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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

versão impressa ISSN 0102-0935versão On-line ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. v.57 n.5 Belo Horizonte out. 2005

https://doi.org/10.1590/S0102-09352005000500018 

COMUNICAÇÃO

 

Padronização da técnica de imunoistoquímica para o diagnóstico etiológico de rotina da diarréia bovina a vírus

 

Bovine viral diarrhea diagnostic: immunohistochemistry standardization for routine

 

 

G.I. AndradeI; C.V. SerraII; E.F. Barbosa-StancioliII; R. SerakidesI; Z.I.P. LobatoI, *

IEscola de Veterinária da UFMG Caixa Postal 567 30123-970 - Belo Horizonte, MG
II
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG – Belo Horizonte

 

 


Palavras-chave: bovino, diarréia bovina a vírus, imunoistoquímica


ABSTRACT

The immunohistochemistry standardization for bovine viral diarrhea virus (BVDV) diagnostic was described. The formalin-fixed tissue samples from a heifer with mucosal disease were used as positive control. The validation of the first phase results was performed using samples from an aborted fetus and a calf infected with reference strains of BVDV. The best results were seen using monoclonal antibodies and a commercial kit consisting of labelled streptavidin biotin (LSAB) reagents and the diaminobenzidine (DAB) substrate-chromogen reagent. The immunohistochemistry demonstrated to be an useful method for routine diagnosis for the controll and detection of BVDV infection.

Keywords: bovine viral diarrhea, virus, immunohistochemistry


 

 

O diagnóstico de rotina das infecções pelo vírus da diarréia bovina a vírus (BVDV) é comumente feito por meio de sinais clínicos, presença de lesões macro e microscópicas compatíveis e pelo isolamento viral em fluidos corporais, excreções ou tecidos infectados (Baszler et al., 1995). Métodos alternativos, como a imunoistoquímica, têm sido desenvolvidos com o intuito de aumentar a rapidez do diagnóstico da BVD. Essa técnica já foi utilizada com sucesso para a identificação do BVDV em animais acometidos pelas diversas síndromes pós-infecção viral, incluindo a doença das mucosas aguda ou crônica (Liebler-Tenorio et al., 2000), doença respiratória (Bazsler et al., 1995), infecções fetais (Fredriksen et al., 1999) e abortos (Thür et al., 1997). Mais recentemente, foi utilizada como método de triagem em bezerros recém-nascidos a partir de biópsias de pele para a detecção de animais persistentemente infectados (PI), podendo ser empregada na rotina por ser de boa acurácia e economicamente viável (Grooms e Keilen, 2002). Este trabalho teve como objetivo determinar o melhor protocolo para aplicação da imunoistoquímica no diagnóstico de rotina da BVD.

O teste foi padronizado a partir de amostras parafinadas provenientes de uma novilha holandesa com doença das mucosas, empregando amostras de intestino delgado, esôfago, orofaringe e língua. O teste foi validado com amostras provenientes de um animal infectado experimentalmente e amostras de um feto abortado com suspeita clínica para a BVD.

A inoculação experimental foi realizada em um bezerro recém-nascido, sem ingestão de colostro e soronegativo para BVD (testado pelo ensaio de soroneutralização), com 2ml da amostra citopatogênica, CP/NADL 14221 (Tissue Culture Infective Dosis/TCID50 = 105,2/50µl) e 2ml da amostra não citopatogênica, NCP/NY-1 524 (ATCC – American Type Culture Collection, USA) (TCID50 = 106/50µl) pela via intranasal e 4ml de cada amostra por via oral. O animal foi mantido isolado em baia medindo 3m × 2m, com cama de feno e, diariamente, foi alimentado com quatro litros de leite. Sete dias pós-infecção, foi sacrificado e submetido à necropsia.

Do animal inoculado, foram coletados fragmentos dos intestinos, linfonodos, língua, baço, pulmões e coração. Do feto abortado, foram retirados fragmentos dos pulmões, coração e rins. Controles negativos testados para a presença do BVDV pela RT-PCR2 incluíram fragmentos dos intestinos, esôfago e língua de animais de abatedouro. As amostras foram processadas segundo técnicas histológicas de rotina (Luna, 1968).

Secções de 4mm foram submetidas ao teste de imunoistoquímica. Foram utilizados dois anticorpos monoclonais, o Pan-pestivírus anti-BVD DE9 (Mab PP) (Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil) e o anticorpo monoclonal Px (Mab Px) (Instituto Biológico – SP, Brasil), um pool desses anticorpos e um anticorpo policlonal (Pab). Foram utilizados os anticorpos secundários anticamundongo peroxidase, anticabra peroxidase e proteína G peroxidase e um kit comercial, LSAB (Large Volume DAKO LSAB+Kit, Peroxidase K0690). Todos esses reagentes foram aplicados às secções em diluições, temperatura e tempos de incubação variados. Em todas as reações foi adicionado um controle negativo. Para verificar as marcações inespecíficas, os anticorpos primários foram substituídos por PBS em secções de controle positivo.

A atividade da peroxidase foi visualizada utilizando-se os cromógenos 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) e 3,3 diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB). Para contracoloração foi utilizada hematoxilina de Mayer. A leitura das lâminas foi realizada em micoscopia ótica de luz invertida, e registros foram realizados com câmera fotográfica.

A reação com os anticorpos monoclonais, ao contrário do anticorpo policlonal utilizado, revelou marcação específica focal forte e inespecífica discreta. Como reagente secundário, o kit LSAB forneceu maior amplificação do sinal, possibilitando trabalhar com diluições de até 1:400 para anticorpos monoclonais e de até 1:3600 para anticorpo policlonal. O cromógeno DAB mostrou maior eficiência de detecção do que o cromógeno AEC.

A imunolocalização do vírus da BVD foi demonstrada por ambos, anticorpo policlonal e anticorpos monoclonais utilizados. Sua distribuição nas secções amostradas do animal com doença das mucosas ocorreu, principalmente, nas áreas de mucosa do trato gastrintestinal superior e inferior (Fig. 1, A e B), células do sistema fagocítico-mononuclear (Fig. 1, C e D) e região perivascular. Em todas as secções analisadas, houve marcação específica de células inflamatórias nos espaços perivasculares e células musculares lisas da parede de vasos sangüíneos. Células endoteliais de vaso sangüíneo também apresentaram marcação específica para o antígeno da BVD (Fig.1E). Para todas as reações testadas, não houve marcação específica dos controles negativos (Fig. 1F).

 



 

Na Tab. 1 pode-se observar o resultado obtido pela reação de imunoistoquímica para as amostras do bezerro infectado experimentalmente e o feto suspeito para a BVD, proveniente de aborto. Nessa reação utilizaram-se o pool de Mabs na diluição de 1:200 e o kit LSAB/DAB.

Os anticorpos monoclonais, usados separadamente ou como um pool, reconheceram o antígeno viral nos cortes analisados. Trabalhos atuais de detecção do BVDV com imunoistoquímica utilizam um pool de anticorpos monoclonais, eliminando o problema da monoespecificidade (Baszler et al., 1995; Liebler-Tenorio et al., 2000).

O kit LSAB, utilizado como método de amplificação do sinal, mostrou-se altamente sensível. Segundo o fabricante, ele aumenta em até oito vezes a sensibilidade alcançada pelo complexo avidina-biotina (ABC), que é mil vezes mais sensível do que os métodos diretos de marcação imunoenzimática (Haines e Clark, 1991).

Na avaliação dos cromógenos, na diluição padronizada mais eficaz para os Mabs PP e Px, obteve-se melhor eficiência de detecção com a utilização do DAB. A diaminobenzidina é o substrato mais comumente utilizado em ensaios de detecção enzimática e é um dos mais sensíveis para a peroxidase (Harlow e Lane, 1988).

A análise da distribuição do antígeno viral da BVD não foi diferente quando foram usados anticorpos policlonais ou monoclonais. Haines et al. (1992) compararam o uso de anticorpo policlonal e monoclonal em ensaio de imunoistoquímica para a detecção do BVDV em 45 casos clínicos de doença das mucosas e observaram que houve idêntica distribuição de marcação específica em todos os casos testados. Neste estudo, entretanto, a marcação inespecífica mínima observada com a utilização de anticorpos monoclonais facilitou a leitura das lâminas, possibilitando um diagnóstico mais rápido e seguro.

A distribuição do BVDV nos tratos gastrintestinal superior e inferior do animal com doença das mucosas foi similar àquela demonstrada em experimentos anteriores de detecção do antígeno da BVD pela imunoistoquímica (Baszler et al., 1995; Liebler-Tenorio et al., 2000). O BVDV demonstrou forte tropismo pelo tecido epitelial do trato gastrintestinal superior e inferior, e suas principais células-alvo foram os linfócitos, plasmócitos e macrófagos. Na literatura, tem sido amplamente demonstrado o tropismo do BVDV por células do sistema fagocítico-mononuclear e células epiteliais, especialmente a mucosa intestinal (Thür et al., 1997; Njaa et al., 2000). Também foi possível detectar o antígeno em células inflamatórias na região perivascular e em células musculares e endoteliais de vasos, como já demonstrado anteriormente por outros estudos (Fredriksen et al., 1999; Liebler-Tenorio et al., 2000).

A distribuição do antígeno nos órgãos do bezerro inoculado experimentalmente foi consistente com achados descritos na literatura. Estudos anteriores de inoculação experimental em bovinos (Spagnuolo-Weaver et al., 1997) comprovaram o tropismo do BVDV pelos linfonodos, trato gastrintestinal inferior e superior, além de macrófagos e linfócitos. A distribuição do BVDV nas secções dos pulmões, coração e rins do feto abortado também foi observada em outros trabalhos feitos com fetos bovinos provenientes de casos de aborto (Baszler et al., 1995; Thür et al., 1997; Fredriksen et al., 1999). Segundo Baszler et al. (1995), o antígeno da BVD localiza-se, principalmente, no citoplasma de células inflamatórias mononucleares circulantes (fígado, pulmões e baço) e nos ductos coletores do rim. Thür et al. (1997) mostraram o tropismo do BVDV pelo epitélio (tratos gastrintestinal e respiratório, pele e glândulas), além de células da parede de vasos sangüíneos.

A técnica de imunoistoquímica apresenta-se como importante ferramenta de diagnóstico aplicada ao procedimento de rotina para identificação do agente etiológico da BVD e, conseqüentemente, no controle dessa enfermidade.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recebido para publicação em 16 de julho de 2004
Recebido para publicação, após modificações, em 21 de outubro de 2004

 

 

* E-mail: ziplobat@vet.ufmg.br
1 ATCC – American Type Culture Collection, USA
2 Depto. de Microbiologia - ICB/UFMG, Brasil

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