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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.52 n.2 Belo Horizonte Apr. 2000

https://doi.org/10.1590/S0102-09352000000200001 

Perfil sorológico das amostras de Clostridium botulinum tipos C e D utilizadas para produção de imunógenos no Brasil

[Serological profile of C and D type Clostridium botulinum strains used for toxoid production in Brazil]

 

A.C. Almeida1, V.L.V. Abreu2, F.C.F. Lobato3

1Instituto de Ciências Agrárias e Medicina Veterinária da Universidade de Alfenas
MG 179, km 0, Campus Universitário
37130-000, Alfenas, MG
2Laboratório Regional de Apoio Animal- LARA, Pedro Leopoldo, MG
3Escola de Veterinária da UFMG

 

Recebido para publicação, após modificações, em 29 de novembro de 1999.
E-mail: npica@unifenas.br

 

 

RESUMO

Com o objetivo de avaliar o perfil sorológico de três amostras de Clostridium botulinum tipo C e três do tipo D utilizadas para produção de imunógenos no Brasil, determinou-se o índice de eficiência e o grau de homologia sorológica dentro de cada tipo. O índice de eficiência mostrou a mesma tendência para os dois tipos. Os consumos relativos de antitoxinas foram proporcionais nos níveis de 20, 200 e 1000 DL50, verificados através de curvas de neutralização que apresentaram inclinações semelhantes. A quantificação da variação do consumo de antitoxinas expresso em grau de homologia sorológica reflete uma similaridade relativa entre as amostras, sendo neutralizados 80 a 91,5% de determinantes antigênicos para o tipo C e 85 a 95% para o tipo D. Pelos resultados apresentados, as amostras analisadas comportaram-se como variantes sorológicas nos níveis de testes de 20, 200 e 1000 DL50.

Palavras- chave: Clostridium botulinum, toxóides, botulismo

 

ABSTRACT

Aiming to the serological evaluation of three strains of C type and three strains of D type Clostridium botulinum used for the production of vaccines in Brazil, the neutralization effectiveness and serological homology in each type were determined. The rate of effectiveness showed the same tendency for both types. The relative antitoxin consumptions were proportional at levels of 20, 200 and 1000 LD50 , verified through neutralization curves which presented similar profiles. The quantification of the antitoxin consumption and variation, which was an expression of serological homology degree, reflect a relative similarity between the strains, and resulted in 80 to 91.5% cross-neutralization of the antigenic structure for the samples of C type and 85 to 95% for the samples of D type. The results showed that the strains behaved as serological variants at the test levels of 20, 200 and 1000 DL50.

Keywords: Clostridium botulinum, toxoids, botulism

 

 

INTRODUÇÃO

Oito grupos distintos de toxinas botulínicas designadas pelas letras A, B, C1, C2, D, E, F e G são conhecidas atualmente. Embora sejam antigenicamente distintas, as toxinas botulínicas, com exceção de C2, possuem origem, estrutura e ação farmacológica comuns (Simpsom, 1981). Em geral, uma amostra produz um só tipo de toxina. Exceções ocorrem com algumas amostras dos tipos A, B e F que produzem dois tipos de toxinas e por amostras dos tipos C e D que produzem toxinas com determinantes antigênicos comuns entre os tipos (Gimenez & Gimenez, 1995; Hatheway & Ferreira, 1996). Essa heterogeneidade entre as amostras de C. botulinum levou a estudos no comportamento fisiológico dos componentes do gênero Clostridium que produzem neurotoxinas, classificando-os em grupos metabólicos, sendo a taxonomia restrita à neurotoxina produzida (Gimenez & Gimenez, 1993).

A eficiência para neutralização de toxinas por antitoxinas, em diferentes níveis, fornece suporte para classificação sorológica de amostras de C. botulinum (Gimenez & Gimenez, 1993).

As neurotoxinas C1 e D produzidas por C. botulinum dos tipos C e/ou D, responsáveis pelo botulismo bovino, apresentam heterogeneidade quanto à antigenicidade e composição de aminoácidos entre produtos do mesmo tipo, além de existir determinantes antigênicos comuns aos dois tipos. Essa variabilidade de neurotoxinas interfere na taxa de neutralização das toxinas por antitoxinas do mesmo tipo, produzidas por amostras de origens diferentes (Oguma et al., 1981, 1982, 1984; Terajima et al., 1985).

A classificação das amostras de C. botulinum dos tipos C e D tem gerado especulações, permanecendo obscuras as conseqüências práticas das variações nas taxas de neutralização entre toxinas e antitoxinas produzidas por amostras de origens diferentes dentro de um único tipo e entre dois tipos, permitindo dúvidas na classificação dessas culturas (Simpsom, 1981).

Este trabalho teve por objetivo avaliar o comportamento sorológico de amostras de C. botulinum dos tipos C e D pela determinação do índice de eficiência entre antitoxinas e grau de homologia sorológica entre as toxinas produzidas pelas amostras de cada tipo.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Analisaram-se três amostras de C. botulinum do tipo C e três do tipo D utilizadas para produção de imunógenos por três laboratórios nacionais. As toxinas produzidas foram codificadas pelo tipo, seguido da numeração 01, 02 ou 03, de acordo com o laboratório de origem das amostras, assim como as antitoxinas.

As toxinas foram produzidas com cultivo das amostras em meio de enriquecimento (Syuto & Kubo, 1972) e em meio descrito por Cardella et al. (1958), incubadas a 35ºC por seis dias em jarras de anaerobiose do tipo Gaspak (Bowmer, 1963). Paralelamente fez-se cultivo das amostras em aerobiose, nos mesmos períodos e temperatura, em caldo cérebro-coração, com posterior pesquisa de contaminantes anaeróbios facultativos por meio da coloração pelo método de Gram. As culturas que não apresentaram contaminantes foram semipurificadas para obtenção de toxinas e então realizada a toxinotipia (Lobato, 1989) e titulação (Bowmer, 1963).

As antitoxinas foram produzidas com inoculação de toxinas destoxicadas (Cardella et al., 1958) em grupos de três coelhos, pesando de 2,5 a 3,0kg, para cada toxina. Cada grupo recebeu duas doses de 4ml de toxóide, sendo a primeira adsorvida em adjuvante completo de Freund (v/v) e a segunda em adjuvante incompleto de Freund (v/v), com intervalo de trinta dias, por via intramuscular. Seguiu-se o esquema de inoculação de 10 doses de 1,5ml de toxóide sem adjuvante, sendo 0,5ml via subcutânea e 1,0ml endovenoso com intervalo de cinco dias. Sete dias após a última dose os animais foram desafiados com 10 DMM/ml (dose mínima mortal/ml) de toxina, por via subcutânea, sendo sangrados sete dias após. As imunoglobulinas foram precipitadas com sulfato de amônio (Manson, 1992) e sua titulação foi realizada em antidose letal 50% (anti-DL50) (Gimenez & Cicarelli, 1972).

As provas de neutralização entre as toxinas e antitoxinas foram realizadas nos níveis de teste de 20, 200 e 1000 DL50, sendo calculada a dose neutralizante 100% (DN100) para cada nível (Gimenez & Cicarelli, 1972).

O índice de eficiência das antitoxinas e grau de homologia sorológica entre as toxinas foram realizados de acordo com Gimenez & Cicarelli (1972).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados dos testes de neutralização cruzada entre toxinas e antitoxinas do tipo C (Tab. 1) e do tipo D (Tab. 2) mostram variações na quantidade de toxina necessária para neutralizar toxinas de origens diferentes, resultados semelhantes aos encontrados por Oguma et al. (1981, 1982, 1984) e Terajima et al. (1985).

 

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A eficiência das antitoxinas frente a toxinas de diferentes origens, em valores absolutos, foi variável e mais alta com o incremento da dose teste de toxina para os tipos C e D. Esses aumentos nas DN100 de antitoxinas e conseqüente aumento no seu consumo relativo refletem a necessidade de maiores níveis de anticorpos para a neutralização de determinantes antigênicos que, provavelmente, vieram a se manifestar com o aumento nas concentrações de toxinas (Gimenez & Cicarelli, 1972; Gimenez & Gimenez, 1993, 1995).

A concentração de determinantes antigênicos em uma dose-teste específica de toxina estabelece a eficiência da antitoxina na sua neutralização (Furthope, 1955). Essas variações em concentrações dentro dos tipos C e D permitem especulações a respeito da presença de variantes sorológicas (Gimenez & Cicarelli, 1972; Gimenez & Gimenez, 1993).

Ao se avaliarem os índices de eficiência, observa-se a mesma tendência para as antitoxinas do tipo C e tipo D, demonstrando que os aumentos no consumo de antitoxinas foram proporcionais em relação ao sistema toxina-antitoxina de mesma origem, considerado como padrão, nos níveis de 20, 200 e 1000 DL50/ml.

O índice de eficiência, determinado pela quantidade proporcional de antitoxina necessária para neutralizar uma toxina em três níveis de testes diferentes, mede a qualidade da antitoxina (Gimenez & Gimenez, 1993). Portanto, as antitoxinas dos tipos C e D aqui testadas foram eficientes para neutralização de toxinas de origens diferentes, do contrário, as combinações toxinas-antitoxinas não seriam proporcionais e as curvas de neutralização teriam inclinações variadas em relação ao padrão. A neutralização não seguiria a lei das proporções múltiplas, e aumentos na dose de toxina necessitariam de consideráveis aumentos nas doses de antitoxinas (Furthope, 1955).

A quantificação na variação dos consumos de antitoxinas, expressos em grau de homologia sorológica, reflete similaridade relativa entre as toxinas dos tipos C e D, sendo observada neutralização de apenas 80% a 91,5% entre os determinantes antigênicos do tipo C (Fig.1) e 85% a 95% entre os do tipo D (Fig. 2).

 

 

 

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Ao analisar os dados aqui apresentados com quantificação das frações distintas demonstrados pela homologia sorológica, e comparando-os com os obtidos por Bulatova & Matevev (1965) e Gimenez & Cicarelli (1972) na classificação de amostras dos tipos C, A e F, pode-se concluir sobre a ocorrência de variantes sorológicas entre as amostras dos tipos C e D, nas dose-testes de toxinas analisadas.

Como as amostras analisadas são utilizadas para produção de imunógenos no país, deve-se avaliar a eficiência dos anticorpos vacinais na neutralização de toxinas em bovinos intoxicados naturalmente, pois a dose tóxica ingerida poderá ser bem superior às testadas.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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