Efeito da pré-estimulação ovariana sobre características de oócitos após punção folicular em bovinos

Effect of ovarian pre-stimulation on the ultrasound-guided follicular puncture

Efeito da pré-estimulação ovariana sobre características de oócitos após punção folicular em bovinos

[Effect of ovarian pre-stimulation on the ultrasound-guided follicular puncture]

J.H.M. Viana^I; A.M. Ferreira^I; L.S.A. Camargo^I; W.F. Sá^I; C.A.C. Fernandes^II; A.P. Marques Júnior^III

^IEmbrapa Gado de Leite Rua Eugênio do Nascimento, 610, Dom Bosco 36038-330, Juiz de Fora, MG

^IIUniversidade de Alfenas

^IIIUniversidade Federal de Minas Gerais

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Avaliaram-se os efeitos da pré-estimulação ovariana com FSH e da imunização ativa contra inibina suína sobre o número e classificação morfológica de oócitos recuperados por punção folicular. Catorze vacas da raça Gir, pluríparas e não-lactantes, foram distribuídas em: TI – submetidas a pré-estimulação com 250 UI de FSH (n=4), TII – submetidas a imunização ativa contra inibina suína (n=4) e TIII – não tratadas (n=6; controle). Todos os animais tiveram seus folículos com diâmetro superior a três milímetros aspirados uma vez por semana, durante 10 semanas consecutivas. O TI apresentou aumento na população folicular total (P<0,05) e no número de folículos puncionados (P<0,001), porém a taxa de recuperação foi inferior à dos tratamentos II e III (68,8% vs. 78,4% e 76,3%, respectivamente; P<0,01). O TII não afetou as principais características ovarianas, exceto pelo aumento no número de folículos de tamanho médio (P<0,01). O TI produziu maior percentual de oócitos viáveis (77,2% vs. 69,8%; P<0,05) e de oócitos de Grau I (19,8% vs. 11,6%; P<0,001) do que o TIII. Os tratamentos I e II reduziram o percentual de oócitos degenerados (16,4% e 16,8% vs. 22,3%; P<0,05). A pré-estimulação ovariana com FSH demonstrou ser a alternativa mais consistente para aumentar a qualidade dos oócitos recuperados de vacas zebuínas.

Palavras-chave: bovino, Gir, aspiração folicular, inibina, superovulação

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effects of ovarian pre-stimulation with FSH and active immunization against swine inhibin on the number and quality of oocytes recovered by follicular puncture. Pluriparous, non-lactating Gir cows (n=14) were distributed as: TI - pre-treatment with 250 IU of FSH (n=4), TII - active immunization against swine inhibin (n=4) and TIII - not treated (n=6; control group). All animals had their ovarian follicles above three millimeters in diameter aspirated once a week during 10 consecutive weeks. The TI presented an increase in total follicular population (P<0.05) and in the number of punctured follicles (P<0.001), but reduced recovery rate when compared to treatments II and III (68.8% vs. 78.4% and 76.3%, respectively; P<0.01). The TII did not affect the main ovarian characteristics, except for an increase in the number of medium follicles (P<0.01). Treatment I yielded a higher percentage of viable oocytes (77.2% vs. 69.8%; P<0.05) and oocytes Grade I (19.8% vs. 11.6%; P<0.001) than TIII. Both treatments I and II resulted in reduction of the percentage of degenerated oocytes (16.4% and 16.8% vs. 22.3%; P<0.05). Ovarian pre-stimulation with FSH was the most consistent treatment for increasing quality of oocytes recovered from Zebu cattle.

Keywords: cow, Gir breed, follicular aspiration, inhibin, superovulation

INTRODUÇÃO

O conceito de dominância folicular foi inicialmente proposto em primatas para explicar o mecanismo de seleção que bloqueava o estabelecimento de mais de um folículo ovulatório a cada ciclo (Zeleznik, 2001). Este conceito foi posteriormente utilizado em outras classes animais, incluindo ruminantes (Ginther et al., 2001). O mecanismo de dominância folicular foi intensivamente estudado na última década, sendo bem conhecidos seus efeitos sobre a população de folículos subordinados. O estabelecimento de um folículo dominante está associado à redução na concentração plasmática de FSH (Ginther et al., 1999), o que induz a atresia dos demais folículos presentes e bloqueia o recrutamento de novos folículos (Adams et al., 1993). Dessa forma, ocorre redução no número e qualidade dos folículos disponíveis para a produção de embriões in vivo (Rouillier et al., 1996; Kim et al., 2001) e, possivelmente, também in vitro (Rajamahendran et al., 1997).

Uma alternativa para contornar os efeitos negativos do estabelecimento de um folículo dominante sobre a recuperação de oócitos por punção folicular é o tratamento com FSH exógeno, de maneira semelhante ao realizado nos procedimentos convencionais de produção in vivo de embriões. O FSH aumenta o número e o diâmetro médio dos folículos disponíveis para punção (Goodhand et al., 1999) e retarda a seleção do folículo dominante e a atresia dos subordinados (Mihm et al., 1997). Os efeitos da pré-estimulação ovariana pela administração de FSH sobre os resultados da punção folicular, entretanto, são variados, resultando (Goodhand et al., 1999; Sirard et al., 1999) ou não (Gibbons et al., 1994; Bungartz et al., 1995) em aumento do número de oócitos recuperados ou embriões produzidos por doadora por semana.

A imunização ativa ou passiva é outra alternativa para a atenuação da ação biológica da inibina. Esse procedimento foi inicialmente testado em ovelhas, e resultou em aumento na concentração plasmática de FSH (Findlay et al., 1989) e no número de ovulações por ciclo (Mizumachi et al., 1990). A imunização ativa contra a inibina tem sido utilizada para aumentar a taxa de duplas ovulações em bovinos (Scanlon et al., 1993; Morris et al., 1995), e também em associação à superovulação convencional (Kaneko et al., 1992), mas poucos trabalhos avaliaram seu efeito sobre a recuperação de oócitos destinados à produção in vitro de embriões (Konishi et al., 1996).

Objetivou-se avaliar o efeito da imunização ativa contra inibina suína e da administração de hormônio folículo estimulante sobre a recuperação e classificação morfológica de oócitos em vacas da raça Gir submetidas à punção folicular.

MATERIAL E MÉTODOS

O presente experimento foi conduzido entre os meses de setembro e dezembro de 2000, na Estação Experimental da Embrapa Gado de Leite, em Coronel Pacheco, MG. Vacas da raça Gir (n=14), multíparas e não-lactantes, tiveram o ciclo estral sincronizado pela aplicação de duas doses de 0,5mg de cloprostenol sódico (Ciosin^®, Coopers, São Paulo) com intervalo de 11 dias, e receberam implantes auriculares de norgestomet (Crestar^®, Intervet, São Paulo), renovados a cada 14 dias, durante todo o período experimental. Os animais foram sorteados entre os tratamentos I, II ou III, sendo submetidos à punção folicular uma vez por semana, durante 10 semanas consecutivas. No tratamento I (TI), os animais (n=4) receberam 250 UI de hormônio folículo estimulante (Pluset^®, Callier, São Paulo), distribuídos em seis aplicações em doses decrescentes (75, 50, 50, 25, 25 e 25 UI), administradas a cada 12 horas nos três dias que precederam às sessões de punção. No tratamento II (TII), os animais (n=4) foram submetidos à imunização ativa contra inibina suína (Inhibin, Sigma, USA), pela aplicação de 500UI, conjugada com soro de coelho livre de esteróides e acrescida de 1ml de adjuvante de Freund (Freund’s Adjuvant Complete, Sigma, USA). O imunógeno foi administrado por via subcutânea na região escapular. Fez-se uma aplicação inicial de 300 UI na semana anterior ao início do período de tratamento, e duas de reforço de 100 UI, administradas em intervalos de 21 dias, segundo esquema proposto por Fernandes et al. (2000). No tratamento III (TIII), os animais (controle; n=6) foram divididos em dois subgrupos, sendo o primeiro submetido à punção no mesmo dia do grupo tratado com FSH (às quintas feiras) e o segundo no mesmo dia do grupo imunizado contra inibina (às terças feiras). Nestes subgrupos não houve qualquer pré-tratamento estimulatório, mas apenas injeções de salina estéril (placebo) no mesmo esquema de TI e TII.

As punções foliculares foram realizadas utilizando-se aparelho de ultra-sonografia equipado com transdutor setorial intravaginal de 5/7,5 MHz e dispositivo-guia para punção folicular. Folículos com diâmetro superior a três milímetros foram identificados, mensurados e puncionados utilizando-se agulhas 19G e pressão de vácuo de 80mm Hg, correspondendo a um fluxo aproximado de 14ml de água/minuto. O líquido folicular aspirado foi inicialmente recuperado em tubos plásticos de 50ml, contendo de 10 a 15ml de DPBS acrescido de soro fetal bovino e heparina, sendo os oócitos posteriormente separados em filtro de coleta de embriões com malha de 80m . Os complexos cumulus-oócito (COCs) recuperados foram transferidos para placas de cultivo contendo meio Talp-Hepes e classificados com base em seu aspecto morfológico, conforme Bols et al. (1996).

O efeito dos tratamentos sobre diferentes características da população folicular, sobre o número de folículos puncionados e de estruturas recuperadas foi avaliado por análise de variância, e diferenças entre médias comparadas pelo teste Tukey. Diferenças na classificação dos complexos cumulus-oócito recuperados foram determinadas pelo método do qui-quadrado. As análises foram realizadas com auxílio do software SAS, v. 8.02 (The SAS System For Information Delivery, SAS Institute Inc.). Os resultados foram apresentados na forma de média± erro padrão da média.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A pré-estimulação com FSH resultou em aumento na população folicular total (P<0,05), no diâmetro do segundo maior folículo (P<0,001) e no número de folículos com diâmetros de seis a oito milímetros (P<0,001) e superior a nove milímetros (P<0,001) no momento da punção folicular em relação a TIII. A redistribuição da população folicular em classes conforme o tamanho foi semelhante à observada por outros autores, os quais utilizaram protocolos semelhantes (Stubbings, Walton, 1995; Goodhand et al., 1999), e também à obtida durante a indução da superovulação, cujo objetivo era a coleta de embriões in vivo (Viana et al., 1999). Ela caracteriza a ação do FSH sobre o desenvolvimento folicular (Fig. 1). O maior diâmetro do folículo facilitou sua localização ultra-sonográfica e seu posicionamento na linha de biópsia. Como resultado do maior número de folículos presentes e da maior facilidade para a execução de técnica, observou-se também aumento (P<0,05) do número de folículos puncionados após a pré-estimulação com FSH.

Figura 1

A imunização ativa contra inibina suína não afetou (P>0,05) as principais características da população folicular, quando comparada com as características da população do tratamento-controle, exceto pelo aumento no número de folículos de tamanho médio (de seis a oito milímetros), que foi semelhante (P>0,05) ao observado no tratamento I. Esse aumento possivelmente é atribuído à elevação na concentração plasmática de FSH, porém de menor magnitude ou duração do que a subseqüente ao uso do FSH exógeno. Essa hipótese foi confirmada pela observação de que a população folícular total e o número de folículos puncionados não diferiram (P>0,05) entre os tratamentos I e II. De fato, a imunização contra a inibina resultou em aumento no número de ovulações por ciclo (Scanlon et al., 1993; Morris et al., 1995), porém não comparável ao induzido pela superovulação (Kohram et al., 1998). Glencross et al. (1994) observaram que as alterações no crescimento folicular após a imunização estavam associadas apenas a discretos aumentos na liberação de FSH.

Ao contrário do que seria esperado pela maior facilidade de localização ultra-sonográfica e aspiração dos folículos presentes, a taxa de recuperação no tratamento I foi inferior à observada nos tratamentos II e III (P<0,01). Apesar do maior número de folículos presentes e puncionados após a pré-estimulação com o FSH (Tab. 1), o número de estruturas recuperadas foi semelhante (P>0,05) entre os tratamentos. Lonergan et al. (1994) e Seneda et al. (2001) também observaram relação inversa entre diâmetro folicular e taxa de recuperação oocitária.

Uma explicação para este resultado é a possibilidade de colabamento da parede de folículos maiores antes da aspiração completa do seu conteúdo, levando ao encarceramento do oócito. Folículos de maior diâmetro também apresentam maior viscosidade em seu conteúdo, pela formação de massa gelatinosa em torno do COC e pela descamação de células da granulosa da parede folicular. A pressão de vácuo utilizada neste trabalho (80mm Hg), portanto, pode ter sido insuficiente para a aspiração efetiva do conteúdo folicular.

A pré-estimulação com FSH aumentou a proporção de COCs recuperados classificados como viáveis (77,2% vs. 69,8%; P<0,05) e de Graus I e II (19,8% vs. 11,6%; P<0,001) em comparação com a proporção do tratamento-controle (Fig. 2), resultado semelhante ao obtido por Goodhand et al. (1999). Os folículos recrutados a cada onda de crescimento dependem do FSH para o seu desenvolvimento, que por sua vez flutua ao longo do ciclo estral em função do estabelecimento e regressão dos folículos dominantes (Ginther et al., 1999). A administração de FSH exógeno compensou essa flutuação, garantindo aporte gonadotrófico apropriado para o desenvolvimento folicular, o que resultou em aumento da taxa de crescimento e/ou redução da atresia dos folículos subordinados, e na melhor qualidade dos COCs recuperados.

Gibbons et al. (1994) e Bungartz et al. (1995) não observaram diferenças na qualidade dos oócitos entre vacas pré-estimuladas ou não com FSH. Esses autores realizaram punções em intervalos mais curtos (duas vezes por semana), sendo a aplicação de FSH realizada no início do período de emergência de uma nova onda. Neste caso, a presença de concentração elevada de FSH endógeno, característica desse período (Kulick et al., 1999), pode ter limitado os possíveis efeitos benéficos da pré-estimulação hormonal. Rajamahendran et al. (1997) observaram que a presença de um folículo dominante reduz a resposta ao tratamento com FSH antes da aspiração folicular. Esses autores realizaram o tratamento oito a 14 dias após a ovulação, enquanto que no presente experimento o tratamento foi iniciado três dias após a sessão de punção precedente. Sirard et al. (1999) observaram que a eficácia da estimulação hormonal depende da interação entre dose total, esquema de aplicação, momento do início do tratamento e intervalo entre o fim do tratamento e a aspiração dos folículos.

Outro fator que pode ter influído na qualidade dos oócitos é o maior diâmetro folicular observado no tratamento I. Isto significa maior volume de líquido folicular aspirado durante o procedimento de punção, e reduz a ocorrência de turbulências dentro do circuito em função da passagem do sistema de vácuo fechado para o sistema aberto, durante a retirada da agulha do ovário (Horne et al., 1996). A aspiração de folículos maiores também reduz a proporção relativa de sangue dentro do sistema, o que reduz a densidade e a viscosidade do aspirado e contribui para a manutenção do fluxo laminar no sistema. Esses fatores podem ter contribuído para preservar os COCs do tratamento I durante a passagem pelo circuito de coleta, evitando a perda de camadas celulares pelo desnudamento do cumulus decorrentes da turbulência no sistema de aspiração (Bols et al., 1996; Horne et al., 1996).

Tanto a pré-estimulação com FSH como a imunização ativa contra a inibina reduziram o percentual de oócitos degenerados em relação ao tratamento com placebo (16,4% e 16,8% vs. 22,3%, respectivamente; P<0,05) de forma coerente com os resultados observados sobre o desenvolvimento folicular em ambos os tratamentos. Este resultado sugere efeito positivo da imunização sobre o desenvolvimento dos COCs, mesmo induzindo crescimento folicular menos evidente do que o induzido pelo FSH exógeno, ou que a metodologia adotada para quantificar seu efeito sobre a população folicular não foi suficientemente sensível. A inibina apresenta ações autócrinas e parácrinas durante o desenvolvimento e seleção folicular, reduzindo a esteroidogênese e a ação dos fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF) nos folículos subordinados (Findlay, 1993). Dessa forma, a imunização pode ter contribuído para manter a viabilidade e preservar os folículos da atresia. Entretanto, os eventuais efeitos da imunização contra a inibina na regulação intra-ovariana do crescimento folicular não são bem conhecidos (Scanlon et al., 1993).

A imunização ativa contra a inibina suína resultou em inesperado aumento no percentual de COCs expandidos (17,8% vs. 6,4% e 8.0% nos tratamentos I e III, respectivamente; P<0,001). A expansão do cumulus ocorre naturalmente nos estádios finais da maturação folicular, sob efeito do LH, mas também em folículos em atresia (Salamone et al., 1999). Considerando-se a redução no número de estruturas degeneradas no tratamento II em relação à do tratamento III, e o fato de que os tratamentos foram realizados na presença de implantes auriculares de norgestomet, outros fatores que não a estimulação gonadotrófica podem ter contribuído para induzir o aumento observado no número de COCs expandidos.

CONCLUSÕES

A pré-estimulação ovariana com FSH mostrou ser uma alternativa para melhorar a qualidade morfológica, mas não o número dos COCs recuperados por punção folicular em vacas da raça Gir. A imunização ativa contra inibina pelo protocolo utilizado não apresentou resultados benéficos na recuperação de COCs pela punção folicular.

Recebido para publicação em 10 de maio de 2002

Recebido para publicação, após modificações, em 18 de outubro de 2002

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Abr 2003
• Data do Fascículo
  Fev 2003

Histórico

• Aceito
  18 Out 2002
• Recebido
  10 Maio 2002