Infecção experimental em cabritos pelo vírus da artrite encefalite

Caprine arthritis encephalitis virus experimental infection in new-born kids

Infecção experimental em cabritos pelo vírus da artrite encefalite

[Caprine arthritis encephalitis virus experimental infection in new-born kids]

M.I.M.C. Guedes¹, J.C.A. Souza²*, A.M.G. Gouveia³

1Doutoranda da University of Minnesota, USA

²Av. Salomão da Silveira, 329/802 – Cidade Nova

45650-000 – Ilhéus, BA

³Escola de Veterinária da UFMG

Recebido para publicação, após modificações, em 2 de outubro de 2000.

*Autor para correspondência

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Vinte e quatro caprinos de uma semana de idade, soronegativos pela imunodifusão em gel de agar para artrite encefalite caprina (AEC), foram utilizados para estudo de infecção experimental pelo vírus da AEC. Dezesseis animais foram inoculados com lentivirus caprino, amostra Cork, oito pela via intravenosa e oito por instilação nasal. Oito animais serviram como controle, inoculados pelas vias intranasal ou intravenosa com 1ml de meio de cultura de células não infectadas. Os animais foram sacrificados aos 2, 6, 12 e 20 dias pós-inoculação (PI), e colhidas amostras do sistema nervoso central, articulações, tonsilas, linfonodos, pulmões, rins, timo, baço e intestinos delgado e grosso para histopatologia e imunoistoquímica. Um animal inoculado com o vírus da AEC pela via intranasal e sacrificado aos 20 dias PI apresentou imunomarcação positiva em um macrófago alveolar. Concluiu-se que a via aerógena é uma provável rota de infecção pelo vírus da AEC.

Palavras-chaves: Caprino, artrite encefalite caprina, infecção experimental, imunoistoquímica

ABSTRACT

The caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) experimental infection was studied in 24 one-week-old seronegative kids. Sixteen kids were inoculated with CAEV-Cork, with 10⁶ TCID₅₀/ml concentration, being eight inoculated intravenously, and eight intranasally. Eight animals were used as controls, being four inoculated intravenously, and four intranasally with non-infected cell culture medium. Since the day of the inoculation, clinical evaluation was performed daily, until the day of the sacrifice. Blood samples were taken for serological tests. The animals were killed in pairs at 2, 6, 12 and 20 days post-inoculation (PI) and tissues samples of central nervous system, joints, tonsils, lymphonodes, lungs, kidneys, thymus, spleen, small and large intestine were collected for histopathological and immunohistochemical studies. One animal CAEV inoculated intranasally and killed at 20 days PI showed immunohistochemical positive reaction in an alveolar macrophage. It was concluded that transmission by air is a probable rote of CAEV infection.

Keywords: Caprine, caprine arthritis-encephalitis virus, experimental infection, immunohistochemistry

INTRODUÇÃO

A artrite-encefalite caprina (AEC) é uma enfermidade crônica, multissistêmica, causada por um retrovírus da subfamília Lentiviridae (Haase, 1986). Ela foi primeiramente descrita nos Estados Unidos da América sob a forma de leucoencefalomielite dos cabritos (Cork et al., 1974). Apesar de ser uma doença multissistêmica, a prevalência da forma nervosa é maior em caprinos jovens, enquanto a artrítica o é em adultos (Zink et al., 1990). Animais adultos também podem apresentar pneumonia e mastite (Adams et al., 1980).

A AEC tem distribuição cosmopolita e ocorre de forma endêmica, com alta prevalência em vários países com caprinocultura leiteira intensiva (Cheevers et al., 1988), tendo sido também diagnosticada no Brasil (Moojen et al., 1986; Assis & Gouveia, 1994; Castro, 1998). Apesar de já ter sido alvo de estudos experimentais (Cheevers et al., 1988; East et al., 1993), a doença ainda apresenta alguns aspectos conflitantes no que diz respeito à sua patogenia e às vias de transmissão (Adams et al., 1983; East et al., 1993; Rowe & East, 1997).

Este trabalho teve como objetivos verificar se a via aerógena pode ser uma via de infecção do vírus da AEC, identificar o antígeno viral da AEC em fragmentos de tecidos de cabritos experimentalmente infectados, utilizando-se o método imunoistoquímico da estreptavidina-biotina marcada, e estudar a patogenia do vírus da AEC após inoculação intravenosa e intranasal.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 24 cabritos de uma semana de idade, da raça Parda Alpina, 19 machos e cinco fêmeas, livres do vírus da AEC, filhos de cabras oriundas do rebanho do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa.

Antes das datas previstas para parição, 44 cabras gestantes do rebanho foram submetidas a testes sorológicos (imunodifusão em gel de ágar - IDGA), conforme descrito por Gouveia (1994), para seleção dos animais soronegativos. Para o teste de IDGA foi utilizado kit comercial (Caprine Arthritis-Encephalitis/Ovine Progressive Pneumonia Antibody Test Kit. Veterinary Diagnostic Technology, Inc. Wheat Ridge, CO 80033 USA) com antígeno homólogo. Acompanhou-se o parto de 38 cabras soronegativas para a obtenção dos animais experimentais, apartando-se os recém-nascidos imediatamente de suas mães, para impedir qualquer contato entre eles. Os cabritos recém-nascidos foram pesados e receberam brincos com numeração de acordo com a ordem de nascimento.

Até completarem uma semana de idade, 24 cabritos selecionados foram mantidos em berçário, separados dos demais. Após uma semana, eles foram agrupados aleatoriamente segundo o tratamento (via intravenosa intranasal ou controle). Em seguida foram alojados em instalações previamente limpas e desinfetadas, mantendo-se as condições necessárias de isolamento com o meio externo e entre os grupos de tratamento. Os animais foram mantidos em três baias, cada uma contendo quatro gaiolas divididas ao meio, ficando oito animais agrupados segundo o tratamento por baia. No primeiro dia de vida os cabritos receberam colostro de cabra tratado termicamente (banho-maria a 56° C por uma hora), de acordo com Adams et al. (1983). Posteriormente foram alimentados duas vezes ao dia com leite de cabra tratado como descrito acima, e água filtrada ad libitum. A partir da primeira semana tiveram acesso a feno e concentrado energético.

Os animais foram inoculados com suspensão de cultura de células sinoviais infectadas com lentivirus caprino (LVC), amostra Cork, com título infectante de cerca de 10⁶ TCID₅₀, suspensos em 1ml de meio de cultura (East et al., 1993). Oito cabritos foram inoculados pela via intravenosa, utilizando-se a veia jugular, oito foram inoculados por instilação nasal (0,5ml em cada narina) e oito animais-controle pela via intranasal ou intravenosa com 1ml de meio de cultura de células não infectadas (MEM). Com base na data de sacrifício (2, 6, 12 e 20 dias pós-inoculação), houve subdivisão em quatro grupos experimentais, constituídos de dois cabritos inoculados pela via intravenosa, dois por via intranasal e dois controles (um via intranasal e outro via intravenosa).

Imediatamente antes das inoculações e no dia do sacrifício pós-inoculação (PI), foram colhidas amostras de sangue para exame sorológico de IDGA, visando à detecção de anticorpos contra LVC. Todos os animais foram avaliados clinicamente a partir do dia da inoculação até o dia do sacrifício. Foram observados temperatura, batimentos cardíacos, auscultação pulmonar, freqüência respiratória, mucosas visíveis e linfonodos superficiais.

Aos 2, 6, 12 e 20 dias PI, dois animais de cada tratamento foram sacrificados por sangria da veia jugular, e submetidos a exame post mortem. Independente da presença ou não de lesões macroscópicas, foram colhidas amostras do sistema nervoso central (hemisférios, plexo coróide, cerebelo, medula oblonga, medula torácica, medula lombar), articulações umerorradioulnar, radiocárpica, carpometacarpiana, fêmoro-tibiopatelar, tibiotársica e tarsometatarsiana, tonsilas, linfonodos (submandibulares, cervicais superficiais, bronquiais e hepático), pulmões (lobos apicais), rins, timo, baço, intestino delgado (duodeno) e intestino grosso (cólon) para histopatologia e imunoistoquímica.

Todos os tecidos colhidos, com exceção das articulações e do sistema nervoso central (SNC), foram fixados durante 20 horas em formalina a 10% neutra e tamponada. O SNC foi pré-fixado em formalina a 20%, por seis horas e refixado por 14 horas em formalina a 10% neutra e tamponada. Secções longitudinais das articulações, com as respectivas estruturas ósseas, foram fixadas por 15 dias em formalina a 10% neutra e tamponada e descalcificadas por 20 dias em solução de ácido fórmico a 10%, tamponada com citrato de sódio para pH 4,5. Os fragmentos do SNC, das articulações e dos outros órgãos foram processados pelo método rotineiro de inclusão em parafina, cortados a cinco micrômetros de espessura e corados pela técnica da hematoxilina-eosina (HE), segundo Luna (1968) e pela estreptavidina-biotina marcada, e examinadas ao microscópio óptico.

A técnica de estreptavidina-biotina marcada foi a preconizada por Gimeno et al. (1998), utilizando como anticorpo primário anticorpo monoclonal (CAEP13B1. VMRD, Inc. Pullman, WA 99163) IgG1 contra o epítope p28 do vírus da AEC, na diluição de 1:100, cujo período de incubação foi de 18 horas a 4° C. Para evitar que houvesse descolamento dos cortes durante o processamento, as lâminas foram previamente tratadas com polímero adesivo [Silane (3-aminopropyltriethoxy-silane). Sigma Inc., A-3648]. Como controle positivo, foram utilizados cortes de pulmões e de glândula mamária de uma cabra naturalmente infectada, positiva para AEC pelo teste de ELISA. Como poderia ter havido perda antigênica durante o processamento, optou-se pelo método de recuperação antigênica desenvolvido por Gown et al. (1993), por meio da irradiação em forno de microondas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Não foram observadas alterações significativas aos exames clínico e anátomo-histopatológico.

Segundo Wilkerson et al. (1995), a infecção e/ou soropositividade não estão obrigatoriamente relacionadas com a presença de sinais clínicos, uma vez que apenas 35% dos animais infectados apresentam algum sinal clínico da AEC. Knowles (1997) relata que, apesar da soroprevalência da AEC em um rebanho poder atingir 90%, a maioria dos animais infectados não desenvolve sintomatologia clínica.

Haase (1986) e Cheevers et al. (1988) comprovaram que a maioria das lesões microscópicas da AEC são de origem imunopatológica. Como as lesões muitas vezes decorrem do depósito de complexos antígeno-anticorpo, a ausência de lesões macro e microscópicas no presente trabalho pode ter sido ocasionada pela ausência de resposta humoral nos animais, demonstrada pelo teste de IDGA negativo.

Como o período máximo entre a inoculação e o sacrifício foi de 20 dias, acredita-se que não houve tempo necessário para ocorrer a soroconversão, ou a quantidade de anticorpos ainda estava muito baixa para ser detectada pelo IDGA.

Estudos sobre a transmissão natural via colostro relatam que a imunidade ativa começa aos 84 dias de idade ou mais tarde, após o declínio inicial da imunidade passiva adquirida pelo colostro (Ellis et al., 1986). Em experimentos realizados com animais infectados pelas vias oral, intravenosa ou intrarticular com o LVC, foi observada soroconversão detectada pelo IDGA entre 3 e 12 semanas PI (Adams et al., 1980; Ellis et al., 1986; East et al., 1993), o que pode indicar diferença quanto ao tempo para ocorrência de soroconversão entre a infecção natural e a infecção experimental.

Poder-se-ia supor que a ausência de resposta humoral nos animais do presente trabalho deveu-se à utilização de dose infectante do LVC (10⁶ TCID₅₀/ml) aquém da quantidade necessária para induzir resposta imune nos animais inoculados. Entretanto, Adams et al. (1980), ao utilizar título semelhante ao do presente trabalho (10^6,2 TCID₅₀/ml), inocularam o LVC por via intravenosa e conseguiram detectar anticorpos contra o vírus utilizando a técnica de IDGA aos 21 dias PI. Já East et al. (1993), também utilizando título semelhante (10^6,3 TCID₅₀/ml), observaram que a soroconversão pós-inoculação intravenosa do LVC ocorreu quatro semanas PI. Uma das causas para a diferença entre os tempos de soroconversão encontrados nos dois trabalhos anteriores e a ausência de soroconversão até 20 dias PI no presente trabalho pode ter sido a diferença de susceptibilidade dos animais, uma variável que não pode ser contornada.

Segundo Knowles (1997), o IDGA é o método sorológico mais amplamente utilizado para detecção de anticorpos contra o LVC, e sua sensibilidade depende do antígeno usado. A utilização de antígeno(s) específico(s) do LVC confere sensibilidade 35% maior que a utilização de antígeno(s) heterólogos, como o maedi-visna (Knowles, 1997). Mesmo em testes de IDGA que utilizam antígenos específicos do vírus da AEC, há diferença na sensibilidade da técnica. Adams & Gorham (1986) relatam que a gp135 (glicoproteína de superfície) confere maior sensibilidade do que a p28 (proteína do capsídio), ambas constituintes do vírus da AEC, à técnica de IDGA. O kit de diagnóstico para IDGA utilizado no presente trabalho possuía como antígeno tanto a glicoproteína gp135 quanto a proteína estrutural p28 do LVC, logo, pode-se dizer que a sensibilidade e a especificidade da técnica foram relativamente altas.

Dos 16 animais inoculados com o vírus pelas vias intravenosa e intranasal, apenas um foi positivo à imuno-histoquímica (IHQ), sendo que a imunomarcação ocorreu no pulmão. Este animal foi inoculado com o vírus por via intranasal e sacrificado aos 20 dias PI. A imunomarcação ocorreu no citoplasma de uma única célula, localizada na luz alveolar (macrófago alveolar) (Fig. 1a). Esse achado confirma os resultados obtidos por Pereira (1995), Serakides et al. (1996) e Storset et al. (1997), os quais também obtiveram imunomarcação em macrófagos alveolares. A imunomarcação de apenas uma célula encontra paralelo em relato de Blacklaws et al. (1994), apud Storset et al., (1997), no qual em fragmentos de pulmões coletados durante surtos de maedi-visna, apenas uma ou duas células antígeno-positivas eram encontradas por cortes corados pela IHQ.

Em todas as baterias de IHQ realizadas, foram utilizadas uma lâmina controle negativo (Fig. 1b) e uma lâmina controle positivo (Fig.1c), para possível detecção de marcações inespecíficas do Ac secundário e para verificar a sensibilidade da técnica utilizada, respectivamente.

Como foi encontrada imunomarcação em um animal inoculado por via intranasal, pode-se sugerir que a via aérea é uma provável rota de infecção do LVC. Segundo relataram Rowe & East (1997), a transmissão da AEC por secreções respiratórias e por aerossol ainda não havia sido demonstrada, mas como Ellis et al. (1988) conseguiram isolar o vírus de macrófagos presentes no lavado bronquial de animais soropositivos com e sem pneumonia intersticial, pode-se inferir que a via aerógena, principalmente em situações de contato íntimo e prolongado dos animais, como acontece nas criações intensivas, pode ser uma provável via de infecção pelo LVC. Esta probabilidade já foi considerada, principalmente entre animais adultos, por Adams et al. (1983) e Rowe et al. (1991). Além disso, considerando-se as semelhanças genéticas e patogenéticas entre os vírus da AEC e da maedi-visna, o qual tem a via aerógena como uma das principais vias de infecção natural (de la Concha-Bermejillo, 1997) e experimental (Narayan & Zink, 1988), pode-se pensar que o mesmo possa ocorrer na AEC, e a imunomarcação encontrada no presente trabalho ajuda a confirmar essa hipótese.

Como o intervalo inoculação-sacrifício do presente estudo foi de no máximo 20 dias, pode-se supor que a maior parte do vírus inoculado ainda não havia completado os mecanismos de replicação viral descritos por Haase (1986) e Narayan & Zink (1988) e, conseqüentemente, ainda não havia quantidade suficiente de proteínas estruturais codificadas, para as quais os anticorpos utilizados nas técnicas de IHQ são desenvolvidos. Como o anticorpo monoclonal utilizado foi produzido contra uma proteína estrutural do vírus da AEC (p28 - proteína do capsídio do vírus), provavelmente esta foi uma das principais causas da freqüência de resultados negativos encontrados à IHQ, uma vez que, segundo Haase (1986), provavelmente a maior parte do vírus inoculado, seja por via intranasal ou intravenosa, encontrava-se integrado ao DNA genômico do hospedeiro, na forma de DNA provírus, não havendo proteínas estruturais virais codificadas em quantidade suficiente para sua detecção pela IHQ.

CONCLUSÕES

Com base nos resultados deste estudo pode-se concluir que a via aérea é uma provável rota de infecção para o vírus da artrite encefalite caprina e que IHQ não é o método de diagnóstico mais eficiente para detecção do antígeno viral da AEC em infecções recentes (até 20 dias PI).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Jun 2001
• Data do Fascículo
  Fev 2001

Histórico

• Recebido
  02 Out 2000