Taurina no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro

Taurine on the development of in vitro fertilized bovine embryos

Taurina no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro

[Taurine on the development of in vitro fertilized bovine embryos]

L.S.A. Camargo¹, W.F.Sá¹, A.M.Ferreira¹, J.H.M.Viana², M.C.C.Araújo²

¹Embrapa Gado de Leite.

Rua Eugênio do Nascimento, 610 - Bairro Dom Bosco

36038-330 – Juiz de Fora, MG

2Doutorando - Escola de Veterinária da UFMG

Suporte financeiro: CNPq

Recebido para publicação em 26 de janeiro de 2001.

Recebido para publicação, após modificações, em 30 de janeiro de 2002.

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RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de taurina no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro em meio de cultivo com diferentes fontes de soro. No experimento 1, zigotos (n=440) fecundados in vitro foram distribuídos aleatoriamente nos tratamentos com 0, 3, 7 ou 14 mM de taurina em meio de cultivo acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) e 3g/l de albumina sérica bovina (BSA). No experimento 2, os zigotos (n=940) foram divididos nos tratamentos com 0, 3 ou 14 mM de taurina em meio acrescido de 10% de SFB ou 3g/l de BSA. No experimento 3, os zigotos (n=191) foram divididos nos tratamentos com 0 ou 3 mM de taurina em meio de cultivo sem fonte de soro, porém adicionado de 3 g/l de álcool polivinil. Nos experimentos 1 e 2 não se observou diferença (P>0,05) na taxa de clivagem, na produção de blastocistos e no número de células entre as concentrações de taurina avaliadas. No experimento 3 encontraram-se maior (P<0,05) taxa de clivagem (68,5% vs. 16,9%) e produção de blastocistos (8,3% vs. 0%) na presença de taurina. O cultivo de zigotos em meio adicionado de SFB produziu maior (P<0,01) taxa de blastocistos no sétimo (25,6% vs. 6,7%) e oitavo (30,8% vs. 13,9%) dia pós-fecundação e número de células/blastocistos (104,8± 2,63 vs. 84,7± 3,86) do que no cultivo com BSA, apesar de menor (P<0,01) taxa de clivagem (58,1% vs. 71,3%). Conclui-se que o efeito benéfico da taurina no desenvolvimento embrionário somente é observado na ausência de SFB e BSA. O SFB produz menor taxa de clivagem mas melhora o desenvolvimento embrionário após as primeiras divisões celulares.

Palavras-chave: Bovino, embrião, taurina, desenvolvimento embrionário

ABSTRACT

The effect of different taurine concentrations on bovine embryo development in medium supplemented with different serum sources was studied. In the first experiment, in vitro fertilized zygotes (n=440) were divided into treatments with 0, 3, 7 or 14 mM of taurine in culture medium supplemented with 10% of fetal calf serum (FCS) and 3g/l of bovine serum albumin (BSA). In the second experiment, zygotes (n=940) were divided into treatments with 0, 3 or 14 mM of taurine in cultured medium supplemented with 10% of FCS or 3g/l of BSA. In the third experiment, zygotes (n=191) were divided into treatments with 0 or 3 mM of taurine in culture medium without serum source, even so supplemented with 3g/l of polyvinyl alcohol. In the first and second experiments no differences (P>0.05) in cleavage rate, blastocyst production and cells number among the concentrations of taurine were observed. In the third experiment, taurine increased (P<0.05) cleavage rate (68.5% vs. 16.9%) and blastocysts production (8.3% vs. 0%). The culture of zygotes in medium supplemented with FCS produced more (P<0.01) blastocyst in the seventh (25.6% vs. 6.7%) and eighth (30.8% vs. 13.9%) day post-fertilization and total cells number/blastocysts (104.8± 2.63 vs. 84.7± 3.86) than in medium with BSA, despite lower (P<0.01) cleavage rate (58.1% vs. 71.3%). In conclusion, taurine only has a beneficial effect in the embryo development in culture medium in the absence of FCS and BSA. Fetal calf serum decreases cleavage rate, however, it improves the embryo development after the early cleavage.

Keywords: Cattle, embryo, taurine, in vitro culture

INTRODUÇÃO

Na produção in vitro (PIV) do embrião bovino é grande o efeito do cultivo embrionário, uma vez que o embrião é mantido neste cultivo por até oito dias (Lonergan et al., 1999). Os meios de cultivo embrionário atualmente utilizados na PIV têm melhorado o desenvolvimento embrionário, porém ainda são limitados quanto ao aproveitamento dos oócitos (Thompson & Duganzich, 1996). Isso pode ser atribuído à interação entre nutrientes, animal, anormalidades cromossômicas, ambiente atmosférico e deficiência ou excesso de componentes químicos (Kola et al., 1993; Bavister, 1995; Gardner, 1998; Yang et al., 1998).

Trabalhos têm demonstrado que a taurina pode atuar como antioxidante durante o cultivo embrionário diminuindo a ação de radicais livres (Liu & Foote, 1995; Guyader-Joly et al., 1998). A utilização de substâncias antioxidantes no cultivo parece ser desejável, principalmente em ambiente com 20% de O₂, onde ocorre maior formação de radicais livres (Bavister, 1995). Entretanto, os resultados nesse ambiente atmosférico não são bem claros (Liu & Foote, 1995; Lonergan et al., 1999), e seus efeitos podem não ser evidentes na presença de albumina sérica bovina (BSA) ou de soro fetal bovino (SFB), pois essas substâncias também possuem função de proteção do embrião durante o cultivo contra a formação de radicais livres (Bavister, 1995).

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da taurina sobre o desenvolvimento e a qualidade do embrião, quando em co-cultura com células do cumulus em meio de cultivo suplementado com BSA, SFB e álcool polivinil (PVA).

MATERIAL E MÉTODOS

Os complexos cumulus-oócitos (COC) foram obtidos de ovários coletados em matadouro e transportados em solução fisiológica aquecida à 35ºC. No laboratório os COCs foram aspirados de folículos de 2 a 8mm de diâmetro, com auxílio de uma seringa e agulha 21G. O líquido folicular foi recuperado em meio TALP - Hepes (Bavister et al., 1983) aquecido a 38ºC, onde os COCs foram lavados. Com auxílio de um microscópio estereoscópio foram selecionados para a maturação in vitro os que apresentavam células do cumulus compactas e com no mínimo três camadas. A maturação foi realizada em 400ml de TCM 199 (tissue culture medium) adicionado de 20mg/ml de FSH e 10% de soro de vaca em cio, em incubadora com 5% de CO₂, 95% de umidade e temperatura de 38,8ºC, por 22 a 24h. Após a maturação os COCs foram transferidos para o meio de fecundação.

Para a fecundação in vitro foi utilizado sêmen de touros Holandês, descongelado em banho-maria a 37ºC por 30 segundos. Os espermatozóides móveis foram selecionados pelo método de swim up e capacitados durante 15 minutos com 200mg/ml de heparina, em estufa incubadora a 38,8ºC e 5% de CO₂ em ar atmosférico. A fecundação foi realizada em microgotas de 100 a 200ml de FERT-Talp, em óleo mineral, na concentração espermática de 2,0-2,5 x 10⁶ espermatozóides/ml, onde permaneceram por 20-22h, em estufa incubadora com 5% de CO₂, 95% de umidade e 38,8ºC.

Ao final desse período, os zigotos foram co-cultivados com suas células do cumulus em meio CR2aa (Rosenkranks & First, 1994) durante oito dias, em 5% de CO₂, 95% de umidade e 38,8ºC em ar. Quinze a 20 oócitos foram cultivados em gotas de 50ml em óleo mineral e o meio renovado com 72h pós-fecundação.

A taxa de clivagem foi avaliada 72h pós-fecundação, a taxa de blastocisto a partir do sétimo dia e de blastocistos eclodidos no oitavo dia. Blastocistos no oitavo dia também foram fixados e corados para contagem do número de células, pelo procedimento descrito por Lim et al. (1994).

No experimento 1, os zigotos (n=440, cinco repetições) foram divididos aleatoriamente em quatro tratamentos, contendo cada um 0, 3, 7 ou 14 mM de taurina em meio CR2aa, suplementado com 3mg/ml de BSA e 10% de SFB.

No experimento 2 avaliou-se o efeito da taurina somente na presença de BSA ou de SFB. Para isso, os zigotos (n=940, seis repetições) foram divididos aleatoriamente em seis tratamentos para se avaliar o efeito de 0, 3 ou 14 mM de taurina em meio CR2aa com 3 mg/ml de BSA ou com 10% de SFB.

No experimento 3 avaliou-se o efeito da taurina na ausência de BSA e de SFB, substituídos por PVA. Para isso, os zigotos (n=191, quatro repetições) foram divididos aleatoriamente em dois tratamentos com 0 ou 3 mM de taurina em meio CR2aa suplementado apenas com 3mg/ml de PVA.

O resultado total de todas as repetições quanto às taxas de clivagem, de blastocistos e de blastocistos eclodidos foram analisados pelo teste exato de Fisher ou teste do qui-quadrado, considerando-se nível de significância de P<0,05. Para o número total de células por blastocistos fez-se análise de variância e as diferenças entre as médias foram comparadas pelo teste Student-Newman-Keuls.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tab. 1 apresenta os resultados (experimento 1) de três concentrações de taurina adicionadas em meio de cultivo suplementado com BSA e SFB sobre o desenvolvimento embrionário in vitro. Não houve efeito (P>0,05) da concentração de taurina sobre a taxa de clivagem e sobre a produção de blastocistos. Da mesma forma não houve efeito sobre o número de células dos blastocistos (Fig. 1). Alguns trabalhos têm verificado que a taurina possui efeito positivo sobre o desenvolvimento embrionário in vitro (Liu et al., 1995; Lu et al., 1997; Guyader-Joly et al., 1998). Nesses casos, supõe-se que a ação seja contra radicais livres (Bavister, 1992; Liu & Foote, 1995) e como osmólito, para manter a função intracelular e o volume celular (Gardner, 1998). Também tem sido relatado que a utilização de BSA e de soro contribui para diminuir a formação de radicais livres (Bavister, 1995). Portanto, os resultados do primeiro experimento deixam dúvidas se a taurina realmente não possui efeito sobre o desenvolvimento embrionário ou se a falta deste foi devido à presença de BSA e SFB no meio de cultivo.

Os experimentos 2 e 3 procuraram verificar se a taurina apresentaria algum efeito no desenvolvimento embrionário quando cultivado em meio suplementado com BSA ou com SFB ou na ausência deles. No experimento 2 não houve efeito da concentração de taurina (P>0,05) sobre o desenvolvimento embrionário (Tab. 2) e sobre o número de células dos blastocistos (Fig. 2), independente da fonte de soro utilizada. No experimento 3 observou-se efeito (P<0,05) da taurina sobre a taxa de clivagem e sobre a produção de blastocistos (Tab. 3), demonstrando que a taurina, quando utilizada em ambiente com ar atmosférico (aproximadamente 21% de O₂) e na ausência de BSA e SFB, tem efeito positivo no desenvolvimento embrionário, mesmo em co-cultura com células do cumulus. Sabe-se que a redução da porcentagem de O₂ de 21 para 5% melhora o desenvolvimento embrionário (Yang et al., 1994), provavelmente pela diminuição da formação de radicais livres que são produzidos em alta concentração de O₂ (Bavister, 1995). Os efeitos benéficos da taurina em ambiente atmosférico com 20% de O₂ mostram que esse aminoácido pode agir contra os radicais livres formados nessa condição atmosférica (Liu et al., 1995; Liu & Foote, 1995; Fujitani et al., 1997). As concentrações estudadas por esses autores variaram de 2 a 14mM. No presente trabalho os efeitos da taurina podem estar mascarados pela presença de SFB e BSA, que apresentam natureza indefinida e grande variabilidade na composição (Thompson, 2000), e podem também atuar como antioxidantes (Bavister, 1995).

Embora a taurina tenha surtido efeito, o número de células de blastocistos (Tab. 3) foi inferior (P<0,01) quando comparado com o produzido em meio com BSA e SFB (Fig. 1), mostrando que outros componentes presentes na BSA e/ou SFB são necessários para o desenvolvimento e produção de um embrião de melhor qualidade. Entre esses componentes, os fatores de crescimento parecem ser os mais importantes (Bavister, 1995). Fatores de crescimento como LIF (fator inibitório da leucemia) melhoram o desenvolvimento do blastocisto à eclosão (Lavramos et al., 1995), enquanto que o EGF (fator de crescimento epidérmico) estimula a produção e eclosão in vitro de blastocistos bovinos (Keefer et al., 1994). Outros fatores como TGFa e IGF 1 estimulam a proliferação celular (Ghosh & Sengupta, 1998).

Estes resultados confirmam os de Lui & Foote (1995) e de Fujitani et al. (1997). Contudo, alguns autores não têm encontrado efeito da taurina, mesmo na ausência de alguma fonte de soro e em 20% de O₂ (Lonergan et al., 1999). Essas diferenças talvez possam ser explicadas pela utilização de co-cultura, cujas células poderiam interagir com a taurina em prol do desenvolvimento embrionário. O experimento 3 mostra que a co-cultura com células do cumulus não foi suficiente para melhorar o desenvolvimento embrionário in vitro, necessitando da suplementação de taurina, uma vez que o grupo-controle não produziu blastocistos, mostrando possível interação entre ambos. Outro fator que pode interferir nos resultados entre laboratórios é a composição dos meios de cultivos. Alguns desses componentes, quando em concentrações diferentes, podem interferir nos efeitos da taurina, caso da glutamina (Lu et al., 1999), citada como um dos principais aminoácidos necessários para o desenvolvimento embrionário (Bavister, 1995).

A baixa taxa de clivagem e a ausência de blastocistos no meio de cultivo realizado somente com PVA podem ser devidas ao fato deste atuar apenas como surfactante (Thompson, 2000), sem ação nutritiva ou protetora. Há relatos de bons resultados em meios quimicamente definidos suplementados com PVA (Keskintepe & Brackett, 1996; Holm et al., 1999) e enriquecidos com aminoácidos e fatores de crescimento (Liu & Foote, 1997; Matsui et al., 1997), porém esses meios de cultivo exigem condições atmosféricas com 5% de O₂ para diminuir a formação de radicais livres, condições diferentes das do presente trabalho. Assim, sugere-se que a taurina, quando utilizada em meios de cultivos definidos em ambientes com 20% de O₂, pode ter ação protetora contra radicais livres, mesmo na presença de células somáticas. Como as diferentes concentrações de taurina adicionadas em meio contendo o mesmo tipo de soro não diferiram entre si no experimento 2 (Tab. 2), os resultados puderam ser unidos para se avaliar o efeito da fonte de soro no desenvolvimento embrionário. Dessa união de dados resultou a Tab. 4, que mostra maior (P<0,01) taxa de clivagem dos zigotos cultivados em meio contendo BSA (71,3%) em relação aos cultivados com SFB (58,1%), porém menor (P<0,01) taxa de blastocistos no sétimo e oitavo dias, e menor (P<0,01) taxa de eclosão de blastocistos no oitavo dia e menor (P<0,01) número de células.

A BSA e o SFB têm sido amplamente utilizados em meios de cultivos embrionários. Alguns trabalhos têm encontrado efeitos semelhantes entre BSA e outras fontes de soros sobre o desenvolvimento embrionário (Krisher et al., 1999; Kuran et al., 1999), enquanto outros encontraram melhores resultados em meio suplementado com SFB (Shamsudin et al., 1994; Wang et al., 1997, Lonergan et al., 1999, Gomes & Diez, 2000), como no presente trabalho. A albumina, principal componente desses soros, pode ter papel nutritivo durante o desenvolvimento embrionário, principalmente pós-compactação (Thompson, 2000), e é predominantemente incorporada às células do trofoblasto via endocitose (Eckert et al., 1998). Entretanto, outros componentes podem estar presentes nas fontes de soro, como ácidos graxos, fatores do crescimento, aminoácidos e vitaminas (Bavister, 1995; Krisher et al., 1999), e podem atuar no desenvolvimento embrionário. Em princípio, tanto a BSA como o SFB contêm esses componentes séricos, entretanto o processo para extração, purificação e liofilização da albumina para formar o produto comercial BSA pode reduzir a quantidade desses componentes séricos quando comparado com o processo para formar o SFB, o que poderia provocar as diferenças entre experimentos.

A utilização de soro em meios de cultivo tem sido associada à aceleração do desenvolvimento embrionário após estádio de 8-16 células, com a formação mais rápida de blastocele e maior número de células por blastocistos (Van Langendonckt et al., 1997; Tricoire et al., 1999), demonstrando efeito bifásico (Pinyopummintr & Bavister, 1991), inibindo as primeiras divisões celulares (Bavister, 1995). No experimento 2 observou-se menor taxa de clivagem na presença de SFB, acompanhada de desenvolvimento embrionário mais acelerado após 72h, representado pela maior taxa de blastocistos e pela melhor qualidade dos embriões, avaliada pela taxa de eclosão no oitavo dia e pelo número de células (Tab. 4), demonstrando haver diferenças entre SFB e BSA. Um dos constituintes do SFB que pode diminuir a taxa de clivagem é a glicose, uma vez que o soro possui maior concentração desse substrato do que a BSA (Gomes & Diez, 2000). A utilização de glicose antes de 24-72h pós-fecundação está associada ao atraso no desenvolvimento embrionário (Takahashi & First, 1992; Matsuyama et al., 1993). O consumo de glicose é limitado durante as primeiras divisões celulares do zigoto. Após o estádio de 8-16 células, com início da compactação celular e blastulação, o bloqueio ao uso da glicose é removido, sendo o substrato utilizado para a produção de ATP (Gardner, 1998; Thompson, 2000). Entretanto, a presença de maior concentração de glicose no SFB não explica a maior taxa de desenvolvimento embrionário após 72h, culminando com maior taxa de blastocistos e com maior número de células, uma vez que a adição desse substrato, nas concentrações fornecidas pela suplementação com soro, após 42-90h pós-fecundação não melhora o desenvolvimento embrionário (Van Langendonckt et al., 1997). Portanto, o efeito do SFB após os estádios iniciais do desenvolvimento embrionário pode ser devido à ação de outros componentes, como fatores de crescimento, que estimulam a compactação celular, a formação da blastocele e a eclosão do embrião (Keefer et al., 1994; Lavramos et al., 1995; Ghosh & Sengupta, 1998).

Entre esses fatores estão a insulina e o IGF-I, que também atuam na síntese protéica e na proliferação celular (Kane et al., 1997). O IGF-I pode agir como fator autócrino, uma vez que foi detectado mRNA para IGF-I e para seus receptores em embriões em todos os estádios de desenvolvimento (Watson et al., 1992; Lonergan et al., 2000), entretanto, in vitro parece ser necessária grande quantidade de IGF-I, para estimular o desenvolvimento embrionário a partir da terceira divisão celular (Palma et al., 1997). Já a insulina deve atuar como fator parácrino, pois não se encontrou mRNA para esse hormônio mas somente para seus receptores (Watson et al., 1992), indicando que essa não deve ser secretada pelo embrião e sim fornecida pelo ambiente. A necessidade da insulina no meio de cultivo foi verificada em experimentos que identificaram melhor desenvolvimento embrionário em meio suplementado com esse hormônio (Matsui et al., 1997). Como o soro pode ser fonte de IGF-I e de insulina (Bavister, 1995; Palma et al., 1997) e também alterar a expressão gênica dos embriões (Wrenzicky et al., 1999), é possível que a utilização de SFB não só forneça esses fatores, como também estimule a expressão de mRNAs para IGF-I e para receptores de IGF-I e insulina, contribuindo para a proliferação celular após as primeiras clivagens e para a formação da blastocele.

CONCLUSÕES

A taurina pode ser utilizada em meio de cultivo com co-cultura na ausência de BSA ou SFB, melhorando o desenvolvimento dos embriões. Para melhor avaliar o efeito de nutrientes sobre o desenvolvimento embrionário deve-se utilizar meios de cultivos quimicamente definidos. O efeito do SFB sobre o desenvolvimento embrionário ocorre principalmente após as primeiras clivagens, possivelmente por meio de fatores de crescimento presentes no SFB que estimulam a formação da blastocele e o número de células nos blastocistos.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Dez 2002
• Data do Fascículo
  Ago 2002

Histórico

• Aceito
  30 Jan 2002
• Recebido
  26 Jan 2001