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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.52 n.6 Belo Horizonte Dec. 2000

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352000000600001 

Caracterização eletroforética e análise de subgrupo de rotavírus em rebanhos bovinos leiteiros do Estado de São Paulo

[Eletrophoretical characterization and subgroup analysis of rotavirus in dairy cattle in theState of São Paulo, Brazil]

 

M.G. Buzinaro1, V. Munford2, V.M.E.D. Brito2, M.L. Rácz2, J.A. Jerez3

1Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp
Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n
14870-000 – Jaboticabal, SP
2Instituto de Ciências Biomédicas –USP – São Paulo
3Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP – São Paulo

 

Recebido para publicação, após modificações, em 31 de julho de 2000.
E-mail: glorinha@fcav.unesp.br

 

 

RESUMO

Foi realizado um estudo para determinar a ocorrência de infecção por rotavírus em rebanhos bovinos leiteiros. Foram analisadas 375 amostras de fezes de bezerros, na faixa etária 1 a 45 dias, provenientes de animais pertencentes a nove propriedades rurais, situadas em seis municípios da região nordeste do Estado de São Paulo. Destas, 193 pertenciam a animais com diarréia e 182 foram obtidas de animais clinicamente sadios. As técnicas utilizadas para a detecção de rotavírus foram o ensaio imunoenzimático (EIE) e a eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA). Por meio do EIE foram detectadas 11,2% (42/375) de amostras positivas, 15% delas (29/193) obtidas de animais com diarréia e 7,1% (13/182) colhidas de animais sem diarréia. A análise do perfil do genoma indicou a presença de seis eletroferótipos distintos, característicos de rotavírus do grupo A. Um único eletroferótipo foi detectado em três rebanhos, o qual permaneceu constante durante o período de amostragem. Em dois rebanhos diferentes eletroferótipos foram detectados, embora com maior prevalência de um dado perfil. A caracterização das amostras positivas em subgrupos foi realizada por meio do EIE com "duplo sanduíche", utilizando-se anticorpos monoclonais (MAb) específicos para antígenos de subgrupo (I e II). Foram caracterizadas como subgrupo I 52,4% (22/42) das amostras testadas, nenhuma reagiu com MAb de subgrupo II, enquanto as demais, 47,6% (20/42), não reagiram com nenhum dos dois subgrupos.

Palavras-Chave: Bovino, rotavírus, eletroferótipo, diarréia

 

ABSTRACT

A study was accomplished to determine the occurrence of rotavirus in feces of calves, in the State of São Paulo, Brazil. A total of 375 samples of feces from calves 1 to 45 day-old were collected. The animals belonged to farms situated in six counties of the northeast region of the State. One hundred and ninety tree out of these samples belonged to animals with a clinical picture of diarrhea and 182 were obtained from clinically healthy animals. The techniques used for the detection of rotavirus were the enzyme immunoassay (EIA) and the polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE). By the use of EIA, 11.2% (42/375) of the samples were positive for rotavirus. Among the samples of diarrheic calves, 15% (29/193) were found to be positive for rotavirus, whereas 7.1 (13/182) positive samples were obtained from clinically healthy animals. The PAGE test presented a lower sensitivity than EIA, since from the 42 positive samples in EIA, only 36 presented an electrophoretical profile characteristic of rotavirus. The genome analysis indicated the presence of six distinct electrophoretical types characteristic of group A rotavirus. A unique electropherotype was detected in tree farms, which remained constant during the sampling period. In two farms a second electropherotype was detected. The serological characterization of the positive samples in subgroups was accomplished through EIA with "double sandwich", utilizing monoclonal antibodies ( I and II). Twenty two group A rotavirus strains I (52.4%, 22/42) reacted with MAb of subgroup I, none to subgroup II, and the remaining 47.6% (20/42) did not react with the two subgroups.

Keywords: Bovine, rotavirus, electrophoretical type, diarrhea

 

 

INTRODUÇÃO

Os rotavírus são apontados como importantes agentes causadores de diarréia em bezerros, afetando animais principalmente entre a primeira e a terceira semanas de vida (McNulty & Logan, 1983; Snodgrass et al., 1986; Lucchelli et al., 1992). Os 11 segmentos do RNA de cadeia dupla quando separados por eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) apresentam um padrão de migração característico denominado eletroferótipo (Kalica et al., 1976). Essa técnica tem sido muito utilizada em estudos epidemiológicos da infecção por rotavírus não somente para detectar a presença de rotavírus nas fezes, como também para distinguir diferenças entre as amostras de campo e obter informações sobre o significado epidemiológico das variações genômicas dos rotavírus do grupo A (Theil & McCloskey, 1989). Recentemente, rotavírus dos grupos B e C foram identificados em bovinos (Snodgrass et al., 1984; Tsunemitsu et al., 1991). Nesse caso, o padrão eletroforético desses vírus difere do grupo A pela ausência do "triplet" 7, 8 e 9, os quais são característicos dos rotavírus do grupo A (Saif & Jiang, 1994). De acordo com o perfil de migração dos segmentos do genoma é possível fazer a caracterização preliminar de rotavírus não pertencentes ao grupo A. Embora rotavírus do grupo A sejam agentes freqüentemente envolvidos em surtos de diarréias em bovinos, poucos estudos longitudinais abordaram as características de migração eletroforética do RNA viral de fita dupla (Fijtman et al., 1987; Lucchelli et al., 1992; Mendes et al., 1993; Ishizaki et al., 1994), e nenhum foi realizado no Brasil.

O presente trabalho teve como objetivo pesquisar a ocorrência de infecção por rotavírus em amostras de fezes de bezerros com e sem diarréia em rebanhos de gado bovino leiteiro de uma área geográfica do Estado de São Paulo, Brasil. A análise do perfil do genoma e a caracterização antigênica de subgrupo das amostras positivas para rotavírus também foram determinadas.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisadas 375 amostras de fezes de bezerros, na faixa etária de 1 a 45 dias, colhidas em nove rebanhos de gado bovino leiteiro, denominados por RA1, RA2, RB1, RB2, RC1, RC2, RD, RE e RF. Destas, 193 pertenciam a animais com quadro clínico de diarréia e 182 foram obtidas de animais clinicamente sadios. As propriedades, situadas em seis municípios da região nordeste do Estado de São Paulo, foram visitadas mensalmente durante o período de junho de 1993 a março de 1995.

A presença de rotavírus do grupo A nas amostras de fezes foi detectada por meio do teste de ensaio imunoenzimático para rotavírus e adenovírus (kit-EIARA da Fundação Oswaldo Cruz – Rio de Janeiro, Brasil), segundo técnica padronizada por Pereira et al. (1985). Todas as amostras positivas no EIARA foram testadas pelo ensaio imunoenzimático para detecção de antígeno de subgrupo com anticorpos monoclonais (MAbs) específicos dos subgrupos I e II, de acordo com Taniguchi et al. (1987). Rotavírus do grupo A de origem humana (amostra previamente testada) e símio (SA11) foram utilizados como antígenos controles dos subgrupos I e II, respectivamente.

A eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) foi realizada seguindo-se as recomendações de Herring et al. (1982), com algumas modificações introduzidas por Pereira et al. (1985). Em 0,4ml de suspensão fecal, previamente tratada por freon TF (triclorofluoretano), foram adicionados 40ml de lauril sulfato de sódio (SDS) a 10%, incubando-se a mistura a 37oC por 30 minutos. A seguir, o RNA foi extraído utilizando-se uma mistura de fenol/clorofórmio. Após centrifugação, o sobrenadante foi transferido para tubos tipo Eppendorf contendo 40m l de NaCl 20% e 1ml de etanol, incubando-se a mistura a –20oC por 18 horas. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado tratado com 20ml de dissociador da amostra (3% SDS, 12,5% Tris/HCl 0,5 M pH 6,8, 5% 2-mercaptoetanol, 0,005% azul de bromofenol, 40% glicerol), e incubado por 30 minutos a 37oC.

A eletroforese foi realizada em gel de poliacrilamida 7,5%, tampão Tris/glicina (Tris 0,025M, glicina 0,109 M pH 8,3), e uma corrente de 20 mA/placa, durante duas horas. O processo de coloração com nitrato de prata foi realizado de acordo com Herring et al. (1982).

As amostras com resultados positivos para rotavírus no EIARA e negativos no EGPA foram ultracentrifugadas a 100000g em gradiente de sacarose 40%. A partir dessas amostras extraiu-se o ácido nucléico para ser novamente analisado por EGPA. Diferenças entre o genoma dos eletroferótipos do rotavírus do grupo A foram determinadas por coeletroforese do RNA viral de fita dupla com preparações obtidas das diferentes amostras de fezes.

A possibilidade de uma associação entre a presença de rotavírus e a consistência das fezes foi avaliada pelo teste de c2 (Thrusfield, 1995).

 

RESULTADOS

No EIARA foram detectadas 11,2% (42/375) de amostras positivas para rotavírus do grupo A. Das 193 amostras de fezes de animais com diarréia com idades entre 1 e 45 dias, 15,0% (29/193) foram positivas e 7,1% (13/182) foram positivas a partir de amostras de fezes colhidas de animais sem diarréia (Tab. 1). Esses resultados foram submetidos à análise estatística, e os valores obtidos mostraram que existe associação entre a presença de rotavírus e a consistência das fezes, com c2=5,85; P<0,02, ODDS ratio de 2,3 (1,10<OD<4,85).

 

 

Pela EGPA, foram detectadas 7,2% (27/375) de amostras positivas com padrão típico de rotavírus do grupo A, sendo 10,4% (20/193) pertencentes a animais com diarréia e 3,8% (7/182) de animais sem diarréia. Das 15 amostras positivas ao EIARA e negativas à EGPA, nove tornaram-se positivas após serem ultracentrifugadas e novamente analisadas, totalizando por meio dessa última técnica 9,6% (36/375) de casos positivos. Os resultados da análise de concordância (C) entre os dois testes antes e após a ultracentrifugação foram de 96,0% e 98,4%, respectivamente (Tab. 2). Seis eletroferótipos distintos, denominados ao acaso A, B, C, D, E e F, foram identificados. Os tipos mais freqüentemente detectados foram A, C e E com 10, 9 e 4 casos, respectivamente (Tab. 3, Fig. 1).

 

 

 

 

 

 

Entre os nove rebanhos estudados, seis (RA1, RA2, RB1, RB2, RC1 e RC2) apresentaram casos positivos para rotavírus na EGPA em pelo menos um animal. Nos rebanhos RA1, RB1 e RB2, foram detectados casos positivos em animais com e sem diarréia. Em dois desses rebanhos, RA1 e RB1, animais com diarréia e com idade inferior a cinco dias apresentaram rotavírus nas fezes.

O padrão de migração eletroforético dos rotavírus identificados em cada rebanho estava restrito para aquele rebanho, com exceção do eletroferótipo C que foi identificado em bezerros dos rebanhos RB1 e RB2 distando cerca de 20km entre eles (Tab. 3). No rebanho RA1 foram identificados os eletroferótipos A e B, com predominância do eletroferótipo A, uma vez que das 13 amostras positivas, 10 foram classificadas como pertencentes a esse tipo.

No rebanho RB2 também foram identificados dois eletroferótipos, C e D, com predominância do eletroferótipo C. Nos rebanhos RB1, RC1 e RC2 um único eletroferótipo foi identificado em amostras de fezes.

A distribuição sazonal dos eletroferótipos também foi avaliada e encontra-se na Tab. 4. No ano de 1993 foram detectados no município de Taiúva os eletroferótipos A e B. No início do estudo, junho de 1993, ambos os eletroferótipos (A e B) estavam circulando em bezerros do rebanho RA1, sendo detectados em bezerros com diarréia. Posteriormente, somente observou-se a ocorrência do eletroferótipo A nos meses de setembro a novembro/93, com freqüência de nove vezes, enquanto o tipo B não foi mais observado.

 

 

O eletroferótipo C, detectado no município de Descalvado, foi identificado inicialmente em dezembro/93 em um bezerro do rebanho RB2. Esse tipo somente voltou a ser observado seis meses após (agosto/94) com freqüência de quatro vezes em bezerros dos rebanhos RB1 e RB2, época em que também se detectou no rebanho RB2 um caso do tipo D. Ambos os eletroferótipos (C e D) foram novamente detectados no rebanho RB2 em janeiro/95, com a freqüência de dois e um casos, respectivamente. No final do período de colheita, março/95, dois casos do tipo C foram detectados no rebanho RB1.

Nos rebanhos RC1 e RC2, do município de Monte Alto, foi identificado um único eletroferótipo (tipo E e F, respectivamente) em amostras de fezes de bezerros durante 1 ano e 10 meses.

Entre as nove amostras positivas detectadas na EGPA após a ultracentrifugação, nem todos os 11 segmentos foram claramente visualizados não sendo, portanto, classificados em um determinado eletroferótipo.

Foram testadas para análise de subgrupo 42 amostras de fezes positivas para rotavírus no teste de EIARA. Entre essas, 52,4% (22/42) foram caracterizadas como subgrupo I, nenhuma reagiu com MAbs de subgrupo II, e as demais (47,6%; 20/42) não reagiram com nenhum dos dois subgrupos. Entre as amostras classificadas como subgrupo I foram identificados cinco tipos eletroforéticos distintos.

 

DISCUSSÃO

No presente trabalho verificou-se que os rotavírus participam da etiologia da diarréia dos bezerros na região estudada, uma vez que dos seis municípios onde se procedeu a colheita das amostras, cinco apresentaram casos positivos. Este resultado vem ao encontro do observado por Lucchelli et al. (1992) que detectaram 16,4% de casos positivos entre bezerros de 1 a 30 dias de idade e por Brito et al. (1995) que verificaram 16,5% de amostras de fezes positivas para rotavírus em bezerros do interior do Estado de Goiás, utilizando as mesmas técnicas de diagnóstico. A correlação entre a presença de rotavírus e a consistência das fezes foi estatisticamente significante pela análise do c2 (P<0,05), indicando maior probabilidade de detectar rotavírus nos animais com fezes diarréicas. A presença de casos positivos para rotavírus em amostras obtidas de animais sem sinais clínicos de diarréia sugere a existência de animais infectados subclinicamente no rebanho, podendo viver como portadores assintomáticos e, conseqüentemente, como prováveis fontes de infecção para outros animais, como já relatado anteriormente (Fijtman et al., 1987; Lucchelli et al., 1992).

O teste de EGPA apresentou menor sensibilidade quando comparado ao EIARA. Após a ultracentrifugação, os nove casos detectados sugerem que a ultracentrifugação leva a uma concentração de vírus nas fezes, possibilitando obter partículas virais suficientes para a extração do genoma e visualização dos segmentos no gel. O índice de concordância entre as técnicas antes e após a ultracentrifugação foi satisfatório e concorda com os resultados obtidos por Cardoso et al. (1989).

A análise do genoma dos rotavírus identificados em bezerros demonstrou a ocorrência de grande diversidade genômica. De fato, de 36 amostras positivas à EGPA, seis eletroferótipos distintos foram identificados, todos com perfil longo característico de rotavírus do grupo A. Embora tenha sido detectada grande diversidade genômica entre amostras de rotavírus, um único eletroferótipo foi identificado em bezerros dos rebanhos RB1, RC1 e RC2. Esses resultados estão de acordo com trabalhos realizados na Argentina (Fijtman et al., 1987) e no Japão (Ishizaki et al., 1994) onde ocorreu ausência de diversidade genômica entre estirpes de rotavírus do grupo A, quando estudadas por períodos de seis meses a um ano. Outros trabalhos têm evidenciado variação do genoma de rotavírus durante surtos de diarréia em bovinos e em crianças, embora com maior prevalência de um dado eletroferótipo, semelhante ao observado no presente trabalho (Nakagoni et al., 1988; Theil & McCloskey, 1989). As razões para a ocorrência de eletroferótipos distintos estarem circulando em bezerros dos rebanhos RA1 e RB2 não foram determinadas, no entanto, esse fato poderia indicar a introdução de novas estirpes no rebanho, bem como o surgimento de uma estirpe variante com vantagens seletivas, ou, ainda, quando uma estirpe previamente associada com infecções assintomáticas torna-se virulenta (Snodgrass et al., 1992). Desse modo, a análise eletroforética de rotavírus em gel de poliacrilamida tem sido empregada como uma técnica importante para se poder distinguir diferenças entre amostras de campo, bem como para se obter informações sobre o significado epidemiológico da variação genômica dos rotavírus (Theil & McCloskey, 1989).

Os estudos sobre a determinação de subgrupo têm relatado a ocorrência do subgrupo I para a maioria das amostras de origem bovina (Hoshino & Kapikian, 1994). Entre as 42 amostras examinadas, 22 foram classificadas como sendo subgrupo I, embora apresentassem padrões eletroforéticos distintos. Esses resultados estão de acordo com outros autores em que a diversidade genômica não refletiu alterações na antigenicidade (Theil & McCloskey, 1989; Mendes et al., 1993). Assim, o método de eletroferotipagem, embora permita diferenciação entre as estirpes de rotavírus, não fornece dados sobre a antigenicidade das amostras. Nesse sentido serão necessários outros estudos comparativos para determinar a especificidade dos sorotipos (G e P) de rotavírus detectados na população bovina do Estado de São Paulo, caso uma estratégia de vacinação seja implementada.

 

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