Criopreservação do sêmen testicular do teleósteo piau-açu Leporimus macrocephalus

Testicular sperm cryopreservation of the teleost 'piau-açu' Leporinus macrocephalus

Resumos

Avaliaram-se metodologias de criopreservação para o sêmen do piau-açu Leporinus macrocephalus (Teleostei, Anostomidae). O volume de sêmen coletado diretamente dos testículos de seis peixes (446,7±165,1g de peso corporal) foi de 0,4±0,2 ml. Testou-se a toxicidade dos crioprotetores dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida, propilenoglicol, etilenoglicol e metanol nas concentrações de 5%, 10% e 15%. DMSO, dimetilacetamida e propilenoglicol foram os menos tóxicos e, por isso, utilizados na criopreservação do sêmen. Para este teste, o sêmen foi diluído 1:8 (v:v) em soluções de cada crioprotetor(8,9%, concentração final) às quais adicionaram-se gema de ovo de galinha (8,9%, concentração final), glicose (5%) e água destilada (75%). A mistura foi então envasada em palhetas de 5ml de capacidade e imediatamente colocada em botijão de vapor de nitrogênio líquido. A taxa de motilidade espermática pós-descongelamento mais alta (40,8<FONT FACE=Symbol>±</FONT> 13,6 %) foi obtida com sêmen criopreservado em diluente contendo DMSO e ativado em solução de NaHCO3 119mM. A taxa de fertilização, correspondente a 84,3±9,4% do controle, foi obtida com ovócitos de piau-açu fertilizados com sêmen congelado em solução de DMSO (8%, concentração final).

peixe; Piau-açu (Leporinus macrocephalus); criopreservação de sêmen

Methods for cryopreservation of 'piau-açu' Leporinus macrocephalus (Teleostei, Anostomidae) sperm were evaluated. Sperm collected directly from the testes of six fish (446.7±165.1g of body weight) yielded 0.4±0.2 ml. The toxicity of the cryoprotectants dimethyl sulphoxide (DMSO), dimethyl acetamide, propylene glycol, ethylene glycol and methanol, at concentrations of 5%, 10% and 15%, was tested. DMSO, dimethyl acetamide and propylene glycol were the least toxic and were used to freeze the sperm. Sperm was diluted 1:8 (v:v) in solutions made of 8.9% (final concentration) of one of those crioprotectants to which 8.9% (final concentration) of chicken yolk egg, 5% glucose and 75% distilled water were added. The mixture was then poured into 0.5-ml capacity straws and immediately deepened into a cryogenic shipper containing only liquid nitrogen vapor. The highest frozen/thawed sperm motility rate (40.8<FONT FACE=Symbol>±</FONT> 13.6 %) was obtained with sperm cryopreserved in the DMSO containing diluent and activated in 119 mM NaHCO3. Piau-açu eggs fertilized with sperm previously cryopreserved in solution containing 8% (final concentration) DMSO yielded a rate of fertilization of 84.3 ± 9.4% of the control.

fish; 'Piau-açu' (Leporinus macrocephalus); sperm cryopreservation

Criopreservação do sêmen testicular do teleósteo piau-açu Leporimus macrocephalus

[Testicular sperm cryopreservation of the teleost 'piau-açu' Leporinus macrocephalus]

R.I.M.A. Ribeiro^I; H.P. Godinho^II

^IInstituto de Ciências Biológicas da UFMG

^IIPrograma de Pós-graduação em Zoologia de Vertebrados Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais Avenida Dom José Gaspar, 500 30535-610, Belo Horizonte, MG

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Avaliaram-se metodologias de criopreservação para o sêmen do piau-açu Leporinus macrocephalus (Teleostei, Anostomidae). O volume de sêmen coletado diretamente dos testículos de seis peixes (446,7±165,1g de peso corporal) foi de 0,4±0,2 ml. Testou-se a toxicidade dos crioprotetores dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida, propilenoglicol, etilenoglicol e metanol nas concentrações de 5%, 10% e 15%. DMSO, dimetilacetamida e propilenoglicol foram os menos tóxicos e, por isso, utilizados na criopreservação do sêmen. Para este teste, o sêmen foi diluído 1:8 (v:v) em soluções de cada crioprotetor(8,9%, concentração final) às quais adicionaram-se gema de ovo de galinha (8,9%, concentração final), glicose (5%) e água destilada (75%). A mistura foi então envasada em palhetas de 5ml de capacidade e imediatamente colocada em botijão de vapor de nitrogênio líquido. A taxa de motilidade espermática pós-descongelamento mais alta (40,8± 13,6 %) foi obtida com sêmen criopreservado em diluente contendo DMSO e ativado em solução de NaHCO₃ 119mM. A taxa de fertilização, correspondente a 84,3±9,4% do controle, foi obtida com ovócitos de piau-açu fertilizados com sêmen congelado em solução de DMSO (8%, concentração final).

Palavras-chave: peixe, Piau-açu (Leporinus macrocephalus), criopreservação de sêmen

ABSTRACT

Methods for cryopreservation of 'piau-açu' Leporinus macrocephalus (Teleostei, Anostomidae) sperm were evaluated. Sperm collected directly from the testes of six fish (446.7±165.1g of body weight) yielded 0.4±0.2 ml. The toxicity of the cryoprotectants dimethyl sulphoxide (DMSO), dimethyl acetamide, propylene glycol, ethylene glycol and methanol, at concentrations of 5%, 10% and 15%, was tested. DMSO, dimethyl acetamide and propylene glycol were the least toxic and were used to freeze the sperm. Sperm was diluted 1:8 (v:v) in solutions made of 8.9% (final concentration) of one of those crioprotectants to which 8.9% (final concentration) of chicken yolk egg, 5% glucose and 75% distilled water were added. The mixture was then poured into 0.5-ml capacity straws and immediately deepened into a cryogenic shipper containing only liquid nitrogen vapor. The highest frozen/thawed sperm motility rate (40.8± 13.6 %) was obtained with sperm cryopreserved in the DMSO containing diluent and activated in 119 mM NaHCO₃. Piau-açu eggs fertilized with sperm previously cryopreserved in solution containing 8% (final concentration) DMSO yielded a rate of fertilization of 84.3 ± 9.4% of the control.

Keywords: fish, 'Piau-açu' (Leporinus macrocephalus), sperm cryopreservation

INTRODUÇÃO

Bancos de sêmen de peixes são arquivos de material genético congelado utilizados em piscicultura e em programas de conservação de espécies ameaçadas. Dentre as aplicações de bancos de sêmen em piscicultura incluem-se: a) utilização de número adequado de machos na produção massal de alevinos com o propósito de se evitar ou reduzir endogenia; b) eliminação do problema da assincronia reprodutiva entre machos e fêmeas; c) facilidade no estabelecimento de programas de melhoramento genético; e) redução de custos relativos à manutenção do plantel de reprodutores machos; e f) maior segurança quanto à sanidade do plantel. Dentre outros pré-requisitos, o sucesso da criopreservação depende da utilização de soluções crioprotetoras em concentrações adequadas (Rana, 1995; Horváth, Urbányi, 2000). Os crioprotetores são utilizados para reduzir ou impedir as lesões causadas pelo congelamento, mas quando utilizados em altas concentrações podem tornar-se tóxicos (Rana, 1995). Parâmetros relativos à diluição do sêmen e ao processo de congelamento devem ser também levados em consideração (Billard et al., 1995).

Dimetilsulfóxido (DMSO) é um dos crioprotetores menos tóxicos (Leung, Jamieson, 1991) e o metanol um dos mais tóxicos exceto para o sêmen de tilápias (Harvey, 1983). Efeitos tóxicos de crioprotetores têm sido observados quando utilizados em altas concentrações (Leung, 1991). Metanol, etilenoglicol e propilenoglicol não são tóxicos para o sêmen de tilápia-nilótica (Amorim, 2002). Embora dimetilacetamida (DMA) seja utilizado com sucesso em bagre-africano (Horváth, Urbányi, 2000), sua toxicidade foi alta para tilápia-nilótica (Amorim, 2002).

O piau-açu (Leporinus macrocephalus) é importante peixe oriundo da bacia do Rio Paraguai. Atualmente há crescente interesse em seu cultivo pois é muito apreciado para a pesca esportiva. Quando mantidas em cativeiro, as fêmeas piau-açu necessitam ser induzidas artificialmente à reprodução (Amaral, 1999). Nessa condição, o piau-açu produz reduzido volume de sêmen, o que tem levado os piscicultores a extraí-lo diretamente dos testículos após sacrificar o reprodutor.

Os objetivos deste trabalho foram testar procedimentos de congelamento do sêmen coletado diretamente dos testículos do piau-açu mantido em condições de cultivo e avaliar sua eficiência na fertilização de ovócitos.

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi desenvolvido com piaus-açu pertencentes ao plantel de reprodutores de estação experimental de piscicultura estatal. Os peixes, estocados em viveiros de terra, na densidade de 1 peixe/2m², foram alimentados com ração produzida na própria estação.

Preliminarmente, selecionaram-se machos com papila genital hiperêmica e que expeliam gotas de sêmen sob massagem da parede celômica. Os doadores de sêmen receberam dose única de 0,5ml/kg de peso corporal de acetato de buserelina (Conceptal, Intervet, Cruzeiro, SP, Brasil), 12 horas antes de se proceder à coleta do sêmen, com a finalidade de se aumentar seu volume, de acordo com o protocolo utilizado na estação. O sêmen foi coletado diretamente dos testículos após o sacrifício dos doadores, tendo sido anotado o volume de sêmen obtido de seis deles.

Avaliaram-se a toxicidade do dimetilsulfóxido (DMSO), da dimetilacetamida, do propilenoglicol, do etilenoglicol e do metanol. Para isso, 1m l do sêmen de seis machos foi diluído (1:100) em solução de NaCl 200mM previamente determinada como não- ativadora da motilidade espermática. Em seguida, em lâmina previamente focalizada ao microscópio de luz, misturou-se 1m l do sêmen pré-diluído em 20m l de solução de cada crioprotetor, nas concentrações de 5%, 10% e 15%, em água destilada (diluição final = 1:2000), segundo Billard e Cosson (1992). Imediatamente após a mistura, estimou-se qualitativamente a percentagem de espermatozóides móveis em relação ao total de espermatozóides presentes no campo histológico. Todas as avaliações microscópicas foram feitas com aumento de 400x.

Para os testes de criopreservação utilizou-se o sêmen de 20 piaus-açu. Os crioprotetores utilizados foram os que apresentaram melhor resultado no teste de toxicidade: DMSO, propilenoglicol e dimetilacetamida. O sêmen recém-coletado foi diluído na proporção de 1: 8 (v:v), (concentração final = 8,9%) na seguinte solução diluente: crioprotetor (concentração final = 8,9%), gema fresca de ovo de galinha (concentração final = 8,9 %), glicose (5%) e água destilada (75%).A mistura sêmen mais diluente foi envasada em palhetas etiquetadas de 0,5ml. Elas foram então colocadas em hastes metálicas as quais foram introduzidas imediatamente no botijão de vapor de nitrogênio líquido (Taylor-Wharton, modelo CP 65, Theodore, AL, EUA), segundo Harvey (2000). Posteriormente esse material foi armazenado em botijão de nitrogênio líquido.

Uma palheta de sêmen de cada peixe foi retirada do botijão de nitrogênio líquido e aquecida em banho-maria a 30° C, durante 6s. Após ser enxugada, seu conteúdo, ainda com consistência pastosa, foi despejado em vidro de relógio . O procedimento de análise da motilidade do sêmen descongelado foi o mesmo usado para o sêmen fresco. Testaram-se NaHCO₃ 119 mM, a NaCl 25 mM e água destilada como soluções ativadoras da motilidade espermática.

Sêmen de cinco machos foi criopreservado em solução diluente contendo DMSO (concentração final = 8,0%), tal como descrito anteriormente., O conteúdo de duas palhetas recém-descongeladas de cada macho foi adicionado à alíquotas de 1g de ovócitos (~3300 ovócitos). Os ovócitos foram obtidos de cinco fêmeas induzidas à desova com extrato bruto de hipófise de carpa segundo a rotina da estação de piscicultura. Sêmen e ovócitos foram delicadamente misturados. Em seguida, adicionaram-se ~10ml de NaHCO₃ 119mM para ativação da motilidade espermática seguida de fertilização. Após lavagem em água corrente por ~3min, os ovos foram transferidos para incubadoras de plástico do tipo funil, de dois litros de capacidade, confeccionadas artesanalmente com garrafas plásticas descartáveis. Como controle utilizou-se sêmen fresco de um macho para fertilizar ovos de cada uma das fêmeas. .A taxa de fertilização foi estimada após a eclosão das larvas pela percentagem de córios vazios.

Aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis para se avaliar a diferença entre as taxas de motilidade espermática pré- e pós-descongelamento (Sampaio, 1998).

RESULTADOS

O volume de sêmen obtido após tratamento com extrato bruto de hipófise de carpa foi de 0,4± 0,2 ml.

O sêmen fresco ativado em diferentes soluções crioprotetoras apresentou variações significativas nas taxas de motilidade espermática (Tab. 1). DMSO, dimetilacetamida e propilenoglicol proporcionaram as mais altas taxas de motilidade espermática. Em geral, o incremento nas concentrações dos crioprotetores resultou na redução das respectivas taxas de motilidade espermática.em Para DMSO e dimetilacetamida, essa redução foi significativa quando se utilizou a concentração de 15%. Para propilenoglicol, etilenoglicol e metanol, o incremento de 5% para 10% na concentração do crioprotetor foi o suficiente para reduzir significativamente a taxa de motilidade espermática.

A combinação DMSO ou propilenoglicol e NaHCO₃ 119 mM, como solução ativadora, produziu taxa de motilidade espermática pós-descongelamento significativamente mais alta do que dimetilacetamida (P<0,05). NaHCO₃ 119 mM, como solução ativadora, produziu resultados significativamente superiores (P<0,05) a NaCl 25 mM e água destilada (Tab. 2) em todos os crioprotetores utilizados.

A taxa de fertilização obtida com sêmen congelado/descongelado foi de 84,3±9,4% em relação à do controle, 94,4±0,1%.

DISCUSSÃO

Tendo em vista o volume reduzido de sêmen obtido por massagem da parede celômica, foi necessário sacrificar o peixe doador e retirar seus testículos para coleta direta de sêmen. Mesmo com esse procedimento, o volume de sêmen coletado foi pequeno, raramente ultrapassando 0,5ml. A toxicidade dos crioprotetores limitam a concentração a ser utilizada no congelamento do sêmen de peixes (Rana, 1995). Os testes de toxicidade deste trabalho mostraram que o aumento na concentração do crioprotetor resultou em redução significativa da taxa de motilidade espermática em todos os crioprotetores utilizados, tal como proposto por Leung, 1991.

Considerando-se a taxa de motilidade espermática como indicadora de toxicidade, DMSO, dimetilacetamida e propilenoglicol foram os menos tóxicos para o sêmen fresco do piau-açu. Estes resultados confirmam os achados de Amorim (2002) exceto para dimetilacetamida. DSMO é tido como o melhor crioprotetor para teleósteos de água doce (Leung, 1991) e, na maioria das vezes, apresenta excelentes resultados (Leung, Jamieson,, 1991; STOSS,1983). Para o DMSO, as taxas de motilidade espermática foram semelhantes independente da concentração utilizada e os resultados obtidos confirmam os achados de De Baulny et al. (1999) e Urbányi et al. (2000). Metanol tem sido utilizado com sucesso para algumas espécies (Harvey, 1983; Chao et al., 1987; Lahnsteiner et al., 1997; Amorim, 2002), associado ao leite em pó.Considerando-se a eficácia da gema de ovo e da glicose (Cabrita et al., 1998), esses produtos nas concentrações de, respectivamente, 10% e 5% integraram a formulação do diluente usado no presente trabalho.

Motilidade espermática é utilizada para indicar a qualidade do sêmen (Billard et al., 1995). Entretanto, Rana (1995) sugere que se faça também o teste de fertilização para comprovar a eficiência do método de criopreservação, pois espermatozóides, embora possam exibir motilidade, podem não ser viáveis. Os resultados do presente trabalho confirmam a escolha da solução de NaHCO₃ 119 mM como ativadora da motilidade espermática de espermatozóides descongelados (Stoss, Holtz, 1981; Cóser et al., 1984; Lahnsteiner et al., 1997; Yao et al., 2000).

Devido à injúria sofrida durante processo de criopreservação, o dobro da razão espermatozóides:ovócitos, usualmente utilizada com sêmen fresco, deve ser utilizado para sêmen congelado (Jenkins, 2000). Informações acerca do número mínimo de espermatozóides frescos (não congelados) necessários à fertilização de ovócitos do piau-açu não são disponíveis na literatura. Isso impediu de se estimar a proporção eventualmente adequada de espermatozóides congelados/descongelados:ovócitos. O teste de fertilização realizado neste trabalho serviu, no entanto, para demonstrar que a capacidade de fertilização foi mantida nos espermatozóides submetidos à criopreservação. Embora a taxa de fertilização do sêmen criopreservado tenha sido menor do que a do controle (sêmen fresco), o método de criopreservação desenvolvido no presente trabalho mostrou-se adequado para o sêmen do piau-açu, podendo ser empregado em bancos de sêmen dessa espécie.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi realizado com o suporte técnico da estação de piscicultura da Central de Experimentação, Pesquisa e Extensão da Universidade Federal de Viçosa, Capinópolis, MG, e do Instituto Superior de Ensino e Pesquisa de Ituiutaba, Ituiutaba, MG, da Universidade do Estado de Minas Gerais.

Recebido para publicação em 18 de julho de 2002

Recebido para publicação, após modificações, em 3 de setembro de 2002

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Abr 2003
• Data do Fascículo
  Fev 2003

Histórico

• Recebido
  18 Jul 2002
• Aceito
  03 Set 2002