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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.52 n.1 Belo Horizonte Feb. 2000

https://doi.org/10.1590/S0102-09352000000100011 

Avaliação da eficiência de um probiótico no controle de diarréia e no ganho de peso de bezerros

(Evaluation of the efficiency of a probiotic in the control of diarrhea and weight gain in calves)

 

F.A. Ávila1, A.C. Paulillo1 R.P. Schocken-Iturrino1, F.A. Lucas2, A. Orgaz2, J.L.Quintana1

1Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Campus Jaboticabal
Rodovia Paulo Donato Castelani
14870-000 – Jaboticabal, SP
2Acadêmico de Medicina Veterinária da FCAVJ-UNESP, bolsista do CNPq e da FAPESP

 

Recebido para publicação, após modificação, em 2 de agosto de 1999.

 

 

RESUMO

Foram utilizadas 99 vacas prenhes distribuídas em oito grupos que receberam os seguintes tratamentos: grupo I, com 29 vacas não vacinadas e seus bezerros que não receberam probiótico, ficando como controle; grupo II, com 10 vacas vacinadas e seus bezerros que não receberam probiótico; grupos III, IV e V, com 10 animais cada, vacas vacinadas e seus bezerros que receberam probiótico durante 5, 15 e 30 dias, respectivamente; os grupos VI, VII e VIII, com 10 animais cada, vacas não vacinadas e seus bezerros que receberam probiótico durante 5, 15 e 30 dias, respectivamente. Cada animal dos grupos vacinados recebeu duas doses vacinais contendo os pili K99 e A14 de Escherichia coli na dose de 5,0ml por via subcutânea. O probiótico contendo Ruminobacter amylophilum, Ruminobacter succinogenes, Succinovibrio dextrinosolvens, Bacillus cereus, Lactobacillus acidophilus e Streptococcus faecium, na dose de 3,0´ 108 células vivas (UFC) de cada amostra em 250ml de leite, era adiministrado por via oral. Os animais foram observados diariamente e foram determinados os títulos de anticorpos anti-K99 e anti-A14 no soro e no colostro. Anotaram-se os pesos dos bezerros ao nascimento e aos 30 dias. Os resultados mostraram que a associação de vacina com probiótico administrado por 15 e 30 dias foram os tratamentos mais eficientes no controle da diarréia e ganho de peso.

Palavras-chave: Bovino, Escherichia coli, probiótico, diarréia

 

ABSTRACT

A total of 99 pregnant cows were dividided into eight groups and submitted to the following treatments: group I (n = 29) non vaccinated cows whose calves did not receive probiotic and was used as control; group II (n= 10) vaccinated cows whose calves did not receive a probiotic; groups III, IV and V (n= 10 each) vaccinated cows whose calves received a probiotic for 5, 15 and 30 days, respectively; groups VI, VII and VIII (n= 10 each) non vaccinated cows whose calves received a probiotic for 5, 15 and 30 days, respectively. Each animal in the vaccinated groups received two vaccine doses, subcutaneously, containing pili K99 and A14 of Escherichia coli. The probiotic containing Ruminobacter amylophilum, Ruminobacter succinogenes, Succinovibrio dextrinosolvens, Bacillus cereus, Lactobacillus acidophilus and Streptococcus faecium at the dose of 3.0´ 108 live cells (CFU) of each sample resuspended in 250ml of milk, was administered orally. All animals were observed clinically and bacteriologically and anti-K99 and anti-A14 antibody titers were determined in serum and colostrum. Mean calf weight was mensured at birth and at 30 days of age. The results showed that the combination of vaccine with the probiotic administered for 15 and 30 days were the most efficient treatments for the control of diarrhea and weight gain.

Key Words: Bovine, Escherichia coli, probiotic, diarrhea

 

 

INTRODUÇÃO

Durante as primeiras semanas de vida, distúrbios do trato digestivo têm sido freqüentemente relatados na patologia de bezerros. Das diferentes causas de diarréia em bezerros, a Escherichia coli enterotoxigênica é a mais comum. O desenvolvimento de diarréia por Escherichia coli enterotoxigênica depende de dois fatores: colonização do intestino delgado e produção de enterotoxina (Hadad & Gyles, 1982).

Os pili K99 (Savage, 1980) e A14 (Ávila et al., 1988b) são apêndices filamentosos de constituição protéica, os quais são produzidos por algumas bactérias e têm papel importante na colonização do intestino delgado de bezerros por Escherichia coli. A ingestão de colostro de vacas imunizadas contra Escherichia coli portadora de K99 tem sido relatada como sendo eficiente na proteção de bezerros contra colibacilose (Ávila et al., 1986). Garcia et al. (1994) avaliaram uma vacina oleosa contra colibacilose bovina utilizando antígenos K99-F41 semi-purificados da amostra B41 de Escherichia coli. Concluíram que a vacina não provocou nenhuma reação adversa e foi eficiente na imunoprofilaxia passiva da diarréia neonatal bovina. Entretanto, o aparecimento de novos antígenos de aderência (Ávila et al., 1988b) motivou o desenvolvimento de novas vacinas potencializadas com esses antígenos.

Uma característica importante do bom funcionamento do trato intestinal é determinada pelo equilíbrio de sua microflora bacteriana. Esse equilíbrio é muito importante mas difícil de ser verificado. Ele é principalmente prejudicial para os microrganismos patogênicos, os quais são capazes de se multiplicar rapidamente e que, às vezes, preexistem na flora intestinal. Tal equilíbrio pode ser alterado por fenômenos agressivos que modificam as secreções intestinais e peristalse (Hungate, 1975; Tannock, 1984). Nesse caso, organismos patogênicos como a Escherichia coli enterotoxigênica podem proliferar.

Preparações de bactérias vivas de gêneros Ruminobacter, Lactobacillus, Succinovibrio, Bacillus, Streptococcus e outros, chamadas de probióticos, são comumente adicionadas como suplementação dietética para manter e estabilizar uma população de organismos benéficos no trato gastrintestinal, melhorando com isso o crescimento e a eficiência na utilização de alimentos de bovinos (Smith & Linggood, 1972).

Abe et al. (1995) estudaram os efeitos da administração de um probiótico contendo Bifidobacterium thermophilum, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus no ganho de peso de leitões e bezerros recém-nascidos. A freqüência de diarréia em leitões e bezerros foi menor nos grupos tratados com o probiótico. A média do ganho de peso dos bezerros, após 90 dias de experimento, foi 40% maior no grupo tratado com o probiótico quando comparado ao grupo controle.

Siuta (1991) testou por um período de 137 dias o ganho de peso de 36 novilhos Hereford, tratados diariamente, ad libitum, com dietas de concentrados à base de silagens de cevada e de milho e cubos de luzerna, misturadas com 0,5ml de probiótico "Cytozyme" por cabeça. O probiótico aumentou o ganho de peso diário em cerca de 10-14% e melhorou a eficiência da conversão alimentar em cerca de 6%. Esses efeitos foram melhor observados com silagem de milho.

Portanto, o papel do probiótico como biorregulador microbiano é manter o equilíbrio da microbiota intestinal e ruminal, tendo como principal função impedir a colonização intestinal por bactérias patogênicas como a Escherichia coli enterotoxigênica (Ávila et al., 1988; Ávila et al., 1998a) e o aumento do ganho de peso (Abe et al., 1995; Siuta, 1991).

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de um probiótico, comparando-o com uma vacina e com a associação dos dois tratamentos no controle da diarréia por Escherichia coli enterotoxigênica e no ganho de peso de bezerros.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizadas como probiótico [Fornecido por IMEVE - Jaboticabal, SP] amostras de Ruminobacter amylophilum, Ruminobacter succinogenes, Succinovibrio dextrinosolvens, Bacillus cereus, Lactobacillus acidophilus e Streptococcus faecium, isoladas de rúmen e de trato intestinal de bovinos adultos, seguindo as recomendações de Hungate (1975) e Wolf et al. (1975), e que apresentaram as seguintes características: apatogênicas, produtoras de ácido láctico (algumas amostras) e resistência a pH entre 4,0 e 3,0. O inóculo continha 3,0´ 108 células vivas de cada amostra na forma liofilizada em 10g de substância inerte (carbonato de cálcio) como veículo. O probiótico misturado em 250ml de leite foi administrado aos bezerros por via oral e individualmente, a partir do primeiro dia de vida.

Foram utilizadas 99 vacas prenhes pertencentes à Fazenda Três Barras, no município de Pitangueiras-SP. Os animais foram distribuídos em oito grupos e receberam os seguintes tratamentos: grupo I, com 29 vacas não vacinadas e seus bezerros que não receberam probiótico, permanecendo como grupo-controle; grupo II, com 10 vacas vacinadas e seus bezerros, que não receberam probiótico; grupos III, IV e V, com 10 animais cada, vacas vacinadas e seus bezerros, que receberam probiótico durante 5, 15 e 30 dias, respectivamente; grupos VI, VII e VIII, com 10 animais cada, vacas não vacinadas e seus bezerros, que receberam probiótico durante 5, 15 e 30 dias, respectivamente.

A vacina experimental foi preparada com duas amostras de Escherichia coli, uma K99+ STa+ e outra A14+ STa-. As culturas foram inativadas com formol comercial 40% e adsorvidas na mesma proporção de hidróxido de alumínio a 2,5%. A dose vacinal era de 5,0ml e continha 5,0´ 109 bactérias de cada amostra de Escherichia coli.

Cada vaca prenhe dos grupos II, III, IV e V recebeu duas doses vacinais de 5,0ml por via subcutânea. A primeira dose foi administrada entre a quinta e a sexta semana antes do parto e a segunda, três semanas após a primeira dose. Os animais do grupo I receberam na quinta ou sexta semana antes do parto 5,0ml de placebo (salina estéril) e outra dose três semanas após.

De cada vaca foram colhidas amostras de sangue antes da vacinação ou da administração do placebo e no dia do parto, e também amostra de colostro para a pesquisa de anticorpos anti-K99 e anti-A14. Os títulos de anticorpos foram determinados pela técnica de aglutinação em tubo usando antígenos purificados conforme Acres et al. (1979). O título foi expresso pela recíproca da maior diluição do soro que mostrava aglutinação.

Todos os bezerros imunizados passivamente, tratados com probiótico e controles foram examinados clinicamente todos os dias do experimento, observando-se os casos de diarréia. Também foram pesados ao nascer e no 30o dia de vida.

Dos casos de diarréia, amostras fecais eram colhidas em suabes e submetidas a exames bacteriológicos. Os animais doentes eram tratados em seguida para se recuperarem.

As amostras fecais eram semeadas em ágar MacConkey, MRS agar e agar sangue. Colônias típicas de Escherichia coli eram identificadas pelos seguintes testes: fermentação da lactose, produção de indol, reações de vermelho de metila e Voges & Proskauer, utilização de citrato, formação de urease e produção de H2S. Para a identificação de Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecium e Bacillus cereus foram feitas lâminas coradas pelo método de Gram. As colônias suspeitas foram identificadas por testes bioquímicos e sorológicos específicos. Tanto para os isolamentos quanto para os testes bioquímicos, as leituras foram feitas após 24 horas de incubação a 37oC.

A identificação sorológica das amostras de Escherichia coli foi realizada com antissoro OK produzido em coelhos contra as seguintes cepas: Myers 483 (O9:K35:K99), Myers 490 (O101:K30:K99), Myers 505 (O101: K28:K99), Myers 524 (O8:K85:K99), Myers 559 (O9:K25:K99), Myers Wi-1 (O20:K?:K99). As amostras foram identificadas por meio do teste de aglutinação em lâmina, conforme técnica usada por Ávila et al. (1988a).

Soros anti-K99 e anti-A14 foram preparados por meio da imunização de coelhos contra os pili A14 purificados e contra a amostra K12:K99 cultivada a 37ºC, conforme relatos de Edwards & Ewing (1972). O soro anti-K12:K99 foi adsorvido com amostra homóloga cultivada a 18ºC. As amostras de Escherichia coli empregadas para detecção de K99 e A14 foram cultivadas em ágar Minca a 37ºC por 18 horas e examinadas por meio do teste de aglutinação em lâmina, conforme técnica utilizada por Ávila et al. (1988b).

As amostras de Escherichia coli foram cultivadas em caldo infusão cérebro-coração (BHI) em banho-maria sob agitação de 150-200rpm, a 37oC por 18 horas e depois obtidas por centrifugação. Azul de Evans a 2% foi adicionado ao sobrenadante de cada amostra e 0,1ml da mistura foi inoculado por via intragástrica em três camundongos com três a quatro dias de idade. Um outro camundongo, da mesma idade, foi inoculado pela mesma via com 0,1ml de caldo BHI e azul de Evans e mantido como controle, de acordo com a técnica de Dean et al. (1972).

O experimento foi realizado segundo um delineamento inteiramente ao acaso com controles por grupos de tratamentos. Usou-se a análise de variância para estudar o efeito dos tratamentos sobre o ganho de peso e o teste do qui-quadrado para avaliar a incidência de diarréia (Anderson, 1980).

 

RESULTADOS

A Tab. 1 mostra o número e a porcentagem de bezerros que apresentaram diarréia em cada grupo, com os respectivos números de isolamentos de Escherichia coli produtoras ou não de enterotoxina STa.

 

 

Na Tab. 2 estão relacionados os títulos de anticorpos aglutinantes contra os antígenos K99 e A14 presentes no soro e colostro das vacas de cada grupo. Das 99 vacas prenhes, 28 apresentaram no soro, antes da aplicação da primeira dose da vacina ou placebo, títulos aglutinantes entre 2 e 4 para os pili K99 e A14.

 

 

Na Tab. 3 estão relacionados os dados médios dos pesos dos bezerros de cada grupo ao nascimento e aos 30 dias de idade, assim como os seus respectivos ganhos médios de peso.

 

 

A porcentagem, o número e os sorotipos de Escherichia coli isolados das fezes dos bezerros com diarréia, em cada grupo podem ser observados na Tab. 4.

 

 

DISCUSSÃO

Pelos resultados do teste de aglutinação em lâmina contra os dois antígenos de aderência (Tab. 1), pode-se observar que das amostras de Escherichia coli isoladas dos bezerros com diarréia, 31 (31,3%) produziam os pili K99 e 9 (9,1%) produziam os pili A14. No teste do camundongo todas as amostras K99+ foram STa+, enquanto que as amostras A14+ foram STa-. Comparando com a literatura, essas taxas são semelhantes às encontradas por Hadad & Gyles (1982), no Canadá, e por Ávila et al. (1988a), no Brasil.

Títulos aglutinantes, variando de 2 a 4 (Tab. 2), foram encontrados em soros de 28 vacas, antes da imunização ou da aplicação do placebo, para os dois pili. Esses títulos de anticorpos presentes nos soros sangüíneos dessas vacas antes da imunização possivelmente sejam devidos ao contato desses animais com a bactéria portadora desses pili. Esse fato também é relatado por Ávila et al. (1998) em porcas. Aumentos nos títulos séricos das vacas dos grupos II a V foram verificados após a vacinação. Esses aumentos também foram verificados nos títulos de anticorpos no colostro das vacas vacinadas especialmente contra o antígeno A14. Tais fatos concordam com aqueles relatados por Ávila et al. (1986) com relação à transferência de anticorpos pós-vacinais do soro para o colostro e deste aos bezerros.

Observou-se diferença significativa (P<0,05) quanto ao número de bezerros com diarréia entre o grupo-controle e os grupos tratados com o probiótico, isto é, o número de casos com diarréia foi menor entre os bezerros tratados. Essa diminuição do número de casos de diarréia também é relatada por Abe et al. (1995), ao estudar os efeitos da administração de um probiótico para leitões e bezerros.

Com relação ao ganho de peso, observou-se diferença significativa (P<0,01) entre os tratamentos. A diferença mínima significativa foi de 2,7kg, e entre os tratamentos os que se mostraram mais eficientes foram os grupos IV e V, cujas vacas foram vacinadas e os bezerros receberam probiótico, respectivamente, durante 15 e 30 dias. Taxas de ganho de peso de 10 a 40% a mais, com a utilização de probiótico na suplementação de concentrados para bezerros, também são relatadas por Siuta (1991) e Abe et al. (1995).

Quatro sorotipos portadores dos pili K99 foram isolados e pertenciam aos sorogrupos O8 e O101. Os sorotipos portadores dos pili A14 não foram classificados. Nos animais que receberam probiótico e apresentaram diarréia predominou Escherichia coli e foi difícil o isolamento de Lactobacillus e Streptococcus. Entretanto, nos animais sem diarréia, a presença de Lactobacillus e Streptococcus nas fezes parecia predominar, tornando-se fácil o seu isolamento. Tal observação também foi relatada por Savage (1980) e Tournut et al. (1988). Isso parece confirmar a função do probiótico relatada por Àvila et al. (1998), qual seja, a de impedir a colonização intestinal por Escherichia coli enterotoxigênica.

Concluiu-se que a associação de vacina com probiótico administrado por 15 ou 30 dias é o tratamento mais eficiente no controle da diarréia e para ganho de peso em bezerros.

 

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