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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

versão impressa ISSN 0102-0935versão On-line ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. v.56 n.2 Belo Horizonte abr. 2004

https://doi.org/10.1590/S0102-09352004000200001 

MEDICINA VETERINÁRIA

 

Vírus da artrite encefalite caprina: isolamento e caracterização de parte do gene gag

 

Caprine arthritis-encephalitis virus: isolation and molecular characterization of part of the gag gene

 

 

P.P. Lima; M.A. Rocha*; D. Stancek; A.M.G. Gouveia; G.D.R. Oliveira

Escola de Veterinária da UFMG Caixa Postal 567 30123-970 – Belo Horizonte, MG

 

 


RESUMO

Amostras de sangue de 12 animais soropositivos pelo teste de imunodifusão em gel de agarose e que não apresentavam sinais clínicos sugestivos de infecção pelo vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV) foram coletadas para isolamento viral. Mácrofagos derivados de monócitos foram co-cultivados com células de membrana sinovial caprina (MSC), resultando em cinco amostras que apresentaram efeito citopático característico do tipo persistente, semelhante ao observado para o CAEV. Uma técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) foi padronizada para amplificar parte do gene gag do genoma pró-viral, codificante para a proteína do capsídeo viral (p25). As cinco amostras foram amplificadas pela PCR e três delas, BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2 e BR-UFMG/PL3, foram seqüenciadas diretamente dos seus produtos de PCR. O alinhamento múltiplo das seqüências obtidas com outras de lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR), obtidas no GenBank, e o dendrograma revelaram que as novas amostras de CAEV são únicas e distintas das demais amostras de LVPR, possuindo maior identidade de nucleotídeos e aminoácidos entre si e com as amostras de CAEV do que com a do vírus maedi-visna.

Palavras-chave: vírus da artrite-encefalite caprina, isolamento, PCR, análise filogenética


ABSTRACT

Blood samples from 12 seropositive animals by agar gel immunodifusion test (AGID) showing no evident clinical signs of disease were taken to attempt caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) isolation. Monocyte-derived macrophages were co-cultured with goat synovial membrane cells (GSM) resulting in five virus isolations, which presented cytophatic effects of the persistent type, resembling those observed for CAEV. A polymerase chain reaction (PCR) assay was designed to amplify a portion of the gag proviral gene coding for the major core protein (p25). All of the five isolates were amplified by this PCR and three of them named BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2 and BR-UFMG/PL3, were sequenced directly from their PCR products. Multiple sequence analysis and a dendrogram including other sequences from the GenBank database showed that these Brazilian isolates are unique and distinct from those of known caprine and ovine lentiviruses, with a higher identity of nucleotide and deduced aminoacids to each other and to CAEV than to maedi-visna virus.

Keywords: caprine arthritis-encephalitis virus, virus isolation, PCR, phylogenetic analysis


 

 

INTRODUÇÃO

O vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV) é um vírus protótipo do gênero Lentivirus da família Retroviridae. Ele causa artrite progressiva crônica, pneumonia e mastite em animais adultos e, mais raramente, leucoencefalomielite em animais de dois a quatro meses de idade (Crawford, Adams, 1981). O CAEV provoca infecção persistente por se integrar ao genoma celular, possuindo tropismo por células do sistema imune da linhagem dos monócitos/macrófagos (Gorrel et al., 1992).

O CAEV compartilha características genéticas, morfológicas e patológicas com outros lentivírus, incluindo o vírus maedi-visna (MVV). Freqüentemente CAEV e MVV são denominados de lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR), por possuírem características patogênicas, epidemiológicas e organização genômica semelhantes (Banks et al., 1983).

No início da década de 80, importações de caprinos de raças leiteiras exóticas, procedentes de distintos países da Europa (França, Suíça, Alemanha, Holanda, Inglaterra) e da América do Norte (Estados Unidos e Canadá) foram feitas com o objetivo de introduzir material genético para melhorar a produção de leite das raças nativas brasileiras. Nessas importações, realizadas sem a adequada supervisão, foi também introduzido o CAEV (Assis, Gouveia, 1994).

Diferentes amostras de LVPR têm sido isoladas e caracterizadas em diversos estados brasileiros (Marchesin et al., 1998; Castro et al., 1999; Ravazzolo et al., 2001). A caracterização molecular dessas amostras é importante para evidenciar a diversidade de propriedades biológicas dos vírus que podem redundar em diferenças de citopatogenicidade tanto in vivo quanto in vitro, e de manifestação clínica da doença, além de auxiliar o desenvolvimento de métodos de diagnóstico mais sensíveis.

Esse trabalho objetivou a caracterização molecular de parte do gene gag de amostras brasileiras de lentivírus caprino isoladas de animais naturalmente infectados do Estado de Minas Gerais

 

MATERIAL E MÉTODOS

De um rebanho caprino do Estado de Minas Gerais, foram obtidas 12 amostras de sangue total de animais soropositivos a anticorpos anti-CAEV pela microtécnica de imunodifusão em gel de agarose (IDGA; Gouveia, 1994). O sangue foi centrifugado a 1500g por 20min em centrífuga clínica para a retirada dos leucócitos, segundo Castro (1998). Os leucócitos foram ressuspensos em meio RPMI (com L-glutamina, 2g/l de bicarbonato de sódio e 25mM de Hepes), adicionado de 2% de solução de penicilina e estreptomicina (P/S) e 10% de soro fetal bovino (SFB), e colocados em garrafas A25 e em placas de seis poços. Após 24 horas de cultivo à 37oC e em 5% de CO2, o meio foi completamente trocado e os leucócitos foram mantidos, por uma semana, em estufa à 37ºC para a maturação dos monócitos em macrófagos (Chebloune et al., 1996). Após essa semana de incubação foram acrescentadas células de membrana sinovial de caprino (MSC) na concentração de 30.000 células/cm2 em meio de manutenção celular (MEM) com 2% de P/S, 1% de fungison (F) e 5% de SFB. As garrafas e placas foram observadas periodicamente ao microscópio óptico para verificar a presença de efeito citopático (ECP), característico da infecção por lentivírus caprino (formação de sincícios). A cada 15 dias as monocamadas de células eram tripsinizadas, sendo as garrafas e placas acrescidas de células de MSC e de meio de manutenção celular (Castro, 1998). Ao final de 45 dias, as placas de seis poços contendo as amostras e os controles positivo e negativo foram coradas com solução de cristal violeta a 0,1%, para melhor visualização do ECP. As monocamadas das garrafas A25 foram tripsinizadas e o DNA foi extraído por kit de extração GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (Pharmacia), segundo instruções do fabricante.

Para as reações de PCR, os iniciadores foram desenhados baseando-se na seqüência publicada de CAEV-Co (Saltarelli et al., 1990), com auxílio dos programas Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), Oligo® e OligoTech (Versão 1.0) (http://www.oligosetc.com/OLIGOTech.HTM), e o objetivo de se amplificar um fragmento de 630pb da região gag do genoma pró-viral, correspondente à proteína do capsídeo viral (CA). Os iniciadores escolhidos, CAEV1 e CAEV2, foram: CAEV1 (sense) GGA GGG AGA AGC TGG AA; CAEV2 (antisense) CAC ATC TCT ACA TGC TTG CA.

As reações de PCR foram realizadas em volume total de 30µl, contendo 10mM de Tris-HCl (pH 8,0), 50mM de KCl, 2,0mM de MgCl2, 200µM de cada dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20pmoles de cada iniciador, 1,0 U Taq DNA polimerase e 1m g de DNA. Uma gota de óleo mineral foi colocada em cada tubo. Os ciclos consistiram de um passo inicial à 94oC por 5min e 35 passos de desnaturação à 94oC por 1min, hibridização à 60oC por 1min e extensão à 72oC por 1min. Após os ciclos, as amostras foram submetidas à 72oC por 8min. Para leitura dos resultados foi realizada eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Em todas as reações foram utilizados controles negativos (células de MSC não infectadas) e controle de reagentes (H2O bidestilada, autoclavada, livre de DNAse).

As amostras amplificadas por PCR foram purificadas após eletroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão ("low melting point") a 1%, por meio do kit de extração1 , conforme instruções do fabricante. As amostras purificadas foram enviadas ao laboratório de pesquisa e análise de fragmentos de DNA2 , para seqüenciamento.

As seqüências obtidas foram editadas com auxílio do programa Chromas (versão gratuita 1.45) (Technelysium Pty, Ltd) (http://www.technelysium.com.au/chromas.html) e alinhadas com auxílio do programa Clustal W, versão 1.8 DOS (Thompson et al., 1994) (http://www.csc.fi/molbio/progs/clustalw), para obtenção de uma seqüência com senso. As seqüências editadas foram analisadas para a determinação de similaridades em relação a nucleotídeos e aminoácidos de amostras de LVPR, utilizando os programas Blastn e Blastx e frente aos bancos de dados nr (GenBank + EMBL + DDBJ + PDB sequences) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

As seqüências com senso de nucleotídeos e as seqüências deduzidas de aminoácidos foram alinhadas, usando os programas Multalin (Corpet, 1998) (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin) e Clustal W versão 1.8 DOS (Thompson et al., 1994), com os padrões de CAEV (CAEV-Co) e MVV (K1514, ZZV1050, SA-OMVV e EV1) e os graus de homologia/divergência entre as amostras foram calculados e expressos em porcentagem.

O dendrograma foi construído com o auxílio do programa Multalin (Corpet, 1998). As amostras utilizadas para comparação e seus respectivos números de acesso ao GenBank estão descritos na Tab. 1.

 

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Das 12 amostras colhidas para tentativa de isolamento, cinco apresentaram ECP característico da infecção por LVPR e foram nomeadas de BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2, BR-UFMG/PL3, BR-UFMG/PL4, BR-UFMG/PL5. A ocorrência de muitos sincícios entre três e cinco dias após inoculação das amostras em MSC com 24 horas de cultivo foi considerada como ECP característico.

Todas as amostras positivas ao isolamento e que foram amplificadas pela PCR resultaram em um fragmento de aproximadamente 600pb (Fig. 1). As sete amostras negativas para o isolamento também o foram para a PCR.

 

 

Das cinco amostras, três foram seqüenciadas a partir do produto obtido por PCR purificado (BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2 e BR-UFMG/PL3). Foram obtidas pelo menos duas seqüências para cada amplificado. As seqüências editadas foram depositadas no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) e receberam os seguintes números de acesso: AY081139 (BR-UFMG/PL1), AY101347 (BR-UFMG/PL2) e AY101348 (BR-UFMG/PL3).

As seqüências com senso das amostras BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2 e BR-UFMG/PL3 foram alinhadas separadamente com o padrão CAEV-Co (Saltarelli et al., 1990), para a retirada das regiões correspondentes aos iniciadores. Verificou-se que cada amostra resultou em uma seqüência de 593 nucleotídeos, correspondente à porção codificante para a proteína do capsídeo viral (CA ou p25), entre os aminoácidos 150 e 347 do padrão CAEV-Co, obtido no banco de dados Swissprot (número de acesso P33458). As seqüências apresentavam em média 91% de homologia com a seqüência CAEV-Co.

As seqüências obtidas mantiveram a mesma proporção de bases observadas para os lentivírus, com maior predominância de bases A e menor de T. A maioria das substituições observadas na seqüência de nucleotídeos eram silenciosas, com predominância de transições A« G. O mesmo tipo de predominância de transições A« G tem sido descrito para o HIV-1 (Fitzgibbon et al., 1993). Com relação aos aminoácidos, a maioria das mutações foi conservativa e observada na porção C-terminal da proteína (aminoácido 106 a aminoácido 197) (Fig. 2).

 

 

A porção C-terminal da proteína gag dos diversos gêneros de retrovírus tem sido descrita como mais bem conservada que a porção N-terminal e contém uma região denominada de região de homologia principal (MHR), com grande homologia entre os diferentes retrovírus (Wills, Craven, 1991). A região MHR das amostras isoladas nesse estudo mostrou-se menos conservada, porém as mutações observadas foram conservativas e os aminoácidos Q134, E138, F143 e R146, considerados conservados entre os diferentes lentivírus, também se mantiveram conservados.

As divergências de nucleotídeos e aminoácidos entre as seqüências do CAEV e do MVV estão representadas na Tab. 2.

 

 

As seqüências de nucleotídeos de BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2 e BR-UFMG/PL3 apresentaram, respectivamente, 10, 8 e 9% de divergência com relação ao CAEV-Co e de 21 a 26% de divergência com relação ao padrões de MVV (K1514, SA-OMVV, ZZV1050 e EV1), divergências similares às encontradas entre o CAEV-Co (de 21 a 23%) e as amostras de MVV. Em relação aos aminoácidos, as seqüências BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2 e BR-UFMG/PL3 apresentaram 11, 9 e 7% de divergência em relação ao CAEV-Co, respectivamente.

A Fig. 2 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos com a amostra padrão CAEV-Co e com as amostras padrão de MVV (K1514, ZZV1050, SA-OMVV e EV1), feito com o auxílio do programa Multalin (Corpet, 1998).

Com relação às proteínas, foram observadas 20, 17 e 13 substituições nas amostras BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2 e BR-UFMG/PL3, respectivamente, quando cada um foi comparado com a amostra padrão CAEV-Co (Saltarelli et al., 1990). A maioria dessas substituições foram conservativas e mais freqüentes na porção C-terminal da proteína. A cisteína C177, considerada altamente conservada entre as diversas amostras de lentivírus, também se mostrou conservada nas amostras brasileiras.

As amostras BR-UFMG/PL1 e BR-UFMG/PL2 apresentaram uma substituição (P76® Q) na região rica em prolina e glicina (aa73 a aa80 da Fig. 2) e uma (P139® S) na região do MHR (aa131 a aa150). A amostra BR-UFMG/PL3 apresentou duas substituições (T136® A e D142® E) na região do MHR. Dentro do MHR, os aminoácidos Q134, E138, F143 e R146, considerados bastante conservados entre os diversos lentivírus, mantiveram-se conservados.

As amostras BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2 e BR-UFMG/PL3 apresentaram a mesma substituição para o aa114 (N® S), para o aa125 (R® K), para o aa175 (A® S) e para o aa196 (E® Q).

A fim de se obter informação sobre a relação filogenética entre as três novas amostras brasileiras de CAEV com as seqüências de CAEV e MVV previamente publicadas no GenBank, foi construído um dendrograma a partir da seqüência deduzida de aminoácidos da proteína gag CA (p25), usando o alinhamento das seqüências de aminoácidos das amostras BR-UFMG/PL1, BR-UFMG/PL2 e BR-UFMG/PL3 com as amostras padrão de CAEV (CAEV-Co) e MVV (K1514, SAOMVV, ZZV1050 e EV1), além da inclusão de outras amostras brasileiras de lentivírus caprino (C18, C47 e C767) (Ravazzolo et al., 2001), uma francesa (CA680) (Valas et al., 1997), uma norueguesa (1GA) (Gjerset et al., 2000) e uma brasileira de lentivírus ovino (V27) (Ravazzolo et al., 2001). As amostras obtidas neste trabalho formaram um subgrupo do grupo CAEV, claramente separado do grupo MVV (Fig. 3). Relação filogenética similar, com clara distinção entre as amostras de LVPR originadas de caprinos e ovinos, foi encontrada por Ravazzolo et al. (2001) ao compararem seqüências do gene gag de amostras brasileiras isoladas no Rio Grande do Sul com as amostras de referência de CAEV e MVV. Em contraste, Rolland et al. (2002) verificaram que uma amostra irlandesa de CAEV agrupava-se com as amostras de MVV e em um grupo claramente separado do grupo CAEV, pela análise dos genes gag, pol e env.

 

 

Não houve formação de um subgrupo homogêneo das amostras brasileiras. Quérat et al. (1990) e Sargan et al. (1991) relataram que as amostras K1514, SA-OMVV e EV1, embora tenham sido isoladas de países diferentes, possuem origem comum (possivelmente a Alemanha) e sempre se agrupam juntas nas análises filogenéticas. No Brasil foram importados caprinos de diferentes regiões da Europa e da América do Norte, o que possibilita a ocorrência de amostras virais de diferentes origens, justificando a não formação de um grupo homogêneo das amostras brasileiras.

Os LVPR, CAEV e MVV, embora sejam genética e antigenicamente relacionados, são classificados como quasispécies virais distintas. Entretanto vários autores têm demostrado que algumas amostras de lentivírus ovino isoladas de animais naturalmente infectados e provenientes de diversas regiões geográficas são mais semelhantes ao CAEV (Zanoni et al., 1992; Chebloune et al., 1996) e que algumas amostras de lentivírus caprino assemelham-se mais ao MVV (Castro et al., 1999; Rolland et al., 2002), sugerindo a possível ocorrência de infecção cruzada entre espécies, nas duas direções. Assim, os estudos filogenéticos realizados com amostras de LVPR têm indicado que esses vírus devem ser considerados como quasispécies virais únicas que têm a capacidade de infectar tanto ovinos quanto caprinos.

Existem apenas duas seqüências completas de CAEV publicadas no GenBank, a da amostra considerada padrão CAEV-Co (Saltarelli et al., 1990) e de uma amostra norueguesa 1GA (Gjerset et al., 2000), além de poucas seqüências parciais do gene gag. Para o MVV existem apenas três seqüências completas, os padrões K1514, SA-OMVV e EV1 e algumas seqüências parciais do gene gag. Dessa forma, o isolamento e a caracterização de novas amostras virais provenientes de regiões geográficas distintas possibilita uma melhor verificação da heterogeneidade genética entre os LVPR, importante tanto para os estudos epidemiológicos relacionados à transmissão intra e interespecíficas dos vírus, quanto para esclarecer a origem e a evolução desse grupo viral. A maioria dos estudos filogenéticos dos LVPR foram baseados nos genes pol, env e gag, com poucos estudos comparando os genes regulatórios (Castro et al., 1999) e a região LTR (Zanoni et al., 1998).

O alinhamento das seqüências obtidas neste estudo com as outras amostras de CAEV e MVV depositadas no GenBank, assim como as árvores filogenéticas construídas demonstraram que as amostras isoladas são únicas, distintas e mais relacionadas entre si e com as amostras de CAEV do que com as amostras de MVV.

 

AGRADECIMENTOS

À Pró-Reitoria de Pesquisa da UFMG, pelo financiamento do trabalho.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recebido para publicação em 20 de novembro de 2002
Recebido para publicação, após modificações, em 14 de julho de 2003

 

 

* Autor para correspondência: E-mail: rochama@ufmg.br

 

 

1 WIZARD® PCR Preps – Promega
2 Bioagro - Campus Universidade Federal de Viçosa 36570-000, Viçosa – MG

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