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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.54 no.5 Belo Horizonte Oct. 2002

https://doi.org/10.1590/S0102-09352002000500018 

COMUNICAÇÃO

[Communication]

 

Teste de DNA para verificação de parentesco em cães - avaliação do método não automatizado com o auxílio do primer CMR S

[DNA test for parentage verification in dogs - evaluation of the non-automatized method with assistance of the primer CMR S]

 

P.F. Oliveira, D.A.A. Oliveira, C.S. Teixeira, A.P.S. Velloso, E.G.A. Coelho, S.G. Rodrigues, C. Alves

Escola de Veterinária da UFMG
Caixa Postal 567
30161-970 - Belo Horizonte, MG

 

Recebido para publicação em 21 de junho de 2001
Recebido para publicação, após modificações, em 8 de julho de 2002
*Autor para correspondência
E-mail: denise@vet.ufmg.br

 

 

Em criações de cães é tradicional o uso de pedigrees para estimar parentesco. No entanto, tal procedimento pode resultar em estimativas errôneas, havendo casos em que um grupo de indivíduos pode apresentar coeficiente de endogamia igual a zero, o que no caso de cães é praticamente impossível, evidenciando que muitos pedigrees podem conter erros (Koskinen & Bredbacka, 2000). Atualmente, questões sobre identidade biológica são solucionadas por meio dos genes, sendo osmicrossatélites muito utilizados para resolver problemas de paternidade. Por esse motivo, além do estabelecimento de painéis de microssatélites, mundialmente padronizados para testes de paternidade em cães, torna-se também imprescindível a utilização da metodologia de teste adequada. Duas são as possibilidades para a realização e análise das corridas eletroforéticas: técnica automatizada (utilizando-se sequenciador de DNA, com leitura a laser das seqüências marcadas por fluorescência) ou não-automatizada (empregando-se cubas de tamanhos variados e coloração dos géis por nitrato de prata ou brometo de etídio, seguida de leitura visual ou com o auxílio de um sistema de análise de géis).

No Brasil a introdução de testes para verificação de parentesco por DNA em cães é recente, o que tem atraído o interesse de muitos laboratórios para a prestação de tal serviço. No entanto, alguns acreditam que a técnica não automatizada pode ser usada com sucesso, fornecendo resultados confiáveis. Considerando essa possibilidade, e sabendo da importância futura que poderão vir a ter esses laudos, procurou-se mostrar os problemas provenientes da adoção de tal metodologia, mesmo quando as leituras dos testes são feitas com o auxílio de um analisador automático de géis.

Para a análise foram colhidas amostras de pêlos com bulbos íntegros de 105 animais da raça Rottweiler (39 animais compondo 11 famílias completas - pai-mãe-filho - e 66 cães não aparentados até a segunda geração). As amostras foram tomadas ao acaso em diferentes canis dos estados de Minas Gerais e São Paulo, sendo mantidas à temperatura ambiente até a extração do DNA. A técnica de extração utilizada foi a permanente para pêlos, segundo protocolo do Veterinary Genetics Laboratorie (VGL) – UCDavis, Califórnia. Para permitir boa visualização dos alelos o primer CMR S (Shibuya et al., 1994) foi escolhido por apresentar diferença de comprimento de três pares de bases entre eles, suficiente para distinção por leitura visual. Para a amplificação empregou-se: 1,0µl de tampão 10X (50mM KCl, 10mM Tris-HCl pH8,3) com MgCl (Gibco) (1,5mM), 0,5µl de dNTPs (Gibco) (5,0mM), 0,4µl do primer F (5,0mM), 0,4µl do primer R (5,0mM), 0,14µl de Taq DNA polimerase (Promega) (5u/ul), 2,0µl (diluído a 10%) de DNA genômico extraído e 5,56µl de água Mili Q estéril qsp. As temperaturas utilizadas foram 94ºC para desnaturação, 62ºC para anelamento e 72ºC para extensão por 30 ciclos. A corrida eletroforética foi realizada em gel de poliacrilamida 8% por sete horas a 100 Volts. O método de coloração empregado foi o do nitrato de prata. Após a coloração os géis foram fotografados usando-se câmera digital (Sony Digital Mavica-MVC-FD5). As fotografias foram analisadas pelo programa Kodak Digital Science-1D Image Analysis Software. O peso molecular das bandas foi definido a partir do peso molecular padrão usado (pGEM Promega-2645-51).

A pesquisa nos animais não aparentados permitiu que se conferisse quantos, dos alelos internacionalmente reconhecidos, para o primer CMR S estavam presentes na amostragem em análise. Esse microssatélite apresenta oito alelos conhecidos, cujos tamanhos variam entre 151 e 193 pares de bases. Todos os oito foram observados nos indivíduos não aparentados. Somente três (151, 157 e de 175 pares de bases) não foram observados nas famílias estudadas. Com o auxílio do programa Kodak Digital Science-1D Image Analysis Software, foi possível identificar diversos problemas na análise das corridas eletroforéticas. O primeiro diz respeito à diferenças observadas dentro de um mesmo gel. Isso pode ser visto na Fig.1, onde amostras do mesmo animal (nº 26) foram corridas duas vezes, em diferentes canaletas. Nesse caso, duas leituras distintas foram feitas para esse animal: 178/178 e 181/181 pares de bases (diferença incapaz de ser percebida a olho nu). Segundo Ferreira & Grattapaglia (1996), tais diferenças dentro de um mesmo gel podem estar relacionadas a um grande número de variáveis, entre elas à formação de bolhas de ar, que impedem a passagem uniforme do tampão de corrida através do gel. Atualmente já se encontram no mercado seqüenciadores automáticos de DNA que utilizam o sistema de capilares para as corridas, e não mais os géis. Isso evitaria tal problema.

 

 

Outro problema identificado foram as diferenças de interpretação entre géis. No gel da Fig. 2, a família representada pelos números 6 (pai), 7 (filho) e 8 (mãe) apresentou os seguintes genótipos: animal 6, 193/193 pb; animal 7, 193/169 pb; e animal 8, 169/169 pb. No entanto, no gel da Fig. 3 essa mesma família apresentou: animal 6, 190/190 pb; animal 7, 190/167 pb; e animal 8, 166/166 pb. Num seqüenciador as condições de corrida seriam padronizadas, evitando qualquer influência do ambiente e, além disso, a leitura a laser seria precisa, identificando corretamente os alelos.

 

 

 

 

Neste experimento as variações observadas num mesmo gel e entre géis distintos expuseram algumas falhas graves do teste não-automatizado. Tais fatos demonstram a imprecisão do método quando utilizado em verificações de parentesco. É também importante ressaltar a importância de se testar membros de uma mesma família (pai- filhos-mãe) em um mesmo gel, já que há diferenças nas corridas eletroforéticas dentro e entre géis. Assim, amenizam-se erros inerentes ao teste não-automatizado. Ainda, um animal não pode ser testado isoladamente num gel para comparação com pais previamente testados em outro. Essa é outra desvantagem do método, inviabilizando seu uso comercial, pois certamente um reprodutor terá filhos a serem confirmados em diferentes ocasiões. Por esse método seria necessário retestar o progenitor junto com sua progênie. Os problemas que um teste não-automatizado pode gerar são ainda maiores quando os animais são cães, pois os microssatélites já estabelecidos para a verificação de paternidade nessa espécie pela ISAG (International Society of Animal Genetics) apresentam, na sua maioria, alelos com apenas um par de bases de diferença, aumentando a chance de subdetecção alélica.

No momento em que o País caminha em direção a novas tecnologias que permitem diagnóstico e análises mais precisas, procedimentos que estão inclusive em processo de normalização, deve-se avaliar criteriosamente as metodologias a serem adotadas, considerando-se principalmente suas implicações diretas nos processos de produção animal.

Palavras-chave: Cão, DNA, teste de verificação de parentesco

 

ABSTRACT

To evaluate the precision of the DNA tests using the non-automatized technique for individual identification and parentage tests, 105 Rottweiler dogs were studied using the primer CMR S. The sample was composed of 39 animals belonging to 11 complete families and their progenies, and 66 non related individuals until the second generation, derived from kennels located in the states of Minas Gerais and São Paulo. The CMR S primer was used for the Polimerase Chain Reaction (PCR). The results showed the inefficiency of the technique, even when analyzed through the automated gel analysis system. Also showed the impossibility of its commercial use due to the fact of does not permit the storage of data for subsequent use.

Keywords: Dog, DNA, parentage tests

 

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 2.ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1996.        [ Links ]

KOSKINEN, M.T., BREDBACKA, P. Assessment the population structure of five Finnish dog breed with microsatellites. Anim. Gen., v.31, p.310-317, 2000.        [ Links ]

SHIBUYA, H., COLLINS, B.K., HUANG, T.H.M. et al. A polymorphic (AGGAAT)n tandem repeat in an intron of the canine von Willebrand factor gene. Anim. Gen., v.25, p.122, 1994.        [ Links ]

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