Efeito protetor da microbiota cecal congelada e liofilizada sobre a infecção experimental de frangos de corte por Salmonella enterica sorovar Enteritidis

Protection by anaerobic cecal microflora frozen or lyophilized against experimental infection by Salmonella enterica serovar Enteritidis in broilers

Efeito protetor da microbiota cecal congelada e liofilizada sobre a infecção experimental de frangos de corte por Salmonella enterica sorovar Enteritidis

[Protection by anaerobic cecal microflora frozen or lyophilized against experimental infection by Salmonella enterica serovar Enteritidis in broilers]

R.L. Andreatti Filho¹, A.J. Crocci²

¹Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP

Distrito de Rubião Júnior, s/nº

18618-000 - Botucatu, SP

²Instituto de Biociências, UNESP.

Recebido para publicação em 28 de novembro de 2001

Recebido para publicação, após modificações, em 5 de junho de 2002

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RESUMO

Estudaram-se os efeitos do tratamento de frangos de corte com microbiota cecal anaeróbia liofilizada (MCL) e congelada (MCC) sobre a infecção do trato digestivo das aves por Salmonella enterica sorovar Enteritidis. Foi usada microbiota intestinal sem prévia identificação bacteriana. A infecção foi persistente, em ordem, no ceco, inglúvio e duodeno. A infecção também foi autolimitante nos grupos tratados e no controle. Não ocorreu diferença entre o grupo-controle positivo e os tratados com MCL ou MCC. Houve redução da colonização do ceco no período de 12 dias após o desafio nos grupos tratados com MCL e MCC, o que não ocorreu no grupo-controle positivo. Não houve variação entre os tratamentos com MCL e MCC quanto às características pesquisadas. A S. Enteritidis reduziu o ganho de peso médio nas aves inoculadas. Os tratamentos com MCL e MCC minimizaram a redução de peso nos grupos infectados.

Palavras-chave: Frango, Salmonella Enteritidis, probiótico, exclusão competitiva, microbiota congelada, microbiota liofilizada

ABSTRACT

The effects of anaerobic cecal microflora lyophilized (AML) or frozen (AMF) on the digestive tract infection of broilers by Salmonella Enteritidis (SE) were studied. AML and AMF were used without previous bacterial identification. SE infection was more evident in ceca, followed by crop and duodenum. The infection was self limited both in treated and control groups. No significant difference between the positive control and the treated with AML group or AMF was observed. However, there was a reduction of the chick digestive system SE colonization, especially in the ceca, as well as in SE fecal excretion in the treated groups with AML and AMF, in comparison with the positive control group. No significant variation between the treatments with AML and AMF, in none of the evaluated parameters was observed. SE reduced body weight gain in the inoculated birds. The treatments with AML and AMF minimized weight reduction in the infected groups.

Keywords: Broiler, Salmonella Enteritidis, probiotic, competitive exclusion, anaerobic microflora frozen, anaerobic microflora lyophilized

INTRODUÇÃO

A colonização intestinal por grande e diversificado número de bactérias é achado normal nas aves. Entre as bactérias capazes de colonizar o trato intestinal da galinha encontram-se diferentes sorovares de Salmonella causadores de infecções em humanos. A susceptibilidade da galinha à colonização intestinal por Salmonella spp. é maior durante os primeiros dias de vida, reduzindo-se à medida que ocorre o crescimento da microbiota intestinal normal (Nurmi & Rantala, 1973; Pivnick et al., 1982).

O termo exclusão competitiva é usado para descrever a capacidade de uma microbiota impedir a colonização intestinal de outras bactérias. A administração de probióticos, compostos por microrganismos da microbiota intestinal de aves normais, pode determinar alguma proteção às aves receptoras contra a colonização por alguns patógenos, particularmente Salmonella spp. (Ziprin et al., 1993; Nisbet et al., 1994; Hollister et al., 1995; Andreatti Filho et al., 1997, 1999, 2000).

São descritos vários métodos de administração da microbiota intestinal, ou seja, por meio de pulverização sobre as aves, inoculação em ovos embrionados, inoculação via cloaca, reutilização de cama, inoculação via endoesofágica e adição à ração ou à água de bebida. O inóculo pode ser obtido a partir de fezes ou de conteúdo cecal recém-colhidos (Ziprin et al., 1993; Nisbet et al., 1994; Andreatti Filho et al., 1997, 1999, 2000). Liofilização e congelamento têm sido utilizados para preservação e manutenção da microbiota para posterior uso como probiótico. Entretanto, no momento não há completo entendimento de como reproduzir a microbiota e preservar sua ação.

O propósito deste estudo foi verificar o efeito do congelamento e da liofilização da microbiota cecal anaeróbia de galinha na prevenção da infecção experimental de frangos de corte, desafiados com Salmonella enterica sorovar Enteritidis.

MATERIAL E MÉTODOS

Foi utilizada amostra de Salmonella enterica sorovar Enteritidis fagotipo 04, isolada de fígado de matrizes pesadas, resistente a 100mg de ácido nalidíxico (Nal; Nal/ml) (Weinack et al., 1982; Andreatti Filho et al., 1993). O inóculo nos tratamentos consistiu no cultivo bacteriano em caldo infusão de cérebro e coração incubado a 40ºC por 12 horas. Com exceção do grupo-controle negativo, todos os demais receberam 1,2x10⁶ unidades formadoras de colônias (UFC; UFC/ave) da bactéria. O número de UFC do inóculo foi determinado por meio de plaqueamento de 0,1ml da suspensão bacteriana e respectivas diluições decimais em solução tampão de salina fosfatada (PBS) com pH 7,2 em duplicata de ágar verde brilhante acrescido de 100µg de Nal/ml. As aves foram desafiadas por inoculação endoesofágica com 0,5ml da suspensão bacteriana, com auxílio de pipeta de 1ml, no terceiro dia de idade.

Foram utilizados pintos de linhagem comercial de corte, com um dia de idade, identificados e mantidos em gaiolas de arame sob aquecimento. Foi fornecida ração comercial não medicada e água ad libitum, com exceção do grupo que recebeu microbiota cecal anaeróbia liofilizada na água de bebida, durante o período determinado em tratamentos. A ausência de Salmonella spp. nas aves foi testada conforme Mallinson & Snoeyenbos (1989).

Os tratamentos foram realizados durante três dias consecutivos a partir do primeiro dia de idade. Utilizou-se o produto comercial Aviguard ^{® (}Bayer Saúde Animal.) como microbiota liofilizada e a microbiota congelada foi preparada no laboratório de ornitopatologia da FMVZ – UNESP. O produto Aviguard ^® foi administrado na água de bebida uma vez ao dia, conforme recomendação do fabricante. A microbiota congelada foi inoculada uma vez ao dia, com auxílio de pipeta graduada de 1ml, via endoesofágica com 0,5ml da cultura contendo 7,8x10⁸ UFC, determinada pelo plaqueamento de 0,1ml das suspensões em caldo tioglicolato e respectivas diluições decimais em PBS, em duplicata de ágar tioglicolato, cultivados em anaerobiose. A microbiota cecal anaeróbia congelada foi obtida mediante o cultivo de macerado de pool de cecos de três matrizes pesadas com 49 semanas de idade, por 24 horas a 40ºC em anaerobiose em caldo tioglicolato. O cultivo foi filtrado em gaze, acrescido de glicerol na proporção de 1:10, distribuído em alíquotas de 6ml em frascos de vidro com tampa e congelado a -18ºC por não mais que 96 horas. Para uso, os frascos foram descongelados em estufa de cultivo à temperatura de 40ºC. A microbiota foi estudada quanto à presença de Salmonella spp. conforme Mallinson & Snoeyenbos (1989).

Foram utilizados quatro grupos de 20 pintos, assim distribuídos: grupo que recebeu microbiota cecal liofilizada (MCL) e desafiado com S. Enteritidis, grupo que recebeu microbiota cecal congelada (MCC) e desafiado com S. Enteritidis, grupo controle-positivo, somente desafiado com S. Enteritidis e grupo-controle negativo, que não recebeu nenhum tratamento ou desafio. Aos dois, sete e 12 dias após o desafio, cinco aves foram retiradas de cada grupo para pesagem e colheita de material.

A colonização do trato digestivo foi determinada por meio de cultivo direto do inglúvio, duodeno e ceco, com auxílio de suabe em ágar verde brilhante Nal (Weinack et al., 1982; Andreatti Filho et al., 1993), e quantificada pela intensidade de crescimento bacteriano, sendo 0,1 a 1 para crescimento de 1 a 10 UFC, 1,1 a 2, de 11 a 50 UFC, 2,1 a 3, de 51 a 100 UFC e 4, acima de 100 UFC (Andreatti Filho et al., 1997, 2000).

A quantificação da excreção bacteriana nas fezes foi realizada em amostras colhidas em folhas de papel alumínio, colocadas sob as gaiolas na noite anterior às colheitas, em período nunca superior a 12 horas. Dez gramas de fezes de cada grupo experimental foram suspensos em 100ml de PBS e diluições decimais para a enumeração bacteriana por plaqueamento de 0,1ml em duplicata de placas de Petri contendo ágar verde brilhante Nal, cultivadas durante 24 horas à temperatura de 40ºC.

Todas as aves foram pesadas individualmente no primeiro dia de idade e posteriormente, nos períodos de dois, sete e 12 dias após o desafio, para obtenção do peso médio das aves em cada tratamento.

A presença da bactéria nas fezes foi determinada pela prova não-paramétrica de Friedman no nível de 5% de significância, sendo o dia de colheita dos dados considerado como bloco. Utilizou-se a prova de Kruskal-Wallis entre os grupos em cada tempo na análise da bactéria nos segmentos do trato digestivo. Para a comparação dos ganhos de peso relativo utilizou-se a análise de variância em delineamento inteiramente ao acaso com quatro tratamentos, e aplicou-se o teste de Tukey no nível de 5% de significância para as comparações múltiplas (Zar, 1996).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O uso de MCL ou MCC não reduziu a colonização do trato digestivo das aves (Tab.1). A colonização foi mais persistente no ceco, inglúvio e duodeno, nessa ordem, independente dos tratamentos utilizados. No ceco, local de maior persistência e quantificação da amostra bacteriana, houve redução significativa nos grupos tratados com MCL ou MCC em relação ao tempo após desafio, pois em ambos, no período de 12 dias após o desafio, o número de UFC foi significativamente menor do que o observado nos períodos de dois e sete dias após o desafio, fato que não ocorreu com o grupo-controle positivo. Qualquer indício de que o uso de probiótico reduz a colonização por Salmonella spp. reforça a necessidade de estudos que esclareçam e aprimorem ainda mais a ação desses produtos. Não houve variação significativa entre os tratamentos com MCL e MCC nos parâmetros pesquisados.

A colonização por S. Enteritidis nos diversos segmentos do trato digestivo das aves mostra que a infecção foi autolimitante, como observado por Barrow et al. (1988) e Andreatti Filho et al. (1997, 2000), considerando que a quantidade da bactéria durante a experimentação foi sempre decrescente, independente dos tratamentos.

A infecção do trato digestivo das aves foi mais eficaz e persistente no ceco, inglúvio e duodeno, nessa ordem, locais de importância na patogenia das infecções paratifóides das aves (Hargis et al., 1995; Andreatti Filho et al., 1997, 2000). O ceco é o local de maior colonização por Salmonella spp. e por outras espécies patogênicas da família Enterobacteriaceae, como Escherichia coli, quando comparado com outros locais do trato digestivo (Andreatti Filho et al., 1993) e sua colonização é utilizada como parâmetro para avaliar a eficácia de tratamentos contra salmonelose. Essa característica relaciona-se com a presença de receptores específicos no órgão, fisiologia do peristaltismo cecal determinando maior tempo de permanência do bolo alimentar e pH, entre outros fatores (Corrier et al., 1990).

Quanto à excreção fecal, os tratamentos com MCL ou MCC não reduziram a bactéria nas fezes em relação ao grupo-controle positivo. Os índices de colonização observados no ceco foram inferiores nos grupos tratados, quando comparados com os do grupo-controle positivo, ou seja, diferença a mais para o grupo-controle de 1,0 no período de dois dias, 0,8 no de sete dias e 1,6 no de 12 dias após o desafio. Na excreção fecal houve diferença entre os três períodos de análise, de 2,6UFC/grama de fezes a mais para o grupo-controle.

A ação da microbiota intestinal cultivada em anaerobiose e administrada diretamente às aves já teve sua eficácia comprovada em relação a diversos sorovares de Salmonella (Snoeyenbos et al., 1985; Corrier et al., 1994; Hollister et al., 1994ab, 1995; Andreatti Filho et al., 1997, 1999, 2000). Entretanto, para a comercialização dos probióticos há necessidade de que eles permaneçam viáveis após período de armazenamento, sendo a liofilização e o congelamento as formas mais utilizadas até o momento. Pivnick et al. (1982) demonstraram que embora o cultivo fresco da microbiota intestinal seja mais consistente na proteção contra S. Typhimurium quando comparado com as formas liofilizada ou congelada, sob algumas condições a proteção por essas últimas podem igualar-se à proporcionada pelo cultivo fresco. Hollister et al. (1994ab, 1995) demonstraram que a liofilização da microbiota intestinal em leite em pó, sacarose e albumina de soro de bovino proporciona à microbiota condições favoráveis quanto à redução da colonização pela S. Typhimurium em aves.

O peso corporal das aves não diferiu entre os grupos tratados e o controle positivo (Tab. 2). O controle negativo diferiu dos demais tratamentos, ou seja, as aves que não foram desafiadas com S. Enteritidis apresentaram peso médio de 430 gramas, superior em 49, 61 e 89 gramas ao dos MCL, MCC e controle positivo, respectivamente. Os grupos tratados com MCL e MCC apresentaram 40 e 27,8 gramas a mais do que o controle positivo, respectivamente. Em condições naturais de criação e até mesmo experimentais (Andreatti Filho et al., 1999) a presença de salmonelas paratifóides não interfere na produtividade de frangos de corte.

CONCLUSÕES

Microbiota cecal anaeróbia liofilizada e microbiota cecal anaeróbia congelada não reduziram a colonização do trato digestivo e a excreção fecal da Salmonella enterica sorovar Enteritidis. Os tratamentos com MCL ou MCC minimizaram a redução no ganho de peso médio das aves. Os cecos, seguidos pelo inglúvio e duodeno, foram os segmentos do trato digestivo mais colonizados por S. Enteritidis.

• ANDREATTI FILHO, R.L.; SILVA, E.N.; BALEN, L. Efeito da via de inoculação na patogenicidade de amostras patogênica e apatogênica de Escherichia coli em galinha. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.45, p.475-486, 1993.
• ANDREATTI FILHO, R. L.; SILVA, E.N.; CURI, P.R. Ácidos orgânicos e microbiota cecal anaeróbia no controle da infecção experimental de frangos por Salmonella typhimurium e Salmonella enteritidis Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.49, p.661-672, 1997.
• ANDREATTI FILHO, R.L.; MESTRINEL JÚNIOR, P.; SAMPAIO, H.M. et al. Efeito da vacina contra coccidiose sobre a colonização de Salmonella enteritidis em aves inoculadas com microbiota cecal anaeróbia. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.51, p.311-316, 1999.
• ANDREATTI FILHO, R.L.; SILVA, E.N.; RIBEIRO, A.R. et al. Use of anaerobic cecal microflora, lactose and acetic acid for the protection of broiler chicks against experimental infection with Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis. Braz. J. Microbiol., v.31, p.107-112, 2000.
• BARROW, P.A.; SIMPSON, J.M.; LOVELL, M.A. Intestinal colonisation in the chicken by food-poisoning Salmonella serotypes; microbial characteristics associated with faecal excretion. Avian Pathol., v.17, p.571-588, 1988.
• CORRIER, D.E.; HINTON Jr., A.; ZIPRIN, R.L. et al. Effect of dietary lactose on cecal pH, bacteriostatic volatile fatty acids and Salmonella typhimurium colonization of broiler chicks. Avian Dis., v.34, p.617-625, 1990.
• CORRIER, D.E.; HOLLISTER, A.G.; NISBET, D.J. et al. Competitive exclusion of Salmonella Enteritidis in leghorn chicks: comparison of treatment by crop gavage, drinking water, spray or lyophilized alginate beads. Avian Dis., v.38, p.297-303, 1994.
• HARGIS, B.M.; CALDWELL, D.J.; BREWER, R.L. et al. Evaluation of the chicken crop as a source of Salmonella contamination for broiler carcasses. Poult. Sci., v.74, p.1548-1552, 1995.
• HOLLISTER, A.G.; CORRIER, D.E.; NISBET, D.J. et al. Comparison of effects of chicken cecal microorganisms maintained in continuous culture and provision of dietary lactose on cecal colonization by Salmonella typhimurium in turkey poults and broiler chicks. Poult. Sci., v.73, p.640-647, 1994a.
• HOLLISTER, A.G.; CORRIER, D.E.; NISBET, D.J. et al. Effect of cecal cultures lyophilized in skim milk or reagent 20 on Salmonella colonization in broiler chicks. Poult. Sci., v.73, p.1409-1416, 1994b.
• HOLLISTER, A.G.; CORRIER, D.E.; NISBET, D.J. et al. Effect of lyophilization in sucrose plus dextran and rehydration in thioglycollate broth on performance of competitive exclusion cultures in broiler chicks. Poult. Sci., v.74, p.586-590, 1995.
• MALLINSON, E.T.; SNOEYENBOS, G.H. Salmonellosis. In: PURCHASE, H.G. (Ed). A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens Kennett Square: University of Pennsylvania. The American Association of Avian Pathologists, 1989. p.3-11.
• NISBET, D.J.; RICKE, S.C.; SCANLAN, C.M. et al. Inoculation of broiler chicks with a continuous-flow derived bacterial culture facilitates early cecal bacterial colonization and increases resistance to Salmonella typhimurium J. Food Protect., v.57, p.12-15, 1994.
• NURMI, E.; RANTALA, M. New aspects of Salmonella infection in broiler production. Nature, v.241, p.210-211, 1973.
• PIVNICK, H.; BLANCHFIELD, B.; RIGBY, C. et al. Comparison of fresh feces with lyophilized and frozen cultures of feces as inocula to prevent Salmonella infection in chicks. J. Food Protect., v.45, p.1188-1194, 1982.
• SNOEYENBOS, G.H.; WEINACK, O.M.; SOERJADI-LIEM, A.S. et al. Large-scale trials to study competitive exclusion of Salmonellae in chickens. Avian Dis., v.29, p.1004-1011, 1985.
• WEINACK, O.M.; SNOEYENBOS, G.H.; SMYSER, C.F. et al. Reciprocal competitive exclusion of Salmonella and Escherichia coli by native intestinal microflora of the chicken and turkey. Avian Dis., v.26, p.585-595, 1982.
• ZAR, J.H. Bioestatistical analysis 3.ed. New Jersey: Prentice-Hall, 1996. 657p.
• ZIPRIN, R.L.; CORRIER, D.E.; DeLOACH, J.R. Control of established Salmonella typhimurium intestinal colonization with in vivo-passaged anaerobes. Avian Dis., v.37, p.183-188, 1993.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Mar 2003
• Data do Fascículo
  Out 2002

Histórico

• Revisado
  05 Jun 2002
• Recebido
  28 Nov 2001