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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.53 no.3 Belo Horizonte June 2001

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352001000300016 

a16v53n3

Qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães. I – Efeito do meio diluidor

[Spermatozoa quality of cryopreserved canine semen. I-Use of extenders]

 

R. Bueno1, E.P. Costa2, J.D. Guimarães2, F.M. Valentim3

1Curso de Veterinária da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais
32630–000-Betim, MG

2
Departamento de Veterinária da UFV

3
Estudante de Veterinária da UFV

 

Recebido para publicação, após modificações, em 2 de abril de 2001.
E-mail: buenore@aol.com 

 

 

RESUMO

Estudou-se o efeito de dois meios diluidores, Tris-citrato-gema de ovo e Tes-Tris, sobre a qualidade espermática in vitro após criopreservação do sêmen de cães. Utilizaram-se três machos e realizaram-se cinco coletas em cada um deles. Foram avaliadas a motilidade, o vigor espermático, a integridade da membrana plasmática (teste hiposmótico), a integridade do acrossoma e a longevidade espermática (teste de termo-resistência). O meio diluidor Tris-citrato-gema de ovo foi superior (P<0,05) ao meio Tes-Tris por ter apresentado valores em torno de 15% mais altos após a congelação/descongelação do sêmen nos testes de termo-resistência e hiposmótico e nas avaliações da integridade do acrossoma, da motilidade e do vigor espermático.

Palavras-chave: Cão, sêmen, diluidor, criopreservação

 

ABSTRACT

A study on two extenders on canine semen was performed, in order to evaluate their effects on in vitro characteristics of cryopreserved spermatozoa. The extenders studied were Tris-citrate and Tes-Tris. Semen from three stud dogs was collected weekly during five weeks for the experiment protocol. Semen samples were examined for sperm motility and forward progression, and plasmatic membrane and acrosome integrity using the hypo-osmotic swelling test and phase contrast microscopy, respectively, and semen longevity using the thermo-resistance test. A comparative analysis between the extenders has showed that Tris-citrate was superior (P<0.05) as compared to Tes-Tris based on the results of the hyposmotic swelling test, thermo-resistance test, sperm motility, forward progression and achrossome integrity after cryopreservation, all values 15% higher for the Tris-citrate.

Keywords: Dog, semen, extender, cryopreservation

 

 

INTRODUÇÃO

A diluição do sêmen é essencial para o sucesso da técnica de criopreservação, pois os componentes dos meios diluidores fornecem condições para a sobrevivência do espermatozóide, auxiliando na preservação da integridade da membrana plasmática, que pode sofrer alterações devido à mudanças de temperatura. O diluidor contém fontes energéticas para o espermatozóide, estabiliza o pH do meio (Linde-Forsberg, 1991; England, 1993) e deve prevenir alterações acrossômicas, preservando uma das habilidades do espermatozóide que é a reação acrossômica (Sirivaidyanpong et al., 2000).

Segundo Silva & Verstegen (1995), o meio diluidor constitui um dos fatores críticos para a congelação de sêmen. Diferentes meios diluidores têm sido testados e utilizados, mas o ideal para a espécie canina ainda não foi definido. Os meios diluidores utilizados nos primeiros relatos de prenhez com sêmen congelado foram à base de lactose (Seager, 1969) e Tris-citrato-gema de ovo (Andersen, 1972). Entre os meios diluidores mais recentemente utilizados está o Tris-citrato-gema de ovo, com variações quanto aos açúcares e quanto à concentração de glicerol (Rota et al., 1998; Oliveira et al., 1999).

Silva & Verstegen (1995) estudaram a utilização do meio diluidor Tes-Tris, com 4% de glicerol, para a criopreservação do sêmen canino e Jedrzejzak et al. (1996) utilizaram esse mesmo diluidor, com algumas modificações para o processamento do sêmen criopreservado na espécie humana. Ambos relataram bons resultados nas características físicas do sêmen e na utilização desse material em técnicas de fecundação in vitro (FIV).

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar os efeitos dos meios diluidores Tes-Tris e Tris-citrato-gema de ovo, ambos com 4% de glicerol e utilizados para a criopreservação, sobre a qualidade espermática in vitro do sêmen de cães.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados três cães adultos, clinicamente sadios, da raça Labrador do Retriever. Os cães foram submetidos a espermiogramas prévios e estavam dentro do padrão considerado normal para a espécie (Feldman & Nelson, 1996). A coleta de sêmen foi realizada semanalmente pelo método de manipulação digital, durante cinco semanas, segundo Linde-Forsberg & Forsberg (1989), totalizando 15 coletas. Imediatamente após a coleta foram registrados o volume, a concentração, a motilidade e o vigor espermáticos. A mensuração da concentração espermática e o número total de espermatozóides no ejaculado foram realizados segundo Feldman & Nelson (1996).

As observações da motilidade progressiva e da intensidade do movimento dos espermatozóides foram realizadas segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA, 1998).

Após a avaliação, o sêmen foi dividido em duas frações iguais e cada uma delas diluída em um dos meio diluidores, Tris-citrato-gema de ovo modificado (Rota et al., 1995) e Tes-Tris modificado (Silva & Verstegen, 1995), ambos qsp e acrescidos de 1 mg/l de estreptomicina e 4% de glicerol.

O sêmen foi pré-diluido na proporção de um volume de sêmen para um volume de diluidor. Após a pré-diluição foi centrifugado por seis minutos a 700g, para retirada do líquido seminal e padronização das amostras. Após a centrifugação e retirada do líquido sobrenadante, as amostras de sêmen foram rediluídas; o volume do diluidor acrescentado foi suficiente para o ajuste da concentração total de espermatozóides de 100 milhões por ml.

O sêmen foi envasado em palhetas de plástico de 0,5ml, previamente identificadas e mantidas aquecidas. Todo o processamento inicial do sêmen gastou no máximo 30 minutos até ser submetido ao resfriamento.

Para o resfriamento, as palhetas ficaram em um frasco de vidro, que foi colocado em um recipiente de plástico contendo água a 37° C para que o sêmen permanecesse incubado. Ambos os recipientes foram, então, acondicionados dentro de uma caixa de isopor com gelo e água, em um volume suficiente para se alcançar, de modo aproximado, uma curva de resfriamento de –0,45° C/min durante 60 minutos, até atingir 4° C, temperatura na qual o material permaneceu por mais 60 minutos, em equilíbrio.

A congelação foi realizada em vapor de nitrogênio líquido. O sêmen foi pré-congelado durante 15 minutos e após, mergulhado no nitrogênio para a congelação. A seguir as palhetas foram acondicionadas em um botijão até o momento de sua utilização. A descongelação foi realizada em banho-maria a 37° C, por 50 segundos.

As amostras do sêmen foram avaliadas após a coleta, a pré-diluição, o período de resfriamento e equilíbrio e a congelação/descongelação. A integridade da membrana plasmática foi avaliada em todas as etapas descritas por meio do teste hiposmótico (HOS-T), segundo Kumi-Diaka (1993). A condição de acrossoma foi avaliada segundo Mies Filho (1982). A classificação do espermatozóide baseou-se na integridade do acrossoma, isto é, segundo o tipo de alteração, que incluiu desde edema e desprendimento até ausência de acrossoma. O resultado foi obtido em porcentagem de acrossomas íntegros. A longevidade do espermatozóide foi avaliada de acordo com o teste de termo-resistência modificado (TTR), segundo Dimitropoulos (1967).

As variáveis foram submetidas à análise de variância. As análises que apresentaram significância foram submetidas ao teste de Tukey e estimaram-se as correlações de Pearson entre os testes (Euclydes, 1992).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Não foi observada diferença (P>0,05) entre os diluidores quanto à motilidade progressiva dos espermatozóides após diluição e resfriamento do sêmen. Após a congelação/descongelação, a motilidade espermática foi maior (P<0,001) com o diluidor Tris-citrato-gema de ovo (Tab. 1).

 

 

Observou-se que após diluição e resfriamento o vigor espermático foi maior nas amostras submetidas ao meio diluidor Tes-Tris (P<0,05) e após a congelação/descongelação, foi maior com o meio Tris-citrato-gema de ovo (P<0,0001) (Tab. 2).

 

 

Os valores de motilidade e vigor espermático do sêmen congelado em cães foram semelhantes aos de Silva & Verstegen (1995), Strom et al. (1997) e Rota (1998).

Considerando-se que somente o Tris-citrato-gema de ovo possui frutose em sua formulação, isso pode ter sido o fator diferencial entre os dois meios diluidores. Como citado por Foote & Leonard (1964), o espermatozóide da espécie canina tem seu período de sobrevivência aumentado quando no meio diluidor há uma fonte exógena de energia. Ainda, segundo Bartllet (1962), o espermatozóide na espécie canina é capaz de utilizar com eficiência a frutose como fonte de energia, a despeito de possuí-la em baixa concentração no plasma seminal.

Quanto à integridade da membrana plasmática dos espermatozóides, não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos após diluição e resfriamento, mas houve diferença entre meios diluidores (P<0,001) após a congelação/ descongelação do sêmen, sendo o diluidor Tris o de resultado superior (Tab. 3). O HOS-T tem por princípio avaliar uma propriedade da membrana plasmática, a de transporte seletivo de moléculas que só ocorre de maneira eficiente nas células com a membrana plasmática íntegra, o que é traduzido por um evidente enrolamento da cauda espermática quando submetida a soluções hiposmóticas (Jeyendran et al., 1992).

 

 

Os resultados desse teste demonstraram que os espermatozóides já sofreram algum tipo de alteração de membrana plasmática durante o resfriamento, pois a porcentagem de espermatozóides que reagiram ao teste diminuiu em aproximadamente 8%, quando comparado com sêmen fresco. Rota et al. (1995) observaram resultados semelhantes. Verificou-se também que a criopreservação implica em um processo estressante para a célula espermática, devido aos valores do HOS-T no sêmen descongelado terem diminuído em mais de 40% dos valores iniciais. Esses valores estão próximos aos verificados por Kumi-Diaka (1993).

Ainda, houve resposta diferenciada ao HOS-T durante as fases de processamento do sêmen, ocorrendo subclasses de enrolamento de cauda, fato relatado por England & Ponzio (1996) e Rodriguez-Gil et al. (1994), que observaram uma amplitude de resposta da célula espermática ao teste hiposmótico relacionada aos vários estresses aos quais a célula foi submetida durante a criopreservação.

No meio diluidor, os componentes que conferem proteção e estabilidade à membrana plasmática dos espermatozóides submetidos à criopreservação são os fosfolipídeos da gema de ovo (Watson, 1981) e o crioprotetor (Aller et al., 1995). Entretanto, entre os meios diluidores utilizados, as concentrações de gema de ovo e glicerol foram as mesmas, assim, parece ter havido outro fator que influenciou os meios para que ocorresse a diferença entre eles.

Quanto à condição do acrossoma dos espermatozóides, não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos após as etapas de diluição e resfriamento, porém houve diferença na integridade do acrossoma (P<0,05) após a congelação/descongelação do sêmen, sendo o diluidor Tris o de resultado superior (Tab.4).

 

 

Os resultados com o sêmen resfriado são semelhantes aos relatados por Rota et al. (1995), de 85% de acrossomas íntegros, e com o sêmen descongelado semelhantes aos de England & Ponzio (1996) e Strom et al. (1997), de cerca de 60% de acrossomas íntegros. Após o resfriamento, a maioria das lesões observadas nos acrossomas foi de edema, que se manifestou em grau moderado. No entanto, logo após a descongelação, as lesões de acrossoma foram muito mais graves, como observadas por Oettlé (1986) e Strom et al. (1997).

O melhor resultado apresentado pelo Tris-citrato após a descongelação pode ser devido à maior capacidade desse diluidor em preservar as membranas espermáticas, aspecto já notado no HOS-T. Não houve diferença (P>0,05) entre diluidores quanto à longevidade do espermatozóide avaliada pelo TTR, quando a motilidade e o vigor foram comparados aos 0, 30, 60, 90 e 120 minutos do teste, nas etapas de diluição e resfriamento do sêmen. No sêmen descongelado observou-se diferença entre diluidores durante todo o TTR (P<0,05), sendo os maiores valores observados com o diluidor Tris (Tab. 5 e 6).

 

 

 

 

O resultado do TTR do sêmen criopreservado foi inferior ao encontrado por Thomas et al. (1992) e Hay et al. (1997), que relataram motilidade espermática entre 30 a 50%, após duas horas de incubação do sêmen diluído em meio Tris-citrato-gema de ovo. Porém, faz-se necessário ressaltar que esses autores mantiveram o sêmen à temperatura de 22° C e a 0° C, respectivamente, durante a realização do teste. Os valores do TTR encontrados por Rota et al. (1997) e Peña et al. (1998), que relataram motilidade espermática em torno de 15% após duas horas de incubação do sêmen a 38° C, foram semelhantes aos observados no presente experimento.

Poucos são os estudos que relatam resultados de testes in vitro com o meio Tes-Tris na espécie canina. England (1992), citado por Rota (1998), utilizou esse meio para a congelação do sêmen canino e relatou que após três horas de incubação do sêmen a motilidade espermática havia decrescido cerca de 75% dos valores iniciais.

Acredita-se que um dos fatores que contribuiu para esse resultado seja o fato de somente o diluidor Tris possuir frutose como um de seus componentes, o que funciona como reserva energética para os espermatozóides (Bartlett, 1962; Foote & Leonard, 1964). Isso demonstra uma superioridade do diluidor Tris em conferir melhor proteção ao espermatozóide. Parece claro que o espermatozóide que está mais bem protegido por um meio diluidor tem maior longevidade.

Mesmo com resultados semelhantes na literatura, os valores encontrados para motilidade e vigor espermático durante o TTR foram baixos. Segundo Rota et al. (1999), um dos fatores que limita a fertilidade do sêmen criopreservado na espécie canina é o curto período de sobrevivência do espermatozóide, após a descongelação. Essa limitada sobrevivência pode ser reflexo de lesões latentes causadas pela congelação e descongelação, como alterações da organização da membrana plasmática, da função mitocondrial ou danos a outras organelas, como o acrossoma. No entanto, esses mesmos autores utilizaram sêmen criopreservado que, quando testado pelo TTR, havia obtido 17% de motilidade espermática após duas horas de incubação a 38° C, para IA em cadelas. A taxa de prenhez alcançada foi de 84%, considerada elevada para a espécie. Acredita-se, portanto, que em condições in vivo, mesmo o espermatozóide que apresenta baixa motilidade, pode interagir no trato reprodutor feminino com fatores que influenciam positivamente sua longevidade.

As correlações entre os testes in vitro são apresentadas na Tab. 7. Observou-se correlação positiva entre motilidade e vigor espermático e TTR, ambas no sêmen criopreservado. Pode-se dizer, portanto, que os resultados de motilidade e vigor espermático imediatamente após a descongelação tiveram reflexo positivo sobre o TTR. Assim, os espermatozóides que estavam com maior motilidade após a descongelação foram os mesmos que obtiveram maior longevidade durante o teste.

 

 

Observou-se, também (Tab. 7), correlação positiva entre motilidade e vigor espermático imediatamente após a descongelação, e HOS-T no sêmen resfriado e congelado, semelhante ao relatado por Kumi-Diaka (1993). Para que o espermatozóide seja responsivo ao teste hiposmótico, a membrana plasmática da região da cauda precisa estar íntegra e funcional (Jeyendran et al., 1992). A motilidade e o vigor espermáticos também são dependentes da condição da membrana plasmática do espermatozóide, além de dependerem de outros fatores, como o fornecimento de energia pela célula, obtido por meio da funcionalidade mitocondrial.

No entanto, não se observou correlação significativa entre o teste hiposmótico realizado no sêmen fresco e diluído e motilidade e vigor espermático, em qualquer das etapas do processamento do sêmen. Jeyendran et al. (1992) verificaram que a correlação entre motilidade e HOS-T é mais alta quando a porcentagem de espermatozóides com a cauda enrolada for em torno de 50%, do que quando a porcentagem for maior que 50%.

Admite-se que em condições nas quais o HOS-T apresenta resultados baixos, com menos espermatozóides reativos ao teste, como ocorre após a descongelação, a motilidade espermática também se apresenta baixa. Em porcentagens altas do HOS-T, a motilidade pode estar normal ou diminuída; isso se deve ao fato de a motilidade espermática depender não só da funcionalidade da membrana plasmática, avaliada no HOS-T, como também da viabilidade dos processos bioquímicos celulares (Jeyendran et al., 1992).

Observou-se correlação positiva entre HOS-T e TTR, ambas no sêmen congelado. Parece que o espermatozóide que manteve a funcionalidade de sua membrana plasmática, após a criopreservação, permaneceu viável por mais tempo, indicado por essa alta correlação entre os dois testes. Além disso, durante o TTR a característica observada é a motilidade espermática e, como já discutido, o HOS-T e a motilidade avaliam em parte a mesma estrutura, que é a membrana plasmática.

 

CONCLUSÕES

Mediante os resultados dos testes in vitro realizados nas amostras de sêmen de cães concluiu-se que o meio diluidor Tris-citrato-gema de ovo é mais eficiente em preservar a qualidade das células espermáticas do que o meio Tes-Tris. Foram satisfatórios os resultados obtidos com os testes in vitro do sêmen criopreservado no meio Tris-citrato-gema de ovo. No entanto, testes in vivo devem ser realizados com sêmen congelado, afim de estabelecer um protocolo eficiente de congelação do sêmen de cães.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALLER, J.F., ALBERIO, R.H., IOVANNITTI, B. et al. Criopreservación de embriones mamiferos Ia. Parte: Características generales de la congelación. Rev. Med. Vet., v.76, p.132-136, 1995.        [ Links ]

ANDERSEN, K. Fertility of frozen dog semen. Acta Vet. Scand., v.13, p.128-130, 1972.        [ Links ]

BARTLETT, D.J. Studies on dog semen- II. Biochemical characteristics. J. Reprod. Fert., v.3, p.190-205, 1962.        [ Links ]

CBRA - Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal. 2.ed. Belo Horizonte: CBRA, 1998. 49p.        [ Links ]

DIMITROPOULOS, R. La signification du test de la thermorésitance dans l'appreciation de la valeur fécondante du sperme congelé. Ann. Méd. Vét., v.4, p.215-224, 1967.        [ Links ]

ENGLAND, G.C.W. Cryopreservation of dog semen: a review. J. Reprod. Fert. Suppl., v.47, p.243-255, 1993.        [ Links ]

ENGLAND, G.C.W., PONZIO, P. Comparisons of the quality of frozen-thawed and cooled-rewarmed dog semen. Theriogenology, v.46, p.165-171, 1996.        [ Links ]

EUCLYDES, R.F. Sistema de análise estatística e genética (SAEG). Central de Processamento de Dados, UFV, Viçosa, 1992. 62p.        [ Links ]

FELDMAN, E.C., NELSON, R.W. Canine and feline endocrinology and reproduction. 2.ed. Philadelphia: Saunders, 1996. 785p.        [ Links ]

FOOTE, R.H., LEONARD, E.P. The influence of pH, osmotic pressure, glycine, and glycerol on the survival of dog sperm in buffered-yolk extenders. Cornell Vet., v.54, p.78-89, 1964.        [ Links ]

HAY, M.A., KING, W.A., GARTLEY, C.J. et al. Canine spermatozoa- cryopreservation and evaluation of gamete interaction. Theriogenology, v.48, p.1329-1342, 1997.        [ Links ]

JEDRZEJCZAK, P., PISARKI T., KURPISZ, M. Evaluation of sperm cryoprotective media in respect to fertilizing capacity tested in vitro. Andrologia, v.28, p.175-183, 1996.        [ Links ]

JEYENDRAN, R.S., van der VEN, H.H., ZANEVELD, L.J.D. The hypoosmotic swelling test: an update. Arch. Androl., v.29, p.105-116, 1992.        [ Links ]

KUMI-DIAKA, J. Subjecting canine semen to the hypo-osmotic test. Theriogenology, v.39, p.1279-1289, 1993.        [ Links ]

LINDE-FORSBERG, C. Achieving canine pregnancy by using frozen or chilled extend semen. Vet. Clin. North Am.: Small Anim. Pract., v.21, p.467-485, 1991.        [ Links ]

LINDE-FORSBERG, C., FORSBERG, M. Fertility in dogs in relation to semen quality and the time and site of insemination with fresh and frozen semen. J. Reprod. Fert. Suppl., v.39, p.299-310, 1989.        [ Links ]

MIES FILHO, A. Reprodução dos animais e inseminação artificial. 5.ed. Porto Alegre: Sulina, 1982, v.2, 783p.        [ Links ]

OETTLÉ, E.E. Changes in acrossome morphology during cooling and freezing of dog semen. Anim. Reprod. Sci., v.12, p.145-150, 1986.        [ Links ]

OLIVEIRA, J.V.L., BARRETO, C.S., FILHO, A.I.R. Avaliação de sêmen canino pós-descongelação, utilizando-se tris-gema e lactose-gema em quatro diferentes períodos de equilíbrio. Rev. Bras. Reprod. Anim., v.23, p.308-309, 1999.        [ Links ]

PEÑA, A., BARRIO, F., QUINTELA, L. A. et al. Effect of different glicerol treatments on frozen-thawed dog sperm longevity and acrossomal integrity. Theriogenology, v.50, p.163-174, 1998.        [ Links ]

RODRIGUEZ-GIL, J.E., MONTSERRAT, A., RIGAU, T. Effects of hypoosmotic incubation on acrossome and tail structure on canine spermatozoa. Theriogenology, v.42, p.815-829, 1994.        [ Links ]

ROTA, A., STROM, B., LINDE-FORSBERG, C. Effects of seminal plasma and three extenders on canine semen stored at 4° C. Theriogenology, v.44, p.885-900, 1995.        [ Links ]

ROTA, A., STROM, B., LINDE-FORSBERG, C. et al. Effects of EQUEX STM paste on viability of frozen-thawed dog spermatozoa during in vitro incubation at 38° C. Theriogenology, v.47, p.1093-1101, 1997.        [ Links ]

ROTA, A., IGUER-OUADA, M., VERSTEGEN, J. et al. Fertility after vaginal or uterine deposition of dog semen frozen in a tris extender with or without EQUEX STM paste. Theriogenology, v.51, p.1045-1058, 1999.        [ Links ]

ROTA, A., LINDE-FORSBERG, C., VANOZZI, J. et al. Cryosurvival of dog spermatozoa at different glycerol concentrations and freezing/thawing rates. In: ROTA. A. (Ed.) Studies on preservation, capacitation and fertility of dog spermatozoa. Uppsala: Swedish University of Agricultural Sciences, 1998. p.1-15.        [ Links ]

ROTA, A. Studies on preservation, capacitation and fertility of dog spermatozoa. Uppsala: Swedish University of Agricultural Sciences, 1998. 43p. (Tese, Doutorado).        [ Links ]

SEAGER, S.J. Successful pregnancies utilizing frozen dog semen. A. I. Digest, v.17, p.6-16, 1969.        [ Links ]

SILVA, L.D.M., VERSTEGEN, J.P. Comparisons between three different extenders for canine intrauterine insemination with frozen-thawed spermatozoa. Theriogenology, v.44, p.571-579, 1995.        [ Links ]

SIRIVAIDYANPONG, S. CHENG, F.P., MARKS,A. et al. Effect of sperm diluents on the acrosome reaction in canine sperm. Theriogenology, v.53, p.789-802, 2000.        [ Links ]

STROM, B., ROTA, A., LINDE-FORSBERG, C. In vitro characteristics of canine spermatozoa subjected to two methods of cryopreservation. Theriogenology, v.48, p.247-256, 1997.        [ Links ]

THOMAS, P.G.A., SURMAN, V., MYERS-WALLEN, V.N. et al. Addition of sodium dodecyl suphate to tris-citrate extender improves motility and longevity of frozen-thawed canine spermatozoa. In: Int. Cong. Anim. Reprod. AI, 12, 1992. Proceedings… v.4, 1992. p.1823-1825.        [ Links ]

WATSON, P.F. The roles of lipid and protein in the protection of ram spermatozoa at 5° C by egg-yolk lipoprotein. J. Reprod. Fert., v.62, p.483-492, 1981.        [ Links ]

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