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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.52 n.4 Belo Horizonte Aug. 2000

https://doi.org/10.1590/S0102-09352000000400004 

Avaliação da resposta de antitoxinas beta e épsilon de Clostridium perfringens induzidas em bovinos e coelhos por seis vacinas comerciais no Brasil

[Cattle and rabbits immune response against beta and epsilon Clostridium perfringens toxins induced by six commercial vaccines in Brazil]

 

F.C.F. Lobato1, E. Moro2, O. Umehara2, R.A. Assis1, N.E. Martins1, L.C.B. Gonçalves2

1 Escola de Veterinária da UFMG
Caixa Postal 567
30123-970 - Belo Horizonte, MG
2 Laboratórios Pfizer Ltda. São Paulo, SP

 

Recebido para publicação em 5 de maio de 2000.
E-mail: flobato@vet.ufmg.br

 

 

RESUMO

Avaliou-se a resposta de antitoxinas beta e épsilon de Clostridium perfringens em bovinos vacinados contra clostridioses com seis vacinas disponíveis no mercado. Quarenta e oito bezerros de seis a sete meses de idade foram divididos em oito grupos (T1 a T8) de seis animais cada. Os grupos de número 2 a 7 receberam as vacinas T2 a T7 nos dias 0 e 42 com a dose e via recomendadas pelos fabricantes. Solução salina e toxóide padrão foram usados nos mesmos dias nos grupos 1 e 8 (T1 e T8), respectivamente, como controles negativo e positivo. Amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 42 e 56 pós-vacinação (PV), para titulação de anticorpos no soro. As vacinas e os controles foram também testados em oito coelhos cada, inoculados nos dias 0 e 21 com metade da dose indicada para bovinos. Os coelhos foram sangrados no dia 35 e os soros foram misturados em partes iguais para cada vacina para a titulação de anticorpos. Os soros dos bovinos foram titulados individualmente contra as toxinas beta e épsilon de C. perfringens pelo método de soroneutralização em camundongos. A vacina T2 apresentou títulos de anticorpos de 22,6 e 5,6 UI/ml e a vacina T4 11,2 e 7,0 UI/ml, respectivamente, contra toxinas beta e épsilon em coelhos. Os títulos do toxóide padrão (T8) foram 45,2 UI/ml contra ambas as toxinas. Em bovinos, as médias dos títulos de anticorpos contra a toxina beta nos dias 42 e 56 PV com a vacina T2 (1,15 UI/ml e 8,0 UI/ml) foram similares ao toxóide padrão (2,02 e 10,03 UI/ml). A vacina T4 (0,73 e 4,54 UI/ml) teve títulos menores (P<0,05) que o toxóide padrão e similares a T2. Contra a toxina épsilon, o toxóide padrão teve média de título (0,97 UI/ml) no dia 42 que foi significativamente maior (P<0,05) do que T4 (0,15 UI/ml) e similar a T2 (0,42 UI/ml). No dia 56, T2 (4,27 UI/ml) teve títulos significativamente maiores (P<0,05) do que T4 (0,68 UI/ml) e similares ao toxóide padrão (4,98 UI/ml). Em cada tratamento, a resposta aos 56 dias foi superior (P<0,05) em relação aos 42 dias após a primeira vacinação. As outras vacinas e a solução salina não induziram respostas de antitoxinas beta e épsilon de C. perfringens detectáveis nos soros dos coelhos e dos bovinos. A vacina T2 induziu altos títulos de anticorpos, maiores que aqueles induzidos por T4 e similares ao T8.

Palavras chave: Bovino, coelho, vacina, clostridiose, Clostridium perfringens, anticorpo antitoxina

 

ABSTRACT

The antibody response against beta and epsilon toxins of Clostridium perfringens was evaluated in cattle vaccinated with six commercial clostridial vaccines. Groups of six calves (6-7 months old) were vaccinated with each vaccine (T2 to T7), on days 0 and 42, with the recommended dose and route. Saline solution (T1) and a standard toxoid vaccine (T8) were used as negative and positive controls, respectively. On days 0, 42 and 56 post-vaccination (PV), blood samples were collected for antibody titration. Vaccines, as well as controls, were also injected into 8 rabbits each, on days 0 and 21, using half of the dose recommended for cattle. Rabbits were bled on day 35. Rabbit sera were tested as a pool per vaccine and cattle sera were tested individually against beta and epsilon toxins, by the serum neutralization test in mice. The vaccine T2 had antibody titers of 22.6 and 5.6 IU/ml and T4 had 11.2 and 7.0 IU/ml against beta and epsilon toxins in rabbits, respectively. The standard toxoid had a titer of 45.2 IU/ml against both toxins. In cattle, mean antibody titers against beta toxin on days 42 and 56 PV induced by T2 (1.15 and 8.0 IU/ml) were similar to those induced by the standard toxoid (2.02 and 10.3 IU/ml). T4 titers (0.73 and 4.54 IU/ml), were lower (P<0.05) than those obtained with the standard toxoid, but similar to T2 titers. On day 42, the standard toxoid had a mean titer (0.97 IU/ml) against epsilon toxin significantly higher (P<0.05) than that obtained with T4 (0.15 IU/ml) but similar to T2 mean titer (0.42 IU/ml). On day 56, T2 resulted in a significantly higher titer (4.27 IU/ml) (P<0.05) than that induced by T4 (0.68 IU/ml), but similar to the standard control (4.98 IU/ml). The other vaccines, as well as the saline solution, did not elicit antibody responses, neither in rabbits nor in cattle. T2 induced antibody titers against C. perfringens beta and epsilon toxins similar to those induced by the standard toxoid and higher than those induced by T4.

Keywords: Cattle, rabbit, clostridiosis, clostridial vaccine, Clostridium perfringens, antitoxin

 

 

INTRODUÇÃO

Enterotoxemia é um termo aplicado a um grupo de infecções entéricas dos ruminantes resultantes da absorção de toxinas produzidas principalmente pelo C. perfringens no trato intestinal. O microrganismo é de ampla distribuição no mundo e determina um processo infeccioso de alta letalidade. Condições predisponentes são necessárias para a produção de toxinas como mudança drástica na alimentação, voracidade e sobrecarga alimentar. Essas condições associadas às mudanças na microflora ruminal com passagem de alimentos não digeridos para o intestino delgado produzem meio favorável para o rápido crescimento do agente e produção de toxinas (Niilo, 1980). Os animais acometidos são, em geral, os de melhor condição corporal e de saúde. Enterotoxemia por C. perfringens acomete principalmente animais entre três dias e seis meses de idade. Entretanto, a doença tem sido descrita em animais adultos (Keat & Barron, 1954; Itodo et al., 1983; Sigurdarson & Thorsteinsson, 1990; Silveira et al., 1995). Na região centro-oeste do Brasil, a doença é diagnosticada com maior intensidade em bovinos adultos, sendo C. perfringens tipo D o mais freqüentemente envolvido no processo (Silveira et al., 1995). Devido à alta letalidade e às características ecológicas do agente, sendo ubiquitários do trato intestinal dos animais e do solo e pela forma de resistência na natureza através de esporos, a erradicação das enfermidades causadas pelos clostrídios é praticamente impossível. O controle e a profilaxia devem basear-se em medidas adequadas de manejo e principalmente na vacinação de todo o rebanho com imunógenos eficientes, já que os animais estão em permanente contato com os agentes e com os fatores que poderão desencadear as enfermidades. Embora o diagnóstico de enterotoxemia seja normalmente baseado no histórico, nos sinais clínicos e nos achados de necropsia, a análise de laboratório é de fundamental importância para a confirmação da presença de toxinas produzidas pelo C. perfringens (Sterne & Batty, 1975). A produção de toxinas beta e épsilon está associada aos biótipos: tipo B produz toxinas beta e épsilon, tipo C produz toxina beta e tipo D produz toxina épsilon (European..., 1998).

No Brasil, atualmente está havendo incremento na produção e uso de vacinas contra as clostridioses. Em 1999 foram produzidas 116 milhões de doses de vacinas, 55 milhões delas de vacinas polivalentes com diferentes combinações de C. perfringens, C. chauvoei, C. septicum, C. sordellii e C. novyi, (Neves, R.D. comunicação pessoal). [Ronaldo Dias Neves - LARA/POA - Estrada Ponta Grossa, 3036, 91785-340 - Porto Alegre, RS.] Entretanto, apenas C. botulinum e C. chauvoei são submetidos a controle oficial de potência (Brasil, 1994, 1997). Azevedo et al. (1998) testaram a resposta de antitoxinas beta e épsilon de C. perfringens induzida em coelhos por sete vacinas comerciais no Brasil (seis produzidas localmente e uma importada) e observou que somente a vacina importada induziu respostas de anticorpos neutralizantes. O objetivo do presente estudo foi o de avaliar a resposta de antitoxinas beta e épsilon de C. perfringens em bovinos e coelhos induzida por seis vacinas comerciais disponíveis no mercado brasileiro.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Seis vacinas polivalentes (tratamentos) contra as clostridioses contendo C. perfringens tipos C e D na composição foram usadas neste experimento. Um toxóide padrão de C. perfringens tipos C e D (National Institute for Biological Standardization and Control - UK) e solução salina foram usados como controle positivo e negativo. A composição antigênica das vacinas de acordo com as respectivas bulas é apresentada na Tab. 1.

 

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Soros de 48 bezerros identificados com brincos numerados, machos e fêmeas com idade de seis a sete meses e sem histórico de vacinação prévia contra as clostridioses, foram testados para a presença de antitoxinas beta e épsilon de C. perfringens pelo teste de soroproteção (Tammemagy & Grant, 1967). Os animais, negativos para a presença de antitoxinas beta e epsilon de C. perfringens, foram distribuído ao acaso em oito grupos (T1 a T8) no dia 0. Eles permaneceram juntos em pasto separado dos demais animais de fazenda.

Os bovinos de cada grupo, com exceção dos tratamentos T1 e T8, foram vacinados segundo a dosagem e via indicadas nas respectivas bulas (Tab. 2). Os animais do grupo T1 receberam solução salina e os do grupo T8 receberam o toxóide padrão como controle negativo e positivo, respectivamente. Todos os animais receberam uma segunda dose no dia 42 após a primeira vacinação. As inoculações foram feitas por via subcutânea na tábua do pescoço. Amostras de sangue foram coletadas por punção da veia jugular nos dias 0 e 42, antes de cada vacinação, e no dia 56 pós-vacinação para as provas sorológicas. Após as vacinações os animais foram observados por duas horas para possíveis reações adversas.

 

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Os soros obtidos das amostras de sangue foram estocadas a –20°C até a realização dos testes. Cada amostra de soro foi titulada individualmente.

Grupos de oito coelhos cada, da raça Nova Zelândia, de ambos os sexos e com pesos entre 1,8 e 2,6kg, foram vacinados com cada uma das vacinas e os controles, pela via subcutânea, com metade da dose recomendada para bovinos. Os coelhos receberam uma segunda dose das respectivas vacinas 21 dias após a primeira dose. No dia 35 PV (14 dias após a segunda vacinação) todos os coelhos foram sangrados e os soros dos oito coelhos de cada vacina foram misturados em partes iguais e estocados a –20ºC até o momento dos testes sorológicos (European..., 1998).

Para a produção das toxinas beta e épsilon, amostras de referência de C. perfringens tipo C (ATCC 3628) e D (ATCC 3629) foram cultivadas em meio contendo tripticase (3%), extrato de levedura (2%), glicose (0,1%) e L-cisteína (0,1%), em atmosfera de anaerobiose a 37ºC por oito horas. As culturas foram centrifugadas a 10.000´g por 20 minutos e os sobrenadantes obtidos foram concentrados em sistema Amicon em uma membrana com capacidade de retenção de 10kDa e mantidos a –70ºC até o momento do uso. As toxinas beta e épsilon de C. perfringens tipos C e D foram tituladas em camundongos, segundo Azevedo et al. (1998).

Cada soro-teste foi misturado com toxinas beta e épsilon de C. perfringens. As misturas foram preparadas na proporção de 0,1ml do soro puro e 0,1ml contendo 2,5DL50 de toxina beta ou 5,0DL50 de toxina épsilon (Tammemagy & Grant, 1967). Uma suspensão contendo 2,5DL50 de beta ou 5,0DL50 de toxina épsilon em 0,2ml foi usada para controle das toxinas. As misturas soro-toxinas e controles foram homogeneizadas e incubadas em banho-maria a 37°C por 30 minutos e cada mistura foi inoculada por via intravenosa com dose de 0,2ml em dois camundongos Swiss, cepa Webster, com peso entre 17 e 22g. Os camundongos foram observados durante três dias após inoculação sendo anotados o número de mortos e sobreviventes. Os animais cujos soros resultaram em mortes dos camundongos foram considerados negativos ou sem anticorpos detectáveis e anotados como zero. Esse procedimento foi usado para a seleção dos animais negativos para serem usados no experimento e também como triagem dos soros dos coelhos e bovinos vacinados, antes da titulação pelo método de soroneutralização.

As amostras de soro dos bezerros ou os "pools" dos soros de coelhos que protegeram os camundongos no teste de soroproteção foram tituladas pelo método de soroneutralização em camundongos. Prepararam-se diluições seriadas ao dobro do soro com solução salina contendo 1% de peptona e sobre 1,0ml de cada diluição, acrescentou-se 1,0ml da toxina beta ou épsilon padronizadas segundo a European..., (1998) ao nível de L+/10 (menor quantidade de toxina que misturada a 0,1UI de antitoxina padrão homóloga matará 50% dos camundongos inoculados). As misturas foram incubadas em banho-maria a 37°C por 30 minutos e 0,2ml de cada diluição foram inoculados via intravenosa em cinco camundongos. Após inoculação, os camundongos foram observados por três dias anotando-se os números de mortos e sobreviventes. O título 50% de neutralização de cada soro foi calculado pelo método de Reed & Müench (1938) e expresso em UI/ml. Em cada teste foi incluída a mesma quantidade de soros de cada vacina.

Os títulos de anticorpos contra as toxinas beta e épsilon de C. perfringens foram analisados pelo método não paramétrico de Kruskal-Wallis e as comparações entre os títulos de anticorpos foram feitas pelo teste t de Student. O nível de significância foi fixado em 0,05 (Sampaio, 1998).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Todos os animais estavam clinicamente sadios durante todo o período experimental e não apresentaram antitoxinas beta e épsilon antes do início do estudo.

As vacinas T2 e T4 induziram respostas satisfatórias de antitoxinas beta e épsilon de C. perfringens em coelhos (Tab. 3) cujos títulos foram superiores aos títulos mínimos exigidos de 10 UI/ml e 5 UI/ml, respectivamente, para aprovação da vacina (European..., 1998). O toxóide padrão (T8) também induziu altos títulos de anticorpos contra ambas as toxinas (Tab. 3). As médias dos títulos de anticorpos foram: vacina T2 = 22,6 UI/ml e 5,6 UI/ml; vacina T4 = 11,2 UI/ml e 7,0 UI/ml contra toxinas beta e épsilon, respectivamente, e toxóide padrão = 45,2 UI/ml contra ambas as toxinas. Os soros dos coelhos vacinados com as demais vacinas e a solução salina não apresentaram níveis de antitoxinas detectáveis com a dose teste empregada. Esses resultados confirmam, em parte, os obtidos por Azevedo et al. (1998) que testaram sete vacinas no Brasil, das quais seis eram de fabricação nacional e uma era importada, e somente a vacina importada e o toxóide padrão usado como controle induziram respostas satisfatórias nos coelhos vacinados.

 

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O presente estudo mostra que também em bovinos somente as vacinas T2, T4 e o toxóide padrão (T8) induziram títulos de anticorpos neutralizantes das toxinas beta e épsilon (Tab. 4). Os títulos de antitoxina beta nos dias 42 e 56 após a primeira vacinação, induzidos pelo T8 (2,02 e 10,03 UI/ml, respectivamente), foram significativamente (P<0,05) maiores do que os títulos induzidos pela vacina T4 (0,73 e 4,54 UI/ml), mas foram similares aos títulos induzidos por T2 (1,15 e 8,0 UI/ml). Contra a toxina épsilon, a média de anticorpos aos 42 dias após a primeira vacinação induzidos pelo toxóide padrão (0,97 UI/ml) foi significativamente (P<0,05) maior do que T4 (0,15 UI/ml) e similar a T2 (0,42 UI/ml). Aos 56 dias após a primeira vacinação, T2 teve média de títulos de anticorpos (4,27 UI/ml) significativamente (P<0,05) mais elevada do que T4 (0,68 UI/ml) e similar ao toxóide padrão (4,98 UI/ml). Em cada tratamento, a resposta aos 56 dias foi superior (P<0,05) em relação aos 42 dias após a primeira vacinação.

 

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Esses níveis mais elevados de anticorpos após a vacinação "booster" estão de acordo com os estudos de Sterne et al. (1962) e Jansen (1967), que mostraram a importância da vacinação de reforço para adequada imunidade. Na literatura consultada há escassez de trabalhos relacionados à determinação de anticorpos neutralizantes para toxinas beta e épsilon em bovinos. Kennedy et al. (1977a,b) detectaram títulos de 10 UI/ml e 5 UI/ml para antitoxinas beta e épsilon respectivamente, entretanto os níveis de teste empregados foram inferiores aos utilizados neste estudo, não sendo compatíveis com a metodologia proposta pela European... (1998). Os resultados obtidos nos coelhos e bovinos no presente estudo permitem inferir que existe boa correlação entre o teste de potência em coelhos e a resposta imunológica em bovinos, pois somente as vacinas que foram aprovadas no teste em coelhos apresentaram respostas de anticorpos neutralizantes também em bovinos. Entretanto, novos estudos são necessários para estabelecer os níveis mínimos de anticorpos protetores frente ao desafio de campo.

As vacinas T2, T4 e o toxóide padrão induziram altos títulos de anticorpos contra as toxinas beta e épsilon nos coelhos e nos bovinos. As demais vacinas ou a solução salina não induziram respostas de anticorpos neutralizantes detectáveis nem nos coelhos nem nos bovinos. Não se observaram sinais clínicos de reações adversas em nenhum dos animais vacinados.

 

    REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AZEVEDO, E.O., LOBATO, F.C.F., ABREU, V.L.V. et al. Avaliação de vacinas contra Clostridium perfringens tipos C e D. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.50, p.239-242, 1998.        [ Links ]

BRASIL. Ministério da Agricultura. Laboratório de Referência Animal. Portaria n. 051, 16/07/1994 [comunicado interno].        [ Links ]

BRASIL. Ministério da Agricultura. Portaria n. 49, 12 de maio de 1997. Diário Oficial da União, Brasília, 16 de maio de 1997. Seção 1, p.10168-10169.        [ Links ]

EUROPEAN PHARMACOPEIA. 3.ed. Sainte Ruffine: Maisonneuve S.A., 1998, p. 363: Vaccinum clostridii perfringentis ad usum veterinarium.         [ Links ]

ITODO, A. E, AGBA, M. I,OKEWOLE, P. A. Clostridium perfringens type D enterotoxaemia in cattle. Bull. Anim. Health Prod. Afr., v.31, p.193-195, 1983.        [ Links ]

JANSEN, B.C. The production of a basic immunity against pulpy kidney disease. Onderstepoort. J. Vet. Res., v. 34, n.1, p. 65-80, 1967.        [ Links ]

KEAST, J.C., McBARRON, E.J. A cause of bovine enterotoxemia. Aust. Vet. J., v.30, p.305-306, 1954.        [ Links ]

KENNEDY, K.K., NORRIS, S.J., BECKENHAUER, W.H. et al. Antitoxin response in cattle vaccinated with Clostridium perfringens type C toxoid. Vet. Med. Small Anim. Clin., v.72, p.1213-1215, 1977a.        [ Links ]

KENNEDY, K.K., NORRIS, S.J., BECKENHAUER, W.H. et al. Vaccination of cattle and sheep with a combined Clostridium perfringens types C and D toxoid. Am. J. Vet. Res., v.38, p.1515-1517, 1977b.        [ Links ]

NIILO, L. Clostridium perfringens in animal diseases. A review of current Knowledge. Can. Vet. J., v.21, p.141-148, 1980.        [ Links ]

REED, L.J., MÜENCH, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Hyg., v.27, p.493-497, 1938.        [ Links ]

SAMPAIO, I.B.M. Estatística aplicada à experimentação animal. Belo Horizonte, Fundação de Ensino e Pesquisa em Medicina Veterinária e Zootecnia, 1998. 221p.        [ Links ]

SIGURDARSON, S., THORSTEINSSON, T. Sudden death of icelandic dairy cattle. Vet. Rec, v.127, p.410, 1990.        [ Links ]

SILVEIRA, D., SOUZA, A.M., MESQUITA, A.J., et al. Enterotoxemia em bovinos: uma enfermidade de importância emergente. Bol. Tec. Inf. Rhodia-Mérieux, v.2, p.1-4, 1995.        [ Links ]

STERNE, M., BATTY, I., THOMPSON, A. et al. Immunization of sheep with multi-component clostridial vaccines. Vet. Rec., v.74, p.909-913, 1962.        [ Links ]

STERNE, M., BATTY, I. Patogenic Clostridia. London: Butlerworths, 1975. 143p.        [ Links ]

TAMMEMAGY, L., GRANT, K. M. Vaccination in the control bovine botulism in Wuesland. Aust. Vet. J., v.43, p.368-373, 1967.        [ Links ]

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