Taxa de ovulação e concentração plasmática de progesterona em fêmeas bovinas imunizadas com líquido folicular suíno

Number of ovulations and progesterone profile in bovine females immunized against swine follicular fluid

Resumos

O presente estudo objetivou avaliar os efeitos da imunização ativa contra proteínas do líquido folicular suíno sobre a taxa de ovulação, duração do ciclo estral e concentração plasmática de progesterona em vacas e novilhas da raça Limousin. Realizaram-se duas imunizações com 15 dias de intervalo, aplicando-se um imunógeno composto do conteúdo protéico de 25ml de fluido folicular suíno adicionados de 1ml de gel de hidróxido de alumínio, via subcutânea. O número de ovulações foi mensurado por palpação retal e ultra-sonografia sete a nove dias após cada período de estro. Após a última imunização, os animais apresentaram maior incidência de ovulações duplas (41,7%). As médias de ovulações pré e pós-imunização foram 1,00+0,00 e 1,40+0,31 ovulações/ciclo, respectivamente (P<0,01;chi2). A imunização foi efetiva em aumentar o número de ovulações. Não foram observadas diferenças na duração do ciclo estral e na concentração de progesterona nos diferentes dias do ciclo. A manipulação das ações fisiológicas da inibina pode ser utilizada como alternativa para indução de ovulações múltiplas em bovinos.

Bovino; fluido folicular; inibina; ovulação

This study aimed to evaluate the effects of active immunization against swine follicular liquid in Limousin cows and heifers, based on progesterone plasma levels, estrous cycle length and ovulation rate. Two immunization procedures were performed with 15 days interval, administering an immunogenic substance containing the proteic content of 25ml of swine follicular fluid, plus 1ml aluminum hydroxide gel, subcutaneous. The ovulation was measured by rectal palpation and ultra-sonographic evaluation, seven to nine days after each estrus period. Results show that after the last immunization, the animals presented higher double ovulation incidence (41.7%). The average ovulation before and after immunization were 1.00±0.00 and 1.40±0.31 ovulations/cycle, respectively (P<0.01; chi2). The immunization method used was effective to stimulate a higher ovulation number. No differences on mean estrous cycle length and progesterone levels were observed. Physiological inhibin action may be an alternative method to induce multiple ovulations of bovines.

Bovine; follicular fluid; inhibin; ovulation

Taxa de ovulação e concentração plasmática de progesterona em fêmeas bovinas imunizadas com líquido folicular suíno

[Number of ovulations and progesterone profile in bovine females immunized against swine follicular fluid]

C.A.C. Fernandes^I; E. Oba^II; A.M. Ferreira^III; L.F. Uribe-Velaquez^II; J.H.M. Viana^III

^IFaculdade de Medicina Veterinária, Unifenas

IIFaculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Unesp, Botucatu, SP

IIIEMBRAPA – Gado de Leite, Juiz de Fora, MG

Pesquisa financiada pela Fapesp

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O presente estudo objetivou avaliar os efeitos da imunização ativa contra proteínas do líquido folicular suíno sobre a taxa de ovulação, duração do ciclo estral e concentração plasmática de progesterona em vacas e novilhas da raça Limousin. Realizaram-se duas imunizações com 15 dias de intervalo, aplicando-se um imunógeno composto do conteúdo protéico de 25ml de fluido folicular suíno adicionados de 1ml de gel de hidróxido de alumínio, via subcutânea. O número de ovulações foi mensurado por palpação retal e ultra-sonografia sete a nove dias após cada período de estro. Após a última imunização, os animais apresentaram maior incidência de ovulações duplas (41,7%). As médias de ovulações pré e pós-imunização foram 1,00+0,00 e 1,40+0,31 ovulações/ciclo, respectivamente (P<0,01;c²). A imunização foi efetiva em aumentar o número de ovulações. Não foram observadas diferenças na duração do ciclo estral e na concentração de progesterona nos diferentes dias do ciclo. A manipulação das ações fisiológicas da inibina pode ser utilizada como alternativa para indução de ovulações múltiplas em bovinos.

Palavras-chave: Bovino, fluido folicular, inibina, ovulação

ABSTRACT

This study aimed to evaluate the effects of active immunization against swine follicular liquid in Limousin cows and heifers, based on progesterone plasma levels, estrous cycle length and ovulation rate. Two immunization procedures were performed with 15 days interval, administering an immunogenic substance containing the proteic content of 25ml of swine follicular fluid, plus 1ml aluminum hydroxide gel, subcutaneous. The ovulation was measured by rectal palpation and ultra-sonographic evaluation, seven to nine days after each estrus period. Results show that after the last immunization, the animals presented higher double ovulation incidence (41.7%). The average ovulation before and after immunization were 1.00±0.00 and 1.40±0.31 ovulations/cycle, respectively (P<0.01; c²). The immunization method used was effective to stimulate a higher ovulation number. No differences on mean estrous cycle length and progesterone levels were observed. Physiological inhibin action may be an alternative method to induce multiple ovulations of bovines.

Keywords: Bovine, follicular fluid, inhibin, ovulation

INTRODUÇÃO

O líquido folicular é considerado transudado do plasma sangüíneo. Andersen et al. (1976) relataram que todos os componentes do fluido folicular de origem sangüínea, como lipídeos, proteínas e eletrólitos, têm concentração intra-folicular relacionada à plasmática. Algumas outras substâncias produzidas pelas células foliculares apresentam concentração no líquido folicular, nem sempre diretamente relacionadas à plasmática.

Segundo Ireland (1987) e Turzillo & Fortune (1993), existem no líquido folicular vários outros componentes protéicos, além da albumina, de diferentes pesos moleculares, de origem própria ou plasmática. São também relatados compostos como inibina, em frações de diferentes pesos moleculares, ativina, folistatina e fatores de crescimento (interleucinas, NGF, FGF, TGFa , TGFb, e IGF-1). A concentração dessas substâncias no líquido folicular é variável de acordo com o estádio de desenvolvimento do folículo (Krummen et al.,1993).

A inibina, descrita como hormônio produzido pelos testículos desde 1923, só foi identificada em fêmeas em 1976 (Alvarez, 1995). A inibina é um hormônio glicoprotéico produzido nos testículos pelas células de sertoli e células da granulosa dos folículos ovarianos. Várias formas de inibina, de diferentes pesos moleculares, estão descritas na literatura.

A ação mais conhecida da inibina na reprodução é a de regular os níveis circulantes de FSH, exercendo bloqueio seletivo na síntese da cadeia a dessa glicoproteína na hipófise (Morris et al., 1995). A capacidade de produção de inibina é diretamente proporcional ao tamanho do folículo e à sua atividade (Findlay, 1993). Vários autores relatam relação inversa entre níveis circulantes de inibina e de FSH, sendo a inibina, juntamente com os esteróides ovarianos estrógeno e progesterona, as principais substâncias que controlam a secreção de FSH pela hipófise (Taya et al., 1996).

Para se conseguir maior número de ovulações do que o determinado fisiologicamente na espécie bovina, é necessário induzir o desenvolvimento de folículos que tornar-se-iam subordinados e entrariam em atresia em uma onda de crescimento. Para tal procedimento duas alternativas são possíveis. A mais usual, correspondente aos protocolos atuais, consiste na aplicação exógena de produtos comerciais, geralmente compostos de FSH de origem suína. A outra é impedir a redução nos níveis endógenos de FSH durante uma onda de desenvolvimento folicular, atuando num dos principais elementos que causam essa redução, a inibina. Dessa forma, o controle das atividades da inibina poderia também ser utilizado para indução de superovulação (Fernandes, 2000).

O bloqueio das atividades da inibina "in vivo" poderia ser obtido pela sua imunoneutralização via imunização do animal contra essa molécula. Vários trabalhos demonstram que, após imunização de fêmeas bovinas contra inibina suína, ovina ou fragmentos dessa molécula, ocorrem efeitos de ordem endocrinológica, como aumento nos níveis circulantes de FSH (Taya et al., 1996), alterações na dinâmica folicular com mais de um folículo dominante por onda e aumento na taxa de ovulação (Hillard et al., 1996).

Yang et al. (1996), ao utilizarem 2mg de inibina suína parcialmente purificada para imunização de novilhas, descreveram aumento na taxa de anticorpos e maior número de ovulações. Segundo os autores, os anticorpos formados ligam-se na cadeia a da inibina bovina, bloqueando sua atividade nos animais imunizados.

Quando se utiliza líquido folicular integral como imunógeno para a produção dos anticorpos, é importante lembrar que nele existe uma série de substâncias inibidoras e estimuladoras da função ovariana (Ireland, 1987). Trabalhos mais recentes empregando imunização ativa a partir da inibina de ovinos, ou uma seqüência de aminoácidos da inibina bovina, geralmente da extremidade amino-terminal da cadeia a , parecem exibir resultados mais consistentes (Hillard, 1992).

As alterações fisiológicas provocadas pela imunização, como maior desenvolvimento folicular, maior taxa de ovulação e título de anticorpos contra inibina, praticamente desaparecem 15 a 20 semanas após a última imunização (Glencross et al., 1992). Essa informação é muito importante pelo fato de talvez não se querer maior taxa de ovulação por período indeterminado.

O objetivo do presente trabalho foi verificar o efeito da imunização ativa com proteínas do fluido folicular suíno sobre a dinâmica folicular, o número de ovulações, a duração do ciclo estral e a concentração plasmática de progesterona em vacas e novilhas.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado de março de 1998 a junho de 1999 nas dependências da Fazenda Santa Terezinha, localizada no Município de Fama – MG. Foram utilizados 25 animais, 13 vacas e 12 novilhas da raça Limousin, com idade entre 17 e 42 meses. Os animais receberam a mesma alimentação durante todo o período experimental, composta de silagem de milho e ração comercial, visando balanço energético positivo (Nutrient... 1988). O balanço energético foi acompanhando pela pesagem mensal dos animais e avaliação do escore de condição corporal (ECC), que permaneceu entre 3 e 4 (numa escala de 1 a 5), conforme Ferreira (1990). A observação do estro foi feita diretamente nos piquetes, pelo menos três vezes ao dia, por período não inferior a 20 minutos. O reflexo de imobilidade foi o sinal considerado para determinação do estro.

O imunógeno utilizado foi o conteúdo protéico do líquido folicular suíno, obtido a partir de ovários de porcas, conforme técnica descrita por Alvarez (1995). Os ovários foram coletados em abatedouro até uma hora após o abate. Posteriormente puncionou-se o conteúdo líquido de todos os folículos visíveis macroscopicamente, com o auxílio de uma bomba de vácuo. O líquido folicular foi centrifugado (1200xg por 10 minutos a 4ºC) para separação dos resíduos de células foliculares, hemácias e fibrina. Após a centrifugação, os tubos foram deixados em repouso por 15 minutos para decantação. O sobrenadante foi retirado e acondicionado em alíquotas de 20ml. Foram obtidos cerca de 1200ml de líquido folicular suíno, a partir da punção dos folículos de cerca de 3000 ovários.

Após o descongelamento, o líquido folicular foi processado para extração dos esteróides, pelo método do carvão vegetal ativado. Utilizou-se 1g de carvão ativado (Sigma Chemical) para cada 100ml de líquido folicular, conforme técnica descrita por Fernandes (2000). Antes da mistura com o carvão ativado e após sua remoção por centrifugação, foram retiradas alíquotas de 0,5ml de fluído folicular para dosagem de progesterona e estradiol por radioimunoensaio.

Pequena quantidade do líquido folicular (10ml), após o tratamento com carvão ativado, foi utilizada para isolamento parcial e dosagem das diversas formas de inibina no liquido folicular, conforme Sugino et al. (1992), com algumas modificações. O líquido folicular foi processado em coluna de cromatografia (CNBr-Sepharose 4B – Fast Flow – Pharmacia Biotech), previamente tratada com anticorpos monoclonais contra a fração amino-terminal da inibina humana (Serotec Inc). O material retido foi colhido em única amostra sendo analisado por eletroforese para se identificarem as frações de inibina. Essa solução protéica foi dializada e o conteúdo precipitado e re-diluído em quantidade conhecida de PBS, obtendo-se concentração total constituída das diferentes formas da inibina. Esse procedimento revelou concentração média de 3,028mg de inibina por ml de líquido folicular original. Este valor foi considerado para se calcular a quantidade de imunógeno por ml de fluido folicular.

Para cada imunização foi utilizado o conteúdo protéico proveniente de 25ml de líquido folicular, equivalente a cerca de 75mg de inibina. Os animais receberam duas aplicações do imunógeno com 15 dias de intervalo, diluído em 5ml de PBS, misturados no momento da aplicação a 2ml de hidróxido de alumínio. As aplicações foram feitas por via subcutânea na região cervical, alternando-se o lado entre as imunizações.

A avaliação ultra-sonográfica dos ovários foi feita diariamente até 10 dias após a primeira manifestação de cio, nos períodos antes e após a imunização. Os animais que não foram observados em estro até 20 dias após a última aplicação do imunógeno receberam uma aplicação de 0,530mg de cloprostenol sódico. Foram quantificadas e mensuradas todas as estruturas ovarianas presentes com diâmetro superior a 2mm (sensibilidade do aparelho) (Scaner 100LC - Pie Medicalä - The Netherlands). Antes e após a imunização foram observadas duas manifestações de estro para se caracterizar a duração do ciclo estral em cada um dos períodos.

De cinco vacas e cinco novilhas, escolhidas aleatoriamente, colheu-se sangue diariamente durante o período de um ciclo, antes e após as imunizações.

Para a comparação das variáveis mensuradas antes e após o processo de imunização foi utilizado o teste de "t" para amostras pareadas. A ocorrência média de ovulações duplas entre os dois períodos foi comparada por análise de c²(Zar, 1984). Para as análises utilizou-se o programa SAEG segundo Euclydes (1982).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A dosagem de esteróides do líquido folicular, anterior ao processo de sua extração com carvão ativado, indicou concentração de 155,73ng/ml de progesterona e de 1,91ng/ml de estradiol. Após a extração, a concentração passou para 9,28ng/ml de progesterona e 61,39pg/ml de estradiol, revelando remoção de 94% do total de progesterona e 96,8% do total de estradiol. Este resultado confirma os achados de Sugino et al. (1992) que, em processo semelhante, indicaram que a remoção dos esteróides do líquido folicular pelo método do carvão ativo foi superior a 95%.

O total de inibina utilizada para imunização foi inferior à utilizada em alguns trabalhos (Morris et al., 1993) e superior à citada por outros (Morris et al., 1997). A quantidade de imunógeno baseou-se no trabalho de Hillard et al. (1995), segundo os quais não há diferenças em relação à taxa de ovulação e também a outras variáveis quando se utilizam quantidades de inibina recombinante entre de 62,5 a 500mg para imunização de fêmeas bovinas. Esse mesmo trabalho indicou não haver diferença na resposta de vacas ou novilhas às diferentes doses utilizadas.

Não foram encontradas diferenças (P>0,05) na duração média do ciclo estral entre os dois períodos avaliados. Os ciclos estrais tiveram duração de 18 a 23 dias, 21,91+2,63 e 22,20+3,25 dias para os animais pré e pós-imunização, respectivamente. Foram considerados apenas os ciclos estrais com estro anterior não induzido por análogos sintéticos da PGF2a .

Estes resultados assemelham-se aos de Hillard et al. (1996), que relataram duração dos ciclos estrais entre 18 a 22 dias após a imunização contra inibina, demonstrando que os animais imunizados, mesmo apresentando mais de uma ovulação por ciclo, portanto possuindo mais de um corpo lúteo, não apresentam retardo na luteólise. Isto pode ser constatado pelo perfil de progesterona e duração média do ciclo estral nos dois grupos. É importante salientar que nesse trabalho a média de ovulações foi inferior a três por ciclo, isto é, não houve elevada quantidade de corpos lúteos.

Após a última imunização, os animais apresentaram maior incidência de ovulações duplas. Dos 33 ciclos acompanhados, 15 apresentaram mais de uma ovulação (41,7%). Apenas quatro fêmeas não apresentaram pelo menos uma ovulação dupla. A média de ovulações antes e depois da imunização foi de 1,00+0,00 e 1,40+0,31, respectivamente (P<0,01; c²). Pela ultra-sonografia identificaram-se os corpos lúteos sete a nove dias após um estro natural ou induzido (Fig. 1).

A imunização interrompe parcialmente o "feed back" negativo que a inibina promove sobre a produção e secreção de FSH pela hipófise. Esse mecanismo resulta em maior concentração de FSH, como descrito por Morris et al. (1995), o que ocasiona o desenvolvimento de mais de um folículo até o estádio compatível com a ovulação. Ficou definido que a imunização utilizada foi efetiva em estimular maior número de ovulações, conforme relatado por Hillard et al. (1996) e Morris et al. (1997).

Morris et al. (1997) observaram maior incidência de ovulações duplas (67%) após a imunização por período de até três ciclos estrais após a segunda aplicação do imunógeno. Montovani et al. (1996) relataram 25,8% de incidência de ovulações duplas em novilhas de corte imunizadas ativamente contra um peptídeo da porção amino terminal da inibina. Embora haja referência de várias ovulações em fêmeas bovinas imunizadas contra inibina, a maioria dos trabalhos indica média de duas ovulações por ciclo.

Esse fenômeno de dupla ovulação foi previsto mesmo antes do estro no qual foram formados os corpos lúteos. O acompanhamento ultra-sonográfico prévio mostrou que houve crescimento simultâneo de dois e às vezes três folículos até o diâmetro compatível com a ovulação. Na maioria desses casos ocorreram duas ovulações no estro subseqüente (Fig. 1). Esse fenômeno descrito por alguns autores como co-dominância, pode ocorrer pelo bloqueio da atividade sistêmica da inibina, principalmente sobre os níveis circulantes de FSH. A redução na concentração plasmática de FSH induzida pela inibina, dois a três dias após a emergência de uma onda de crescimento folicular, pode ser considerada como o principal fator que condiciona a atresia dos folículos subordinados dessa onda de crescimento (Morris et al., 1995). Com a atividade da inibina parcialmente bloqueada, os níveis de FSH provavelmente não se reduziram tanto, dando condições potenciais para que mais de um folículo se desenvolvesse.

Em 32% dos ciclos acompanhados pela ultra-sonografia, em animais pós-imunização observou-se que embora dois folículos estivessem se desenvolvendo relativamente juntos, até um diâmetro superior aos demais da mesma onda de desenvolvimento, um iniciou a atresia um a dois dias antes do estro, e somente o outro ovulou.

A concentração média de progesterona medida diariamente durante o ciclo estral não apresentou diferenças (P>0,05) entre os grupos pré e pós-imunização, nos diferentes dias de análise (Fig.2). Observou-se correlação positiva (r=0,4012; P<0,05) entre níveis de progesterona plasmática e número de corpos lúteos, entre os dias 6 e 15 do ciclo estral. Fernandes (1994) cita achado semelhante no mesmo período do ciclo estral, em animais com até quatro ovulações. Baruselli et al. (2000), ao utilizarem novilhas mestiças, mostraram que os animais com maior número de ovulações apresentaram maior concentração plasmática de progesterona nos dias sete e oito do ciclo estral.

Segundo Fernandes (1994) e Wiltbank et al. (1995), existe correlação positiva entre a massa de tecido luteal e a produção de progesterona. Embora neste trabalho os animais do grupo imunizado apresentassem maior número de corpos lúteos (ovulações espontâneas), portanto mais massa luteal, não foi observada maior concentração de progesterona.

A concentração de progesterona foi semelhante á média encontrada na literatura. Fernandes (1994) e Viana (1996) relatam concentrações superiores, enquanto Wiltbank et al. (1995) e Costa (1997) encontraram concentrações inferiores às obtidas neste trabalho. Parte da diferença relatada nos valores da dosagem deste hormônio pode ser atribuída à diferenças da metodologia ou mesmo à sensibilidade das técnicas. Wiseman et al. (1983) relatam que fatores relacionados ao processamento e estocagem das amostras podem afetar a dosagem de progesterona no plasma ou soro. Essas variações podem ocorrer devido ao tempo desde a colheita até o processamento, à forma de centrifugação, à presença e tipo de anticoagulante empregado e ao tempo e temperatura de armazenamento. Essas variáveis dificultam a comparação dos níveis desse e de outros hormônios entre diferentes trabalhos.

CONCLUSÕES

A imunização ativa de fêmeas bovinas da raça Limousin contra proteínas do líquido folicular de fêmeas suínas não altera a duração do ciclo estral, promove maior número de ovulações espontâneas, não afeta as concentrações plasmáticas de progesterona nos diferentes dias do ciclo estral e não induz ovulações que poderiam ser aproveitadas em um programa comercial de superovulação, visando a produção de embriões.

Recebido para publicação em 14 de setembro de 2001

Recebido para publicação, após modificações, em 3 de abril de 2002

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Mar 2003
• Data do Fascículo
  Dez 2002

Histórico

• Recebido
  14 Set 2001
• Aceito
  03 Abr 2002