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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.53 no.2 Belo Horizonte Apr. 2001

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352001000200002 

a02v53n2

Afinidades antigênicas de amostras de campo do vírus da bronquite infecciosa das galinhas com a amostra Massachusetts M41

[Antigenic affinities of infectious bronchitis virus field isolates to Massachusetts M41 strain]

 

M.B. Souza, N.R.S. Martins*, J.S. Resende

Escola de Veterinária da UFMG
Caixa Postal 567
30123-970 - Belo Horizonte, MG

 

Recebido para publicação, após modificações, em 21 de novembro de 2000.
E-mail: Rodrigo@vet.ufmg.br

 

 

RESUMO

Com o objetivo de avaliar as afinidades antigênicas entre 14 amostras de vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG) isoladas de casos clínicos ocorridos entre 1972 e 1989 no Estado de Minas Gerais, sua reatividade frente a dois anticorpos monoclonais (AcMs) específicos contra a glicoproteína S1 do sorotipo Massachusetts de VBIG foi examinada em ELISA. As 14 amostras de campo estudadas foram agrupadas, de acordo com o relacionamento antigênico aos AcMs, em relacionadas (três amostras) e não relacionadas (onze amostras) à amostra M41 do sorotipo Massachusetts. As amostras de campo não reconhecidas, considerando a alta especificidade dos AcMs à amostra M41, compõem uma diversidade que pode variar de integrantes do sorotipo Massachusetts de origem vacinal a sorotipos heterólogos. Amostras com afinidade antigênica à M41 (208-1972, PM1-1987 e PM2-1987) foram detectadas, o que configura a preservação da amostra no campo, apesar da alta variabilidade da glicoproteína S1, já que foram isoladas de surtos de doença natural nas regiões de avicultura de Minas Gerais. A detecção de antígenos de alta variabilidade que caracterizam a amostra M41, apesar das pressões da imunidade dos plantéis e da mutabilidade, pode indicar que os antígenos de alta afinidade aos receptores celulares (best fit) que atingiram alto estágio evolutivo podem estar sendo preservados.

Palavras-Chaves: Galinha, vírus da bronquite infecciosa, M41, isolado de campo, ELISA

 

ABSTRACT

Aiming to the evaluation of antigenic relationships among isolates of infectious bronchitis virus (IBV) through their reactivity against Massachusetts M41 S1 glycopolypeptide specific monoclonal antibodies (Mab) an ELISA was developed. Fourteen IBV isolates obtained from field cases of disease, reported from 1972 to 1989 in Minas Gerais, Brazil, were examined. The IBV isolates could be grouped into related or not to M41, based on the reactivity to M41 S1 specific Mabs. The unrecognized field isolates conform a diversity of representatives, which may range from Massachusetts vaccine strains to unrelated heterologous IBV serotypes. The detection of three M41-related isolates (208-1972, PM1-1987 and PM2-1987) indicate that, despite the high variability and pressure for changes in the S1 protein, M41 clones are still present in the field and may point out that the survival strategies for isolates should include mechanisms that preserve the best fits for cellular receptors.

Keywords: Chicken, infectious bronchitis virus (IBV), M41, field isolate, ELISA, Brazil

 

 

INTRODUÇÃO

A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença viral, aguda e altamente contagiosa que acomete aves da espécie Gallus gallus domesticus, de todas as idades, ocasionando grandes perdas econômicas devido à mortalidade, mal desenvolvimento dos lotes, queda na produção e na qualidade de ovos (King & Cavanagh, 1991).

A literatura descreve a ocorrência de casos de BIG em todas as regiões onde há avicultura industrial. A doença é causada por um vírus (Coronavírus) RNA de fita simples e envelopado. O isolamento de VBIG e a sorotipagem das amostras têm permitido a diferenciação de vários sorotipos (Cook, 1997).

As diferenças entre sorotipos de VBIG devem-se a variações na seqüência de aminoácidos de duas regiões da subunidade S1 do envelope, chamadas regiões hipervariáveis. Entretanto, pouca variação foi detectada na seqüência de aminoácidos da subunidade S2. Desse modo, diferenças sutis na composição de nucleotídeos do gene correspondente a S1, podem dar origem a novos sorotipos. Essas partículas virais com estrutura S1 diferente terão vantagem seletiva e serão mais capazes de infectar galinhas que já tenham sido expostas a outros sorotipos de VBIG (Koch et al., 1991; Cook, 1997).

No Brasil, alguns trabalhos publicados isoladamente não chegaram a concluir sobre a magnitude das variações antigênicas existentes em nossos plantéis. Estudos epidemiológicos continuam sendo necessários para se conhecer mais sobre as características antigênicas dos VBIG que acometem os plantéis brasileiros. Wentz (1992) e Di Fábio (1993) relataram a ocorrência da doença em aves vacinadas com o sorotipo Massachusetts, indicando a possibilidade da existência regional de outros sorotipos ou amostras variantes. Tais ocorrências reforçaram a necessidade de se conhecer mais sobre as amostras de VBIG existentes no país.

A diferenciação entre amostras de VBIG pode ser determinada por vários testes, entre eles o ELISA, com anticorpos monoclonais (AcMs). AcMs específicos contra a subunidade S1 da glicoproteína S do envelope viral representam ferramentas de alta especificidade no estudo de amostras de VBIG. Esses AcMs podem detectar diferenças na região responsável pela tipificação de VBIG, ainda que em amostras de um mesmo sorotipo.

Neste trabalho desenvolveu-se um ELISA utilizando AcMs direcionados contra S1 de M41, com o objetivo de examinar amostras de VBIG de campo isoladas em Minas Gerais.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram estudadas 14 amostras de vírus isoladas de surtos de BIG ocorridos em granjas do Estado de Minas Gerais, no período de 1972 a 1989. Os principais sinais clínicos relatados foram síndrome nefrite-nefrose, problemas respiratórios e queda de postura. As amostras isoladas, identificadas como T2, G, 29-78, 200, 297, 283, 290, 327, 351, PM-1, PM-2, PM-3, PM-4 e 208-10, foram todas cedidas pelo Prof. José Sérgio de Resende, do Setor de Doenças das Aves, Escola de Veterinária da UFMG, exceto 208-10, cedida pelo Prof. Maurício Resende, do Setor de Virologia Comparada, Dep. de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas da UFMG.

Originalmente estas amostras foram obtidas após o isolamento viral em OEG/SPF, segundo a técnica descrita por Villegas (1985).

A amostra de referência do sorotipo Massachusetts (amostra M41) foi utilizada como controle homólogo frente aos AcMs. Foram também incluídas no teste as amostras de VBIG JMK, Arkansas-99, A-5968 e SE-17, respectivamente dos sorotipos Delaware, Connecticut, Connecticut e Georgia, oriundas da American Type Culture Collection (ATCC, EUA) e SPAFAS (EUA). Para utilização no teste, todas as amostras foram multiplicadas em OEG/SPF, sofrendo tratamento idêntico às amostras de campo.

Controles foram incluídos em todos os ELISAs e em cada microplaca. Todos os controles foram preparados e processados de forma idêntica aos VBIG estudados. Como controle de antígeno negativo, foi utilizada a amostra La Sota do vírus da doença de Newcastle. Como controle de VBIG sorotipo heterólogo à especificidade dos AcMs, foi utilizada a amostra A5968 do sorotipo Connecticut.

Os hibridomas secretores de AcMs (produzidos em camundongos da linhagem Balb/C) foram gentilmente cedidos pelo Dr. David Cavanagh, Institute for Animal Health, Compton, Inglaterra. Eles provieram de duas linhagens denominadas A13 e A38 (Mockett et al., 1984). Os AcMs A13 e A38 são direcionados para reagirem com o VBIG, sorotipo Massachusetts (amostra M41), especificamente contra uma parte exclusiva da subunidade S1 do glicopolipeptídeo S.

A concentração dos antígenos virais foi determinada pela quantificação da proteína mínima necessária para realização dos testes, assegurando sensibilidade e especificidade altas, pelo método de Lowry et al. (1951).

Para a avaliação da concentração de antígeno a ser utilizado, incluindo todos os antígenos de VBIG e VDN, foram usadas concentrações de 50, 100, 200, 500 e 1000mg de proteína bruta de antígeno viral por ml.

Os AcMs A13 e A38 foram misturados na proporção de 1:1 (conforme sugestão do autor), e esta, diluída em PBS, pH 7,4, contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) a 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000 e testada frente às diferentes concentrações virais, em quatro repetições.

A técnica utilizada foi a descrita por Jagoda et al. (1991), com modificações. Foram usadas microplacas para ELISA com 96 orifícios (Corning, EUA). Os orifícios das bordas das placas não foram utilizados para evitar possíveis reações inespecíficas, sendo então realizados apenas 60 testes por placas (Venkatesan & Wakelin, 1993). Para todas as etapas do teste, volumes de 100ml foram utilizados. Os tampões foram preparados conforme Hudson e Hay (1989). Entre cada etapa as placas foram submetidas a quatro lavagens em PBST, pH 7,4.

As placas foram sensibilizadas com Ag viral (amostras de campo e controles positivos e negativos) diluído em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 na concentração de 200mg de proteína/ml. Nessa etapa foram deixadas por 18 a 24 horas em câmara úmida a 4ºC. Os AcMs A13 e A38 (misturados na proporção de 1:1) foram diluídos a 1:100 em PBST pH 7,4, adicionados a todos os orifícios e deixados para reagir a 37ºC por 60 minutos em câmara úmida. Os Acs de cabra (IgG) anti-IgG de camundongo conjugados à fosfatase alcalina (Sigma, EUA) foram colocados em todos os orifícios na diluição recomendada pelo fabricante e deixados em câmara úmida a 37ºC por 30 minutos. O substrato p-nitrofenil fosfato (pNPP) foi diluído a 1 mg/ml em tampão dietanolamina e cloreto de magnésio (MgCl2) pH 8,6, sendo distribuído a todos os orifícios. As placas foram mantidas a 37ºC até o aparecimento de cor. A reação foi paralisada pela adição de 100ml de NaOH 3M, quando os controles positivos atingiram coloração detectável a olho nu e nenhuma alteração de cor foi observada no controle negativo (amostra La Sota). Em seguida as microplacas foram levadas à leitura.

A leitura da reação em densidade ótica (DO) foi feita em leitor de ELISA (EIA Microplate Reader-Sigma, EUA), com filtro de comprimento de onda 405nm sem filtro diferencial e utilizando-se o recurso do aparelho para determinação do ponto de corte (offset) para a leitura de todas as microplacas.

Após a padronização e validação do ELISA, foram realizados os testes com as amostras de campo e calculadas as médias dos valores de absorvância para cada amostra. As amostras, que apresentaram DOs superiores à média de DO da amostra negativa La Sota do VDN acrescida de três desvios-padrão, foram consideradas homólogas (positivas) à amostra M41 do sorotipo Massachusetts. As amostras com valores de DOs iguais ou inferiores à média de DO da amostra negativa acrescida de três desvios-padrão, foram consideradas heterólogas (negativas) à amostra M41 do sorotipo Massachusetts.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A diferença entre as amostras de VBIG homólogas e heterólogas aos AcMs A13 e A38 acentuou-se com o aumento da concentração protéica viral e com a maior concentração de AcMs. Os valores em DO obtidos com a utilização de Ags contendo 1000 e 50mg de proteína por ml diferiram significativamente, sendo duas vezes maiores para 1000mg que os obtidos ao se usar 50mg de proteína total por ml. Entretanto, esta diferença não foi significativa para as concentrações de 100, 200 e 500mg, mesmo quando foram aumentadas as concentrações de AcMs. Assim, para melhor aproveitamento dos Ags e mantendo-se a alta especificidade e sensibilidade do teste, foram utilizadas 200mg de proteína total de Ag por ml, para cada uma das amostras. A padronização das concentrações permitiu a comparação dos resultados entre os diferentes antígenos virais.

Os AcMs diluídos até 1:100 possibilitaram um bom valor discriminante entre as amostras homólogas e heterólogas e maior economia dos reagentes. Na diluição 1:10 esse valor foi pouco superior, não justificando a utilização de concentrações dos AcMs maiores que na diluição 1:100.

As leituras de DOs relativas às amostras de VBIGs de referência dos sorotipos homólogo e heterólogo aos AcMs foram utilizadas como referência basal para discriminar os valores de homologia ou heterologia. As DOs usadas nas comparações foram obtidas da média de seis repetições por ensaio, em seis ensaios, somando 36 repetições. Para interpretação dos resultados, a DO média do controle negativo (amostra La Sota do VDN), acrescida de três desvios-padrão, foi adotada como base de discriminação acima da qual a reação foi considerada positiva (homóloga). Os resultados apresentados na Tab. 1.

 

 

O maior valor médio em DO foi obtido para a amostra M41, protótipo do sorotipo Massachusetts, para a qual os AcMs são direcionados, quando comparados com os valores obtidos com as amostras A5968 (protótipo do sorotipo Connecticut) e com a amostra La Sota (do VDN) usada como controle negativo. Os resultados estão em concordância com a literatura, que descreve a especificidade dos AcMs A13 e A38 para a amostra M41 (Mockett et al., 1984), e estão apresentados na Tab. 2.

 

 

Os resultados das amostras de VBIG utilizadas como referência de sorotipos heterólogos A-5968, Arkansas, JMK e SE-17, comparadas com a amostra M41 no ELISA, estão apresentados na Tab. 3. Essas amostras não possuem afinidade antigênica com a amostra M41 do sorotipo Massachusetts. Esses resultados estão de acordo com a literatura sobre os AcMs (Mockett et al., 1984), pois as amostras são integrantes dos sorotipos Connecticut, Connecticut, Delaware e Georgia, respectivamente, de acordo com a classificação de Hopkins (1974).

 

 

Para as amostras de campo 208, PM-1 e PM-2, observaram-se valores em DO similares aos encontrados para a amostra M41, o que permite concluir que essas amostras possuem identidade antigênica com a amostra M41 do sorotipo Massachusetts. Os resultados são apresentados na Tab. 4.

 

 

As amostras de campo 297, 283, PM-3, 319, G, 327, 200, T2, 351, 29-78, PM-4, não foram reconhecidas pelos AcMs anti-M41, apresentando valores em DO semelhantes aos observados para a amostra La Sota (VDN), utilizada como controle negativo. Não se identificam, portanto, com a amostra M41 do sorotipo Massachusetts (Tab. 5).

 

 

As amostras vacinais H52 e H120 classificadas, de acordo com a literatura, no sorotipo Massachusetts pelo teste de soroneutralização (King & Cavanagh, 1991), não foram detectadas pelos AcMs contra M41, indicando diferenciação antigênica em S1, glicoproteína para qual a especificidade dos AcMs é dirigida. A mínima variação detectável pelos AcMs, mas não detectável pelos métodos convencionais como inibição da hemaglutinação e soroneutralização com anticorpos policlonais, indica que a variação antigênica e a direção da especificidade situa-se em região hipervariável de S1 (Koch et al., 1991). O resultado pode permitir especular que essas amostras vacinais não tenham induzido, na prática, uma boa imunização contra algumas amostras de VBIG de campo, ainda que do mesmo sorotipo. Algumas das amostras de campo provavelmente são oriundas de variantes surgidas a partir de amostras vacinais, H120 e H52, e poderiam estar antigenicamente mais próximas destas do que da M41, especificamente da região hipervariável da glicoproteína S1 do VBIG.

Mockett et al. (1984), ao produzirem os hibridomas secretores dos AcMs (A13 e A38) usados neste experimento, verificaram que os mesmos reagiam apenas com a amostra M41 do sorotipo Massachusetts, em teste de soroneutralização, quando comparados com outras 13 amostras classificadas no sorotipo Massachusetts, incluindo as amostras H52 e H120 (Tab. 6).

 

 

CONCLUSÕES

O ELISA foi eficiente para identificar afinidades antigênicas entre três amostras de VBIG de campo com a amostra M41 permitindo ainda, a observação de diferenças dentro do sorotipo Massachusetts, não havendo qualquer reação inespecífica.

A detecção de amostras antigenicamente relacionadas à amostra M41 pode suscitar a hipótese de que o mecanismo de preservação desse padrão antigênico mantém alguma correlação com best fit de modelação molecular de S1 e o respectivo receptor celular. Amostras de VBIG evolutivamente mais adaptadas, por exemplo M41, podem apresentar vantagem evolutiva que está sendo preservada apesar do longo período desde a sua descrição.

Algumas das amostras de VBIG estudadas não foram reconhecidas pelos AcMs A13 + A38, permitindo concluir que são antigenicamente diferentes da amostra M41 do sorotipo Massachusetts.

 

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