à imunização e proteção. Os conceitos atuais sobre imunização e proteção contra o BVDV consideram a grande variabilidade antigênica existente entre isolados de campo, a existência de dois genótipos de vírus antigenicamente distintos, a necessidade de proteger os animais da doença clínica e, sobretudo, proteger os fetos da infecção transplacentária (Dubovi, 1992; Bolin, 1995; Edwards & Paton, 1995). Em países da América do Norte e Europa, a tendêncial atual é incluir vírus dos dois genótipos na formulação das vacinas de modo a obter-se um espectro de proteção que reflita a diversidade que existe entre isolados de campo. Os recentes estudos que demonstraram a existência de uma ampla diversidade genética e antigênica entre amostras de BVDV que circulam no Brasil (Botton et al., 1998a,b; Canal et al., 1998; Gil, 1998), aliada aos resultados apresentados neste estudo, também indicam a necessidade da formulação de vacinas com amostras brasileiras, e que contenham vírus dos dois genótipos (Tab. 3).

A grande diversidade antigênica do BVDV, e em especial a baixa reatividade sorológica cruzada entre BVDV tipos 1 e 2, pode também interferir no diagnóstico sorológico (Edwards & Paton, 1995; Brock, 1995). Os testes de neutralização viral têm sido considerados particularmente susceptíveis ao fenômeno da diversidade antigênica do BVDV. Variações marcantes nos títulos de anticorpos de uma mesma amostra de soro podem ser facilmente demonstráveis através da utilização de diferentes cepas de vírus (Edwards & Paton, 1995; Brock, 1995). Para minimizar esse problema, esses testes deveriam utilizar cepas representativas de amostras locais de vírus, o que raramente tem sido feito. Cepas altamente citopatogênicas, como as utilizadas no presente estudo, têm sido preferidas sobretudo pela rapidez e facilidade de interpretação dos resultados (Brock, 1995; Edwards & Paton, 1995). Na amostragem examinada, 28 amostras (10%) foram identificadas como positivas apenas para BVDV tipo 1 e outras 37 (13,2%) reagiram positivamente apenas com o vírus do genótipo 2. Ou seja, a utilização isolada da cepa Singer resultaria na falha em detectar 13,2% dos animais com anticorpos anti-BVDV, enquanto que a utilização isolada da cepa de BVDV tipo 2 resultaria em 10% de falsos negativos. A magnitude dessas diferenças seria ainda maior se as cepas NADL e Oregon fossem utilizadas, pois dentre as três cepas citopáticas testadas, a cepa Singer foi a que reagiu com maior número de amostras de soro (dados não apresentados). Esses resultados demonstram que os testes de SN utilizando apenas uma cepa viral (BVDV tipo 1 ou 2) em regiões onde circulam vírus dos dois genótipos certamente falham em detectar uma parcela significativa de animais sorologicamente positivos. A magnitude dessas falhas depende fundamentalmente da cepa utilizada e da sua relação antigênica com as amostras de campo circulantes na população examinada. Por isso, a inclusão de vírus dos tipos 1 e 2 nos testes de SN faz-se necessária para a detecção de uma parcela maior de animais sorologicamente positivos. Amostras de BVDV tipo 2 citopáticas já foram identificadas na América do Norte e foram colocadas à disposição de laboratórios de diagnóstico, o que facilitará a implementação de testes sorológicos com vírus dos dois genótipos.

Em resumo, os resultados apresentados demonstram que a grande variabilidade genética e antigênica das amostras brasileiras do BVDV não possui apenas significado biológico e acadêmico. Essa diversidade reveste-se de grande relevância prática para o diagnóstico e controle da infecção. A baixa reatividade sorológica cruzada entre amostras de BVDV tipo 1 e 2 indica a necessidade da inclusão de vírus dos dois genótipos em testes sorológicos. Da mesma forma, a atividade neutralizante muito reduzida do anti-soro de cepas vacinais contra algumas amostras brasileiras do BVDV leva ao questionamento sobre o grau de proteção conferido por essas vacinas. Nesse sentido, a inclusão de vírus de ambos os genótipos nas vacinas e/ou a formulação de vacinas com amostras brasileiras de vírus apresentam-se como decisões imperativas e prementes no combate à infecção pelo BVDV no Brasil.

 

REFERÊNCIAS

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