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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.2001 no.5 Belo Horizonte Oct. 2001

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352001000500001 

Avaliação de testes de ELISA para o diagnóstico sorológico de infecções pelos sorotipos 3, 5 e 7 de Actinobacillus pleuropneumoniae em suínos

[Evaluation of ELISAs for the diagnosis of Actinobacillus pleuropneumoniae infections serotypes 3, 5 and 7 in pigs]

 

H.G. Machado1, I.A. Piffer2,4*, A.L. Guidoni, C. Klein2, C. Gil-Turnes3,4

1CEDISA, Concórdia, SC
2Centro Nacional de Pesquisa em Suínos e Aves – Embrapa
Caixa Postal 21
89700-000, Concórdia, SC, Brasil
3Universidade Federal de Pelotas
4Bolsista CNPq

 

Recebido para publicação em 11 de novembro de 1999.
Recebido para publicação, após modificações, em 24 de janeiro de 2001.
*Autor para correspondência
E-mail: itamar@cnpsa.embrapa.br

 

 

RESUMO

Compararam-se dois antígenos no teste de ELISA para o diagnóstico sorológico dos sorotipos 3, 5 e 7 de A. pleuropneumoniae prevalentes no Brasil. Um compunha-se da fase aquosa da extração fenólica de suspensão bacteriana (FAF) e o outro de lipopolissacarídeos de cadeia longa (LPS-CL). Com esses antígenos foram padronizados ELISAs monovalente e polivalente para os sorotipos prevalentes no Brasil. Com os resultados dos testes de um conjunto de amostras de soro de suínos livres de infecção para A. pleuropneumoniae e um conjunto de amostras de soro obtidas de leitões inoculados com os sorotipos citados e que apresentaram soroconversão, determinaram-se as equações discriminantes para os conjuntos de soros e compararam-se os testes quanto à distância generalizada de Mahalanobis, ao coeficiente de determinação, ao teste F, ao coeficiente global, à sensibilidade e à especificidade. Na análise desses parâmetros observou-se que o antígeno FAF foi superior. Com o ELISA PFAF reações positivas não esperadas foram observadas com animais inoculados com os sorotipos heterólogos 2 e 9, não observadas com o PLPS-CL. A sensibilidade dos testes polivalentes ficou entre 91,5 e 95,7% com especificidade similar, indicando que ambos os testes são adequados para triagem sorológica uma vez que detectam os sorotipos 3, 4, 5, 6, 7 e 8.

Palavras-chave: Suíno, Actinobacillus pleuropneumoniae, pleuropneumonia, ELISA

 

ABSTRACT

This paper describes the use of two antigens in ELISAs for the diagnosis of A. pleuropneumoniae (serotypes 3, 5 and 7) infections in Brazil. One antigen comprised the aqueous fraction obtained by phenol extraction from bacterial cultures (FAF) and the other was composed of long lipopolysaccharide chains (LPS-CL). Mono and polyvalent ELISA systems were standardized with the prevalent serotypes. Discriminating equations were developed with the ELISA’s results obtained with two sets of serum samples. One set of sera had been collected from piglets free from A. pleuropneumoniae infections (known negative sera) and the other set collected from inoculated piglets after seroconversion (known positive sera). The results were compared using the generalized distance of Mahalanobis, the coefficient of determination, the F test, the global coefficient, the sensitivity, and the specificity. The results obtained with the FAF antigen were superior regarding all the evaluated parameters. However, the FAF-ELISA resulted in unexpected positive reactions with serum samples collected from animals that had been inoculated with heterologous serotypes (2 and 9). The sensitivity and the specificity of both tests ranged from 91.5 to 95.7, indicating that these two antigens are appropriate for use in A. pleuropneumoniae screening tests, as they can detect serotypes 3, 4, 5, 6, 7 and 8.

Keywords: Swine, Actinobacillus pleuropneumoniae, pleuropneumonia, ELISA

 

 

INTRODUÇÃO

A pleuropneumonia suína (PPS) causada pelo Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é uma doença infecto-contagiosa que afeta predominantemente suínos nas fases de crescimento-terminação e pode se apresentar sob as formas superaguda, aguda, sub-aguda e crônica (Nicolet, 1992). Essa doença caracteriza-se por uma pleurisia fibrinosa com lesões pulmonares necrohemorrágicas e adesões pleurais fibróticas (Nicolet, 1992). O App pode ser discriminado em dois biovares: biovar 1, NAD dependente e biovar 2, NAD independente (Pohl et al., 1983). São reconhecidos 12 sorotipos de App, apresentando vários graus de virulência (Frey & Nicolet, 1990). A sorotipagem é baseada em antígeno capsular. Porém, os sorotipos reconhecidos possuem composição liposacarídica (LPS) diversa, com exceção dos sorotipos 1, 9 e 11, dos sorotipos 3, 6 e 8 e dos sorotipos 4 e 7 que apresentam epítopos comuns (Nakai et al.,1992).

A PPS ocorre em todas as regiões do planeta e sua importância epdemiológica se relaciona com a intensificação da produção suína (Sebunya & Saunders, 1983). No Brasil, a PPS foi descrita pela primeira vez no Estado de Santa Catarina. Nesse primeiro surto, onde se isolou o sorotipo 5, a morbidade foi de 70% e a mortalidade entre 10 e 20% (Locatelli et al., 1981). Posteriormente, os estudos de sorotipagem das amostras isoladas de casos clínicos no Brasil identificaram os sorotipos 3, 5 e 7 como os prevalentes (Piffer et al., 1987; Piffer et al., 1997). Além desses sorotipos foram isolados os sorotipos 1, 4, 9 e 12 (Saito et al.,1988; Kich, 1996).

Animais que sobrevivem a uma infecção por App geralmente tornam-se doentes crônicos e portadores do agente (Fenwick & Henry, 1994). Na condição de infecção subclínica, sem a presença de sintomas ou lesões, o diagnóstico é normalmente baseado na sorologia, embora o agente possa ser recuperado da cavidade nasal (Kume et al., 1984), das tonsilas e do tecido pulmonar necrótico encapsulado (Sidibé et al., 1993).

No diagnóstico sorológico da pleuropneumonia vários testes têm sido utilizados, entre eles a aglutinação (Gunnarsson et al., 1977), a fixação de complemento (Gunnarsson, 1979b), o ELISA (Nicolet et al., 1981), a soroaglutinação com 2 mercaptoetanol (Mittal et al., 1984) e a inibição das citolisinas (Fenwick, 1992).

Em uma comparação crítica entre os testes sorológicos, o teste de ELISA e o de neutralização das citolisinas foram os melhores, porém esse último não foi eficiente para o sorotipo 7 (Fenwick, 1992). O ELISA é considerado um teste rápido e sensível, facilmente automatizável, porém sua especificidade depende da qualidade do antígeno. Vários tipos de antígenos podem ser usados no teste de ELISA, entre eles o extrato salino fervido e centrifugado, o lipopolissacarídeo de cadeia longa (LPS-LC) e o polissacarídeo capsular (Gottschalk et al.,1994a). Na utilização desses antígenos o LPS-CL e os baseados em cápsula, tanto monovalente como polivalente, foram os melhores tanto no aspecto de sensibilidade como no de especificidade (Bossé et al., 1990; Bossé et al., 1992; Bunka et al.,1992; Gottschalk et al., 1992; Gottschalk et al.,1994a; Gottschalk et al.,1994b; Gottschalk et al.,1997).

Quando se constrói um teste ELISA tenta-se obter um antígeno o mais sensível e específico possível. Porém, um antígeno muito purificado pode inviabilizar o teste pelos custos, sem necessariamente garantir que ele terá sensibilidade ou especificidade superior. Gunnarsson (1979a), utilizando a fase aquosa de uma única extração fenólica de uma suspensão bacteriana, conseguiu antígenos sorotipo específicos no teste de imunodifusão, e essa preparação antigênica com os sorotipos de 1 a 5 foi a que apresentou maior especificidade no teste de fixação do complemento (Gunnarsson, 1979b). Por esse motivo, este trabalho teve por objetivo comparar essa preparação antigênica com a descrita por Radacovicci et al. (1994), composta por lipopolissacarídeos de cadeia longa (LPS-CL), visando um teste de ELISA barato, mas que apresentasse sensibilidade e especificidade adequadas para detectar infecções pelos sorotipos prevalentes de App nos rebanhos brasileiros.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram testadas duas preparações antigênicas, uma composta de polissacarídeo capsular, lipopolissacarídeo, proteínas e possivelmente outros componentes antigênicos, obtidas da fase aquosa da extração fenólica (FAF) como descrito por Gunnarsson (1979a) e outra, composta por lipopolissacarídeos de cadeia longa (LPS-CL), como descrito por Radacovicci et al. (1994). Com cada uma dessas preparações antigênicas foram otimizados ELISAs monovalentes para os sorotipos 3, 5 e 7, conforme preconizado por Jacobson & Downing (1991). ELISAs polivalentes foram obtidos da mistura, em proporções ótimas, dos antígenos FAF (PFAF) e LPS-CL (PLPS-CL) dos sorotipos 3, 5 e 7, como foi descrito por Bossé et al. (1992), Bunka et al. (1992), Fenwick (1992) e Gottschalk et al. (1992).

Para padronizar esses ELISAs foram utilizados: a) 130 soros oriundos de um rebanho SPF estabelecido por histerectomia e livres de infecção por A. pleuropneumoniae; b) soros de animais SPF inoculados com A. suis e Haemophillus parasuis, outros com Mycoplasma hyopneumoniae ou M. flocullare e alguns vacinados contra a rinite atrófica; c) soros de campo com teste de fixação do complemento positivo para A. pleuropneumoniae e soros de suínos SPF inoculados com todos os sorotipos de A. pleuropneumoniae. Estes soros fazem parte da soroteca do CNPSA. Além desses, foram inoculados leitões com os sorotipos 3, 5 e 7 e Actinobacillus suis (Tab. 1), acompanhados com coleta semanal até a 15a semana após a inoculaçãos, quando foram necropsiados. As inoculações, necropsias e exames morfopatológicos e sorológicos foram conduzidos de acordo com o protocolo descrito por Piffer & Mores (1995).

 

 

Para a primeira otimização dos testes de ELISAs foram escolhidos três soros considerados positivos (positivo fraco, moderado e forte) pelo teste de fixação do complemento para cada um dos sorotipos (3, 5 e 7) de App, e um soro SPF (controle negativo). Com esses soros-controle, três diluições de antígeno FAF e quatro diluições de conjugado, todos em duplicatas, procedeu-se à padronização multifatorial dos testes de uma só vez, como preconizado por Jacobson & Downing (1991). Após a padronização inicial de todos os reagentes do teste, submeteram-se todos os soros selecionados, no mesmo instante, ao teste de ELISA. Com os resultados, foram selecionados os soros para a composição dos soros-controle como se segue: como controle negativo (CO) foi misturada uma fração de cada soro que apresentou densidade óptica (DO) menor que a média da população negativa (Mn) até um valor igual à Mn acrescida de três desvios-padrão dos negativos (DPn); como controle positivo foram considerados todos soros oriundos de animais inoculados que apresentaram densidade óptica superior à Mn acrescida de 3 DPn. Desse conjunto de soros positivos, determinaram-se a média da população positiva (Mp) e o desvio-padrão (DPp) das leituras para cada sorotipo em estudo. Eles foram discriminados em três categorias: fracamente positivo (soros com leitura maiores que a Mn + 3 DPn e menores que a Mp -0,5 DPp) (C1), moderadamente positivo (maior que a Mp - 0,5 DPp e menor que a Mp + 0,5 DPp) (C2) e fortemente positivos (igual ou maior que a Mp + 0,5 DPp) (C3). As amostras de soro de cada categoria positiva (C1,C2 C3) foram misturadas entre si, em proporções iguais, para constituírem os controles positivos do teste de ELISA. Com os controles assim estabelecidos foi feita uma padronização multifatorial e definitiva dos reagentes.

Para eliminar o efeito do dia do teste foi estabelecida uma curva padrão para cada teste de ELISA. Os valores dessa curva foram obtidos com as médias dos soros-controle (C0, C1, C2 e C3 ) obtidos em 15 testes realizados em dias distintos, em três réplicas cada. Esses valores foram avaliados pelo programa KELA (Jacobson & Downing, 1991). A cada teste, os resultados eram automaticamente ajustados por meio da curva padrão por análise de regressão linear, que considera os valores médios da densidade óptica de três réplicas de cada soro testado e seus respectivos controles (valores observados de Y), para um soro referência correspondente a cada controle (valores esperados de X). Após esse ajuste, os soros eram classificados como positivos quando sua DO ajustada (média corrigida) era superior à média dos controles negativos acrescidos de quatro desvios-padrão. Caso contrário, eram considerados negativos. Os resultados obtidos com essa classificação das populações negativa e positiva foram submetidos à análise discriminante de Anderson (1958). Nessa nova reclassificação, os soros foram considerados positivos quando a probabilidade de pertencer à população positiva era superior a 50%. Além disso, todos os testes de ELISA desenvolvidos foram testados com soros de animais sabidamente positivos para a maioria dos sorotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophillus parasuis, Actinobacillus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma flocculare e de animais vacinados contra Bordetella bronchiseptica e Pasteurella multocida, para determinar a especificidade

O teste de ELISA propriamente dito foi realizado em microplacas de poliestireno (Limbro/Titertek, ICN Biomedicals Inc, Ohio, EUA) com 96 orifícios. A intensidade de coloração ou densidade óptica foi medida diretamente em cada poço da microplaca com espectrofotômetro (Titertek Multiskan) e os dados processados pelo programa KELA (Kinetics Enzyme-Linked Assays) (Jacobson & Downing, 1991). As microplacas foram sensibilizadas com antígeno diluído em 0,02 M de tampão fosfato (PBS) pH 7,4, acrescido de 0,03M de NaCl, no volume de 100µl em cada poço, incubadas por aproximadamente 18h em câmara úmida a 4°C estocadas a –70ºC.

No momento do teste, as placas eram descongeladas e lavadas três vezes em 0,05 M de PBS pH 7,4 contendo 0,05% de Tween-20 (PBS/Tween-20). A seguir adicionavam-se, em três réplicas, 100µl dos soros em teste e soros-padrão, diluídos a 1:50 em PBS / Tween-20 com 1% de soro albumina bovina (BSA). As placas eram incubadas a 37°C por 30 minutos. Após esse tempo, eram lavadas e, em cada poço, eram colocados 100µl de conjugado anti-IgG de suíno diluído em PBS/Tween 20 com 1% BSA. Procedia-se à incubação e lavagem como indicado anteriormente e adicionavam-se 100µl de uma solução a 1mM do revelador ABTS [2,2-azino-bis (3 ethylbenzthazoline-6 sulfonic acid)] (Sigma, EUA), acrescido de 4mM de H2O2 em tampão fosfato com 0,05M de citrato (pH 4,0). A reação enzimática ocorria durante 30 minutos à temperatura ambiente e ao findar esse tempo, adicionavam-se 50µl de uma solução a 0,5M de ácido cítrico para interromper a reação. A seguir as placas eram agitadas para homogeneizar a coloração, realizando-se a leitura.

Com os resultados da análise discriminante, os testes de ELISA foram comparados quanto à distância de Mahalanobis entre as populações positiva e negativa (D2), quanto à variabilidade total existente entre os grupos das populações positiva e negativa, quanto ao percentual que a função discriminante classificou corretamente (coeficiente de determinação), quanto ao nível de significância de cada teste (teste F) e quanto ao coeficiente global do teste de concordância (CG) entre o status dos animais e a reclassificação realizada pela função discriminante. Além disso, realizou-se uma análise de concordância entre o status dos animais (positivos ou negativos) e os dados da função discriminante, quando então determinaram-se a sensibilidade e a especificidade dos testes. Os passos da análise estatística pertencem ao procedimento DISCRIM do SAS (1985). O status de animal positivo foi definido como aquele em que o animal teve contato com o agente, por meio de inoculações experimentais e/ou contato com animais inoculados, e apresentou soroconversão definida como densidade óptica igual ou superior à média das leituras dos soros obtidos de leitões originados de rebanho SPF estabelecido por histerectomia e livre de infecção por Actinobacillus pleuropneumonae (status de animal negativo), acrescido de quatro desvios-padrão da média.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A dinâmica do aparecimento de anticorpos nos leitões infectados experimentalmente com os diferentes sorotipos de App foi similar entre todos os grupos de leitões independentemente do tipo de antígeno (FAF ou LPS-CL) e do teste (monovalente ou polivalente). Para exemplificar, nas Fig. de 1 a 4 são apresentados os resultados com os animais inoculados com o sorotipo 5. Observa-se que os títulos permaneceram positivos até o momento da necropsia, 15 semanas após a exposição ao agente, sugerindo que os testes constituem-se em excelentes ferramentas tanto para o diagnóstico quanto para a determinação de perfis sorológicos. Os títulos de anticorpos com os antígenos polivalentes foram menores do que os observados com os antígenos monovalentes. Explica-se essa diferença pela forma como os ELISAs polivalentes foram montados, ou seja, pela mistura dos antígenos monovalentes padronizados que competiam pelo mesmo número de pontos de ligação existentes nos poços das microplacas.

 

 

 

 

 

 

 

 

Com os sorotipos 5 (Fig. 1-4) e 7 (dados não demonstrados) foi observada soroconversão em todos os animais experimentais, com ambos os antígenos e testes entre a primeira e a segunda semana após a exposição ao respectivo sorotipo. Com o sorotipo 3 isso ocorreu entre a segunda e a quarta semana (dados não demonstrados). Isto parece estar associado à diferença de virulência dos sorotipos de App (Nicolet, 1992).

Na Tab.2 são mostrados os resultados dos testes de ELISA com antígenos polivalentes de leitões inoculados com diferentes sorotipos de App. No ELISA com antígeno polivalente dos sorotipos 3, 5 e 7 (PFAF) foi observada sorologia positiva nos leitões inoculados com os sorotipos 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 e com um de cinco soros do sorotipo 9. No ELISA com antígeno polivalente (PLPS-CL), resultados positivos foram observados com os leitões inoculados com os sorotipos 3, 4, 5, 6, 7 e em dois dos três leitões inoculados com o sorotipo 8. Essas reações com soros positivos para os sorotipos 4, 6 e 8 ocorreram devido à presença de antígenos somáticos comuns entre os sorotipos 3, 6 e 8 e entre os sorotipos 4 e 7 (Nakai et al., 1992).

 

 

Reações cruzadas não esperadas com os sorotipos 2 e 9 ocorreram com o antígeno PFAF. Esse antígeno é constituído de polissacarídeo capsular, lipopolissacarídeos, proteínas e outros componentes antigênicos (Gunnarson, 1979a). A única extração fenólica parece não reduzir de forma significativa o conteúdo de proteínas da fase aquosa, fazendo supor que a presença de tais proteínas seja a causa das reações cruzadas observadas. A ocorrência de epítopos comuns na cápsula dos sorotipos 5 e 2, já registrada por Bossé et al. (1990), pode ser uma explicação para as reações positivas observadas com o sorotipo 2, uma vez que na preparação do antígeno FAF certamente existe antígeno capsular para o sorotipo 5 (Gunnarson, 1979a).

Com o antígeno LPS-CL para os sorotipos 3, 5 e 7 não existem registros de reações cruzadas com o sorotipo 9, fato também não observado com os soros de animais positivos para esse sorotipo neste experimento.

Entre os animais inoculados com os principais microorganismos que afetam o sistema respiratório dos suínos ou vacinados contra Bordetella bronchiseptica e Pasteurella multocida, não se observou resposta positiva para os ELISAs utilizados, indicando boa especificidade dos testes em relação a essas infecções comuns nos rebanhos suínos. Alguns autores têm registrado reações cruzadas entre alguns sorotipos do App (1, 2, 3 e 5) e alguns do Actinobacillus suis ao utilizarem antígeno polissacarídeo capsular ou outros testes sorológicos (Bossé et al., 1990; Gottschalk et al., 1994b). Neste experimento não ocorreram reações cruzadas entre os sorotipos 3, 5 e 7 de App e os soros positivos contra a amostra de Actinobacillus suis utilizada na infecção experimental. Talvez essas reações dependam do sorotipo de A. suis envolvido.

A Tab.3 fornece a distância generalizada de Mahalanobis (D2) entre populações positiva e negativa, o teste F para verificar o grau de diferença entre os testes, o coeficiente de determinação (R2) e o coeficiente global (CG) e as características de sensibilidade dos testes. Observa-se D2 igual a 24,88 e 9,31, respectivamente, para os antígenos PFAF e PLPS-CL, indicando que o antígeno PFAF é mais eficiente que o PLPS-CL. Como conseqüência observaram-se valores maiores para o R2, para o teste F e para o CG.

 

 

De forma semelhante, as estatísticas D2, R2, teste F e CG permitem comparar os antígenos FAF3 com LPS-CL3, FAF5 com LPS-CL5 e FAF7 com LPS-CL7, indicando a superioridade do FAF3 e do FAF7 em relação ao LPS-CL3 e ao LPS-CL7, respectivamente. O mesmo não se observou entre FAF5 e LPS-CL5, quando ocorreu ligeira superioridade do LPS-CL5.

A sensibilidade e a especificidade dos testes de ELISA mono e polivalentes foram comparadas levando-se em conta a análise de concordância entre o status dos animais e a função discriminante de Anderson. Todos os testes apresentaram especificidade de 100% em relação à população definida como negativa. Quanto à sensibilidade, com exceção do sorotipo 5, os ELISAs que utilizaram o antígeno FAF apresentaram sensibilidade superior ao antígeno LPS-CL. Em todos os ELISAs a sensibilidade foi alta, variando de 88,3 a 96,6 % para o antígeno LPS-CL e de 93,3 a 98,5 % para o antígeno FAF.

Muitos autores têm avaliado a sensibilidade e a especificidade de testes de ELISA tanto mono como polivalentes. Willson et al. (1988) avaliaram um ELISA monovalente com antígeno similar ao FAF utilizado neste trabalho, tanto sob o ponto de vista individual como de rebanho. A sensibilidade e a especificidade determinadas nos testes de rebanho foi de 89% para as duas características. Individualmente a sensibilidade foi de 97% e a especificidade de 96%. Gottschalk et al. (1994a), utilizando animais experimental e naturalmente infectados em ELISA indireto, com valores limites do ponto-de-corte calculados de forma similar aos deste trabalho, obtiveram com o antígeno FAF sensibilidade de 81% e especificidade de 88%, e com o antígeno LPS-CL, sensibilidade de 81% e especificidade de 98%.

Neste experimento, a maior sensibilidade dos ELISAs que utilizaram antígeno FAF poderia ser devida ao fato de esse antígeno apresentar maior variedade de determinantes antigênicos, já que é composto de polissacarídeo capsular, lipopolissacarídeos e outros componentes antigênicos (Gunnarsson, 1979b). Na preparação do antígeno LPS-CL a fervura deve ter degradado o antígeno capsular (Radacovici et al., 1994), e pelas repetidas extrações fenólicas adotadas, até não haver nenhuma precipitação na interface entre a fração aquosa e fenólica, deve ter havido redução de forma significativa da contaminação protéica, o que reduziu a sensibilidade e melhorou a especificidade do teste. Quanto à pequena superioridade na sensibilidade do antígeno LPS-CL5 em relação ao FAF5, poderia estar relacionada com características peculiares dos determinantes antigênicos do LPS-CL desse sorotipo.

A alta sensibilidade observada com ambos os ELISAs polivalentes sugere que os testes são adequados para o diagnóstico sorológico da pleuropneumonia suína. Em rebanhos com infecções crônicas, a prevalência de matrizes soropositivas variou de 56,1% a 99,0%, média de 90,7%, ao se utilizar o teste de ELISA com antígeno PLPS-CL (Kich, 1996). Na mais baixa prevalência observada, o valor preditivo positivo foi de 93,0%.

Deve se chamar atenção para a necessidade de validar esses testes em campo, pois animais não experimentais são expostos a uma gama maior de antígenos provenientes de vários microorganismos que podem afetar a especificidade dos testes, principalmente para o antígeno FAF.

A vantagem dos testes polivalentes reside na capacidade de detectar vários sorotipos prevalentes em uma determinada região para posterior análise com testes sorológicos específicos para cada sorotipo (Bossé et al., 1992; Bunka et al., 1992; Gottschalk et al., 1992). ELISAs baseados em PLPS-CL foram mais específicos do que os baseados em PFAF, embora estes últimos tenham sido mais sensíveis.

Concluiu-se que os testes polivalentes contra os sorotipos 3, 5 e 7 de App, em virtude de suas sensibilidades, têm características para triagem, uma vez que detectam tanto a infecção dos sorotipos prevalentes no Brasil como aqueles que possuem LPS-CL homólogos, reduzindo a necessidade de se utilizar um teste sorológico para cada sorotipo. Soros positivos nesses testes poderiam ser submetidos a um ELISA baseado em cápsula purificada para aumentar a especificidade, diminuindo os custos no diagnóstico. Nos animais soropositivos poderia ainda ser feita pesquisa do agente nas amígdalas pelo isolamento ou pelo PCR específico.

 

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