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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.53 no.1 Belo Horizonte Feb. 2001

https://doi.org/10.1590/S0102-09352001000100021 

Avaliação do potencial recombinogênico do antibiótico danofloxacina em células diplóides de Apergillus nidulans

(Evaluation of the recombinogenic activity of danofloxacin in diploid cells of Aspergillus nidulans)

 

A.L. Leonardo, M.A.A. Castro-Prado*

Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Estadual de Maringá
Av. Colombo, 5790
87015-900 – Maringá, PR

 

Recebido para publicação, após modificações em 10 de agosto de 2000
*Autor para correspondência
E-mail: maacprado@uem.br

 

 

RESUMO

Estudou-se o potencial recombinogênico da danofloxacina, novo antimicrobiano pertencente ao grupo das 4-fluoroquinolonas e de uso exclusivo em medicina veterinária, no fungo filamentoso Aspergillus nidulans. A linhagem mestra UT196 e o mutante Z1 foram utilizados para formar o diplóide Z1//UT196. Conídios desse diplóide foram inoculados em placas de Petri contendo meio mínimo suplementado com 2,5, 5,0 e 10,0 mg/ml de danofloxacina. As placas foram incubadas por cinco dias a 37 ºC. Segregantes mitóticos foram isolados das colônias tratadas com o antimicrobiano e as análises de seus fenótipos evidenciaram o efeito recombinogênico da danofloxacin na dose de 10,0 mg/ml. Recombinantes para vários intervalos dos cromossomos I e II foram identificados entre os segregantes analisados.

Palavras-chave: Aspergillus nidulans, recombinação somática, danofloxacina

 

ABSTRACT

The aim of this work was to demonstrate the recombinogenic effect of danofloxacin, a new 4-fluoroquinolone antimicrobial used only in veterinary medicine, in the filamentous fungi Aspergillus nidulans. The UT196 master strain and the Z1 mutant were used to produce the Z1//UT196 diploid strain. Conidia of this diploid strain were inoculated in Petri dishes containing selective medium supplemented with 2.5, 5.0 or 10.0 mg/ml danofloxacin. The plates were incubated for five days at 37 ºC. Mitotic segregants were isolated from the diploid colonies and phenotypes of the segregants were analyzed. Inoculation of 10.0 mg/ml danofloxacin was shown to be positive in inducing somatic crossing-over in diploid cells of A. nidulans. An increase in the mitotic recombination frequencies was observed in several linkage-intervals of chromosomes I and II from Z1//UT196 diploid strain.

Keywords: Aspergillus nidulans, danofloxacin, somatic crossing-over

 

 

INTRODUÇÃO

Danofloxacina é a mais nova fluoroquinolona lançada no mercado para uso exclusivo em terapêutica veterinária (Giles et al., 1991). É um antimicrobiano sintético, altamente solúvel em água, com potente atividade in vitro contra um amplo espectro de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, patógenos de bovinos e suínos (Neu, 1987; Cruz et al., 1998).

As fluoroquinolonas inibem especificamente a subunidade A da enzima procariótica DNA-girase. Essa enzima atua durante os processos de replicação e transcrição do DNA bacteriano, promovendo um superespiralamento negativo no DNA. As fluoroquinolonas inibem portanto a super-helicoidização do DNA mediada pela girase em concentrações (0,1 a 10,0 mg/ml) capazes de inibir o crescimento bacteriano (McGuirk et al., 1989; Searle, 1990; Giles et al., 1991; Doenças..., 1991).

As células eucarióticas não contêm DNA-girase, porém possuem DNA-topoisomerase tipo II conceitual que remove mecanicamente superespirais positivas do DNA eucariótico a fim de evitar seu entrelaçamento durante a replicação. As quinolonas só inibem a topoisomerase tipo II de células eucarióticas em concentrações muito elevadas (100 a 1000 mg/ml) (Mandel & Petri, 1996).

Agentes alquilantes e outros inibidores da síntese de DNA, tais como 5-fluorodeoxiuridina, mitomicina C, bleomicina e 5-azacitidina, foram caracterizados como indutores de crossing-over mitótico (Esposito & Holliday, 1964; Holliday, 1964; Yost et al., 1967; Demopoulos et al., 1982; Franzoni & Castro-Prado, 2000).

O crossing-over mitótico foi descrito inicialmente em Drosophila melanogaster (Stern, 1936) e posteriormente observado em vários outros organismos, tais como Aspergillus nidulans, Schizophyllum commune, Saccharomyces cerevisiae, sendo atualmente considerado um processo de ampla atuação em células diplóides (Ellingboe, 1964; Kafer, 1977; Kunz & Haynes, 1981; Stanbridge, 1990).

A segregação das cromátides irmãs durante a mitose consiste numa etapa vital do processo de divisão celular, quando cada célula filha deve receber uma cópia de cada cromátide. Acredita-se que a orientação de cada par de cromátides irmãs na placa mitótica seja um processo independente do par homólogo. Nesse momento, entretanto, cromátides homólogas podem estabelecer contato uma com a outra, ou mesmo quebras cromossômicas podem ocorrer, desencadeando o processo de permuta mitótica (Beumer et al., 1998). Esse processo de trocas permitirá a expressão de genes recessivos, previamente mascarados pela presença do alelo dominante (Zimmermann, 1992).

A homozigose de genes recessivos induzida pelo crossing-over mitótico pode ter efeitos carcinogênicos (Kinsela & Radman, 1978). A tumorigênese depende de três importantes etapas: iniciação, promoção e progressão, durante as quais alterações genéticas sucessivas ocorrem, resultando na formação da massa tumoral (Peto et al., 1975). Células iniciadas podem ser aquelas portadoras de mutações autossômicas recessivas, as quais podem vir a se expressar pela homozigose induzida pelo crossing-over mitótico que, nesse caso, seria o agente promotor (Lankas et al., 1977). O estudo de substâncias químicas com potencial recombinogênico assume, portanto, importância crucial no sentido de se detectar substâncias que eventualmente possam atuar como promotoras de neoplasias.

Considerando o efeito inibitório de danofloxacina sobre a síntese de DNA e o fato de que seu potencial recombinogênico não foi ainda avaliado em sistemas biológicos, o presente trabalho foi proposto para determinar o efeito de diferentes concentrações dessa droga sobre o crossing-over mitótico em uma linhagem diplóide de Aspergillus nidulans.

 

MATERIAL E MÉTODOS

A linhagem mestra UT196, proveniente dos estoques de Utrecht (Holanda) e o mutante Z1 foram utilizados para formar o diplóide Z1//UT196. O mutante Z1 foi obtido com o agente alquilante N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), sendo portador da duplicação Dp(II,I) (Castro-Prado & Zucchi, 1991; Meilus & Castro-Prado, 1998). Os marcadores genéticos das linhagens utilizadas são: a) UT 196: yA1 (cromossomo I), conídio amarelo; methA17 (cromossomo II); pyroA4 (cromossomo IV), com requisitos para metionina e piridoxina, respectivamente; b) Z1: wA2 (cromossomo II) conídio branco; riboA1, pabaA124, biA1 (cromossomo I), com requisitos para riboflavina, ácido paraminobenzóico e biotina, respectivamente; AcrA1 (cromossomo II), resistência à acriflavina; Dp (II,I), segmento duplicado transposto para o cromossomo I, incluindo os marcadores AcrA1, wA2 e meth+.

Os meios de cultura utilizados foram: meio mínimo (MM), Czapek-Dox preparado com 1,0% de glicose e meio completo (MC) contendo extrato de levedura, casaminoácido, ácidos nucléicos e solução de vitaminas (Pontecorvo et al., 1953; Van de Vate & Jansen, 1978). O meio sólido foi preparado com 1,5% de ágar.

As técnicas gerais de análise genética utilizadas foram aquelas descritas em Pontecorvo et al. (1953) e Van de Vate & Jansen (1978). Os heterocários, para a obtenção da linhagem diplóide, foram preparados em MM + 2% de MC, suprimindo-se o ágar (Roper, 1952). A incubação foi a 37ºC por cinco dias. A toxicidade das doses de danofloxacina utilizadas foi avaliada por meio do crescimento do diplóide em presença do antimicrobiano. Conídios do diplóide Z1//UT196 foram inoculados no centro de placas de Petri contendo MC (controle) e MC + danofloxacina (2,5, 5,0 e 10,0 mg/ml). Para cada dose de danofloxacina, bem como para o controle, foram inoculados um total de seis placas, as quais foram incubadas a 37ºC. Os diâmetros das colônias foram medidos com régua, uma vez ao dia, durante cinco dias. As médias foram comparadas usando-se o teste t de Student (P < 0.05).

A análise do potencial recombinogênico de danofloxacina foi realizada conforme descrito por Franzoni & Castro-Prado (2000). O antimicrobiano danofloxacina (gentilmente cedido pela Pfizer do Brasil) foi adicionado ao meio completo estéril na temperatura de 45ºC, nas seguintes concentrações: 2,5, 5,0 e 10,0 mg/ml. Conídios do diplóide Z1//UT196 foram inoculados nas placas de Petri contendo MC+danofloxacina. As placas foram incubadas a 37ºC durante seis dias.

Cada tratamento produziu setores visíveis nas colónias dos diplóides, os quais foram identificados por suas morfologia e coloração de conídios distintas do diplóide original. Esses setores constituem segregantes mitóticos diplóides, aneuplóides ou haplóides. Após purificação em MC, esses segregantes foram submetidos ao processo de "haploidização" espontânea em meio completo. Os segregantes que cresceram de maneira estável, sem a produção de novos setores mitóticos, foram considerados como haplóides, sendo então selecionados.

Para análise do crossing-over mitótico, conídios de cada setor haplóide foram individualmente transferidos para 25 posições definidas (modelo 5 ´ 5) de placas de Petri contendo meio completo e determinados os seus requisitos nutricionais.

A freqüência de recombinação mitótica entre dois marcadores ligados foi determinada em porcentagem: FR = nº total de recombinantes ´ 100 ¸ nº total de segregantes mitóticos.

Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando-se a tabela de contingência 2 ´ 2 (Yates corrected l2) para P< 0,05.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O crescimento miceliano do diplóide Z1//UT196 em meios contendo danofloxacina nas concentrações de 2,5, 5,0 e 10,0 mg/ml pareceu normal quando comparado com o crescimento dessa linhagem na ausência do antimicrobiano (Fig. 1). Esses resultados indicam que as doses de danofloxacina utilizadas no presente trabalho não apresentam toxicidade para células do diplóide Z1//UT196.

 

 

O crossing-over mitótico foi estudado a partir da análise fenotípica dos segregantes haplóides selecionados das colônias cultivadas em presença de 2,5, 5,0 e 10,0 mg/ml de danofloxacina. A baixa freqüência espontânea de recombinação mitótica observada (controle) foi compatível com as observações de Kafer (1961) de que embora o crossing-over mitótico ocorra espontaneamente em A. nidulans, sua freqüência é várias vezes inferior à freqüência de crossing-over meiótico (Tab. 1 e 2). Em presença de danofloxacina, entretanto, foi possível observar alterações na freqüência de recombinação. As doses de 2,5 e 5,0 mg/ml de danofloxacina não demonstraram efeito recombinogênico, tanto para os marcadores do cromossomo I quanto para os marcadores do cromossomo II, entretanto, a dose de 10,0 mg/ml de danofloxacina promoveu significativo aumento nas freqüências de crossing-over mitótico (Tab. 1 e 2).

 

 

 

Conforme pode ser observado na Tab. 3, o gene methA apresentou segregação de aproximadamente 3 meth+ : 1 meth para os segregantes obtidos tanto em presença quanto em ausência de danofloxacina. Esses resultados podem ser explicados pela presença da duplicação Dp (II,I) no genoma do mutante Z1. Essa duplicação inclui os genes Acr, w e meth+, sendo o mutante Z1 parcialmente diplóide para esses genes. Dessa forma, a segregação observada para o gene methA foi exatamente a esperada (Fig. 2).

 

 

 

Os resultados mostrados na Tab. 3 indicam também uma forte pressão seletiva contra o cromossomo I do mutante Z1, provavelmente relacionada com a presença da duplicação Dp (II,I). Nenhuma pressão seletiva foi observada para os marcadores do cromossomo II do mutante Z1.

Deve-se considerar, ainda, que a duplicação Dp (II,I) altera a segregação do marcador methA17 em função do gene meth+ estar contido no segmento duplicado (cromossomo I). Dessa forma, o elevado número de recombinantes w+,meth+ observado no tratamento justifica-se pelo fato de que alguns dos segregantes w+,meth (paternais) podem estar fenotipicamente mascarados pela presença do gene meth+ presente no cromossomo I (segmento duplicado) (Tab. 4).

 

 

Embora a inibição da topoisomerase tipo II de eucariotos requeira altas doses de danofloxacina (Mandell & Petri, 1996), este estudo demonstra que 10,0 mg/ml desse antimicrobiano são suficientes para induzir crossing-over mitótico em células diplóides de A. nidulans.

Considerando-se que a recombinação mitótica ocupa posição de destaque no processo de carcinogênese, agindo como um evento promotor e reduzindo a heterozigosidade constitucional de genes supressores de tumor (Cavenne et al., 1983; Weinberg, 1991), este estudo sugere que a administração de danofloxacina em eucariotos pode induzir homozigose de genes recessivos, mediante segregação mitótica aberrante.

 

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