Falha na sexagem por inibição do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro com anticorpos anti H-Y

Failure of sexing by developmental arrest of bovine embryos in vitro produced with H-Y antisera

MEDICINA VETERINÁRIA

Falha na sexagem por inibição do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro com anticorpos anti H-Y

Failure of sexing by developmental arrest of bovine embryos in vitro produced with H-Y antisera

M.V. Resende^I; C.A. Moreira-Filho^II; C.L.V. Leal^III; M.F.P.D. Ramalho^IV; A.O. Almeida^I; R. Vantini^I; V.F.M. Hossepian de Lima^I

^IFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP - Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane km5 - 14884-900 - Jaboticabal, SP

^IIInstituto de Ciências Biomédicas - USP - São Paulo, SP

^IIIFaculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos - USP - Pirassununga, SP

^IVCentro Universitário Anhanguera - UNIFIAN - Leme, SP

RESUMO

Embriões bovinos produzidos in vitro, em estádio de mórula, foram cultivados em meio contendo anticorpos anti H-Y de alto título proveniente de ratos por 24h e, após este tempo, classificados em dois grupos: 1) embriões inibidos em estádio de mórula (classificados como machos) e 2) embriões que se desenvolveram e formaram a blastocele (classificados como fêmeas). O sexo de 311 embriões, distribuídos em três grupos de concentração dos anticorpos, 3%, 5% ou 7%, foi identificado pela reação em cadeia da polimerase. Não houve desvio da proporção entre machos e fêmeas (P>0,05) nos grupos em que se utilizaram os anticorpos anti H-Y, quando comparadas ao grupo-controle, sem adição de anticorpos anti H-Y. Diferentemente dos resultados obtidos utilizando-se embriões bovinos produzidos in vivo, a sexagem com anticorpos anti H-Y de alto título em embriões produzidos in vitro não propiciou sucesso.

Palavras-chave: bovino, sexagem de embriões, inibição do desenvolvimento, anticorpos anti H-Y, fecundação in vitro

ABSTRACT

In vitro produced bovine embryos at morula stage were cultured in medium containing high titer of rat H-Y antisera for 24h. The embryos were classified in two groups: 1) embryos arrested at morula stage (classified as males); and 2) embryos that developed and formed a blastocoele (classified as female). The sex of 311 embryos, divided in three groups of concentration of H-Y antisera, 3%, 5% or 7%, was identified by polimerase chain reaction. The results showed no difference (P>0.05) on sexual deviation in groups in which the H-Y antisera was added, in relation to control group, in which no H-Y antisera was added. In contrast with results obtained with in vivo produced bovine embryos, the sexing of in vitro produced bovine embryos with high H-Y antisera titer did not succed.

Keywords: bovine, embryo sexing, developmental arrest, H-Y antisera, in vitro fertilization

INTRODUÇÃO

A seleção do sexo de embriões bovinos pré-implantados produzidos in vitro pode aumentar o ganho genético em programas de acasalamento (Faber et al., 2003) e diminuir o custo do teste de progênie (Nicholas e Smith, 1983) em bovinos destinados à produção de leite ou carne (Van Vleck et al., 1987). Além disso, a sexagem de embriões pode desviar a proporção entre machos e fêmeas em favor das fêmeas, solucionando a principal desvantagem do cultivo in vitro de embriões que é o desenvolvimento mais rápido de machos (Avery e Schmidt, 1989).

A sexagem de embriões pode ser feita de duas formas: a) métodos invasivos, que incluem análise citogenética, análise de DNA de seqüências específicas do cromossomo Y utilizando hibridização in situ com fluorescência (FISH) e PCR; b) métodos não-invasivos, como a quantificação de enzimas ligadas ao cromossomo X e a detecção por ensaios imunológicos do antígeno H-Y masculino. A aplicação de métodos invasivos para a sexagem de embriões é limitada devido a regras sanitárias específicas, pois a zona pelúcida é rompida após a biópsia, impedindo sua comercialização internacional (Ramalho et al., 2004).

Entretanto, embriões masculinos e femininos produzidos in vitro apresentam taxas de desenvolvimento e expressão de genes diferentes se comparados com embriões produzidos in vivo. Essas diferenças incluem modificações morfológicas e atividade genômica (Gutierrez-Adan et al., 2000).

Considerando-se as leis de controle de doenças e a dificuldade de se conduzir a sexagem de embriões em condições de campo (Ramalho et al., 2004), o objetivo do presente estudo foi testar a eficiência de anticorpos anti H-Y de alto título produzidos em ratos em induzir a inibição do desenvolvimento de embriões bovinos, na tentativa de selecionar o sexo durante a produção in vitro.

MATERIAL E MÉTODOS

Para a produção de anticorpos anti H-Y, oito ratas da linhagem isogênica Wistar Furth, com 45 a 55 dias de idade, foram imunizadas com leucócitos do baço de machos de mesma linhagem. Cada animal recebeu uma injeção intraesplênica (0,08ml) de 4 x 10⁷ células diluídas em PBS suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB). Essas fêmeas receberam uma injeção intraperitoneal de reforço (0,1ml, 4 x 10⁷ células) 18 dias após a primeira injeção intraesplênica. Após 10 dias, as ratas imunizadas foram sangradas para obtenção e titulação do soro por ELISA (Moreira-Filho e Wachtel, 1985).

Iniciou-se o ELISA pela adição de 100ml de antígeno H-Y solúvel (sobrenadantes de células de TM-4; Brunner et al., 1984) em cada poço de uma placa de poliestireno para microtitulação¹, permanecendo a 4°C por 12h. A placa foi lavada por três vezes com PBS + 0,05% de albumina sérica bovina (BSA²), pH 7,2, e uma vez com PBS contendo 3% de BSA (pH 7,2) por 3h a 37°C e lavada novamente por três vezes. Os anticorpos primários (anticorpos anti H-Y) foram adicionados após diluição serial (1:8 a 1:2.048) em PBS + 1% de BSA. Após a incubação por 60min em gelo, a placa foi lavada três vezes com PBS + 0,05% de BSA, adicionando-se em cada poço anticorpo secundário contra imunoglobulina de rato conjugado com peroxidase³, diluído 1:3000 em PBS + 1% BSA. A placa foi incubada em temperatura ambiente por 60min e lavada três vezes com PBS + 0,05% de BSA. Os poços foram preenchidos com substrato - 1mg/ml de ortofenildiamina⁴ + 1µl/ml de 30% de peróxido de hidrogênio⁵ diluído em 0,1M, pH 4,5 de tampão citrato - e mantidos sob agitação constante, no escuro, por 15min. A reação foi interrompida com a adição de 100µl de ácido sulfúrico 4N. A reação foi lida imediatamente em um leitor de absorbância⁶ com comprimento de onda de 490nm.

A densidade óptica (DO) dos anticorpos era >1.1 na diluição de 1:256, e o ponto de corte dos soros foi um soro negativo de uma rata não submetida à imunização. Os soros com DO>1.1 alcançaram título com diluição de 1:1.024 a 1:2.048. Os soros das ratas, não misturados entre si, não foram adsorvidos com células de fêmeas isogênicas antes da sexagem (Hossepian de Lima et al., 1993).

Os reagentes e meios utilizados para a produção in vitro de embriões foram adquiridos da Sigma², exceto aqueles indicados.

Ovários bovinos foram transportados de abatedouros ao laboratório em solução salina a uma temperatura de 28 a 35ºC. Folículos antrais, 3 a 7mm, foram aspirados manualmente com uma agulha de 18-gauge acoplada a uma seringa de 20ml. Os oócitos com cumulus compacto e pelo menos com quatro camadas foram selecionados para a maturação in vitro (MIV). Grupos de 20 a 25 oócitos foram colocados em gotas de 100µl do meio sob óleo mineral. O meio de MIV foi o TCM-199⁷, suplementado com 10% de SFB inativado pelo calor (55ºC por 30min), FSH (1,0µg/µl, Ovagen⁸), hCG(10U/ml, Profasi HP⁹), estradiol (1,0µg/ml), piruvato de sódio (0,25mM) e 16,67µg/µl de amicacina¹⁰ (75µg/ml). Os oócitos foram cultivados por 24 a 26h à temperatura de 38,5ºC, sob atmosfera de 5% de CO₂ em ar.

Para a fecundação in vitro (FIV), o sêmen foi descongelado a 35ºC por 40seg. Os espermatozóides móveis foram obtidos por centrifugação em gradiente de densidade descontínuo (45%:90%) de Percoll¹¹) por 30min a 900xg. Espermatozóides viáveis foram colhidos da parte inferior da fração de 90% do gradiente, foram contados e diluídos em meio FIV (100 x 10³ células para uma gota de FIV de 90µl), e incubados por 60min para capacitação. Os oócitos foram lavados três vezes em meio TCM-199⁸ suplementado com 25mM de HEPES, 100mM de piruvato de sódio, BSA¹² (10mg/ml; fração V, livre de ácidos graxos) e uma vez em meio FIV. Os oócitos e os espermatozóides foram incubados por 20h em 5% de CO₂, em atmosfera úmida à temperatura de 38,5ºC. Os prováveis zigotos foram desnudados por repetidas pipetagens, lavados três vezes no meio modificado "synthetic oviduct fluid" (SOF; Vajta et al., 1999), e transferidos para 500µl de meio SOF em uma placa de quatro poços. O cultivo dos embriões foi realizado sob óleo mineral na atmosfera úmida de 5% de CO₂, 5% de O₂ e 90% de N₂ a 38,5ºC por aproximadamente cinco dias, quando os embriões alcançaram o estádio de mórula. Durante o cultivo in vitro, não foi adicionado SFB, como descrito previamente (Gutierrez-Adan et al., 2001).

Realizaram-se cinco repetições, em diferentes dias, utilizando-se três concentrações do soro contendo anticorpos anti H-Y: 3% de soro, com 113 embriões, 5% de soro com 96 embriões e 7% de soro com 102 embriões. Em um primeiro teste foi adicionado 10% de soro contendo anticorpos anti H-Y no meio de cultivo, no entanto, os embriões degeneraram e, desse modo, reduziu-se a concentração máxima do soro. Aproximadamente cinco dias após a FIV, os anticorpos anti H-Y foram adicionados no meio de cultivo contendo embriões bovinos. O grupo-controle, com 115 embriões, foi incubado sem anticorpos anti H-Y. Este grupo-controle foi necessário para monitoramento do desvio da proporção entre machos e fêmeas para machos durante o cultivo in vitro e para verificar a partenogênese. Os grupos da sexagem e o controle foram incubados a 38,5°C, 5% de CO₂, 5% de O₂ e 90% de N₂ por 24h.

Após esse período, os embriões do grupo da sexagem foram separados em dois grupos, de acordo com o estádio de desenvolvimento alcançado após a incubação em meio contendo anticorpos anti H-Y. Embriões inibidos em estádio de mórula, presumidamente H-Y positivos e classificados como machos, constituíram o grupo 1; embriões que progrediram para o estádio de blastocisto, presumidamente H-Y negativos e classificados como fêmeas, constituíram o grupo 2.

Para a determinação do sexo genético dos embriões pela PCR, 311 embriões dos grupos da sexagem e 115 embriões do grupo-controle (sem adição de soro contendo anticorpos anti H-Y) foram colocados em tubos de 0,2ml para PCR contendo 10µl de água ultra-pura autoclavada. Posteriormente, foi adicionada Proteinase K¹³ na concentração final de 50µg por embrião. Os tubos foram incubados a 37°C por 60min (para ação da enzima) e a 98°C por 10min (para inativação da enzima). Dois pares de "primers" Y-específicos foram adicionados em duas amostras distintas. O primeiro par foi: 5' - CCT CCC CTT GTT CAA ACG CCC GGA ATC ATT - 3' e 5' - TGC TTG ACT GCA GGG ACC GAG AGG TTT GGG - 3' (Bondioli et al., 1989); e o segundo par foi: 5' - ATC AGT GCA GGG ACC GAG ATG - 3' e 5' - AAG CAG CCG ATA AAC ACT CCT T - 3' (Schwerin et al., 1991; Luz et al., 2000). O primeiro par detecta uma seqüência de 210pb do cromossomo Y bovino e o segundo, uma seqüência de 196pb do cromossomo Y. Um terceiro par detecta uma seqüência autossômica de 280pb, indicando a presença de DNA genômico bovino. O terceiro par foi: 5' - AGG TCG CGA GAT TGG TCG CTA GGT CAT GCA - 3' e 5' - AAG ACC TCG AGA GAC CCT CTT CAA CAC GT - 3' (Ellis e Harpold, 1986; Ellis et al., 1988). "PCR multiplex" foi realizada em um mesmo tubo com o primeiro (210pb) e o terceiro (280pb) "primers", a PCR com o segundo par de "primers" (196pb) o foi em outro tubo. As amplificações foram feitas em um termociclador¹⁴, da seguinte forma: a) para o primeiro e terceiro par de "primers": um passo inicial a 94°C por 5min, 40 ciclos a 94°C por 1min de desnaturação, anelamento a 58°C por 30seg e síntese a 72°C por 1min, e uma extensão final de 7min a 72ºC, com total de 40 ciclos; b) para o segundo par de "primers", um passo inicial de 94°C por 5min, 38 ciclos a 94°C por 1min de desnaturação, anelamento a 58°C por 1min e síntese a 72°C por 1min e uma extensão final de 7min a 72ºC, total de 38 ciclos.

Os resultados obtidos a partir da identificação do sexo genético dos embriões foram submetidos à análise estatística pelo teste do qui-quadrado a 5% de significância. Confrontou-se, separadamente, cada grupo da sexagem - 3%, 5% ou 7% de soro contendo anticorpos anti H-Y durante a produção in vitro dos embriões - com o grupo-controle - não adicionado soro contendo anticorpos anti H-Y -, verificando-se o desvio da proporção entre machos e fêmeas dos embriões em estádio de mórulas (classificados como machos) e em estádio de blastocistos (classificados como fêmeas).

RESULTADOS

A identificação de embriões e os resultados da PCR de 311 embriões cultivados em meio contendo anticorpos anti H-Y são apresentados na Fig. 1 e na Tab. 1. Ocorreram falhas em inibir o desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro, pois não houve diferença quando se comparou com a proporção entre machos e fêmeas obtida no grupo-controle, que foi de 54% de machos e de 46% de fêmeas em 115 embriões. Desse modo, não houve necessidade de comparar os grupos da sexagem entre si.

DISCUSSÃO

O aperfeiçoamento de técnicas imunológicas para a sexagem de embriões depende da obtenção de soro que contenha altos títulos de anticorpos anti H-Y e do desenvolvimento de protocolos simples para minimizar a manipulação dos embriões (Shalev et al., 1978; Bradley e Heslop, 1985; Ramalho et al., 2004). Muitos dos anticorpos policlonais produzidos em camundongos ou ratos apresentam baixo título, limitando a eficiência da sexagem de embriões. Além disso, a produção de anticorpos monoclonais não melhora significativamente a acurácia na determinação do sexo de embriões bovinos (Hossepian de Lima et al., 1993).

No presente estudo, anticorpos anti H-Y policlonais de rata com alto título foram produzidos e usados com DO>1.1 na diluição de 1:256 para a sexagem de embriões bovinos produzidos in vitro. Confirma-se, desse modo, que a imunização intraesplênica em ratas isogênicas, com células esplênicas de machos de mesma linhagem, promove uma forte resposta contra o H-Y (Bradley e Heslop, 1985; Ramalho et al., 2004).

No protocolo usado, os anticorpos anti H-Y não foram adsorvidos com células de ratas antes do seu uso no procedimento de sexagem. Vários autores recomendam a adsorção na tentativa de reduzir as reações inespecíficas (Utsumi e Iritani, 1986; Utsumi et al., 1993). No entanto, as observações de Hossepian de Lima et al. (1993), que adsorveram e não adsorveram os anticorpos anti H-Y, não diferiram significativamente em relação a sua eficiência. De outro modo, está confirmado que a imunização intraesplênica promove forte resposta na produção de anticorpos policlonais anti H-Y de alto título como proposto por Bradley e Heslop (1985).

Ao trabalharem com embriões produzidos in vivo de camundongos e bovinos, Ramalho et al. (2004) conseguiram em torno de 80% de identificação correta entre mórulas e blastocistos. Com mórulas bovinas produzidas in vitro, Gardon et al. (2004) conseguiram 81,7% de identificação correta na sexagem, utilizando anticorpos anti H-Y policlonais adicionados de complemento, que foi produzido em porquinho da Guiné. No entanto, diferentemente do método proposto neste estudo, Gardon et al. (2004) relataram que em torno de 59% dos embriões degeneraram após o tratamento devido à utilização do complemento. Este fato, que descaracteriza a técnica como sendo somente de inibição do desenvolvimento, impede o uso dos embriões bovinos machos em programas de acasalamento em que este sexo é o desejado.

Os resultados diferem dos citados na literatura e podem ser atribuídos à qualidade morfológica mais baixa dos embriões produzidos in vitro quando comparada com a dos embriões produzidos in vivo. As possíveis explicações para o insucesso dessa técnica podem ser resultado da baixa qualidade das mórulas produzidas in vitro e da clivagem assíncrona, que aumenta a porcentagem de falso-positivos (Wright e Ellington, 1995; Rizos et al., 2001), ou, também, da influência do meio de cultivo usado durante a produção in vitro dos embriões com anticorpos anti H-Y. Uma outra hipótese, para justificar os resultados do presente trabalho, pode ser atribuída às alterações na expressão de genes e moléculas que são responsáveis pela correta ação de antígenos de histocompatibilidade, como o antígeno H-Y. Por exemplo, uma das funções da beta-2-microglobulina é ligar o antígeno H-Y na superfície celular (Fellous et al., 1978; Tanaka et al., 2005). Pelo menos em embriões clonados, foi verificada uma expressão anormal nos antígenos de histocompatibilidade classe 1 (Hill et al., 2002).

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pelo apoio parcial (bolsa de estudo - Brasil).

À Dra. Maria Notomi Sato - USP - São Paulo, pela doação dos ratos isogênicos.

Recebido em 14 de maio de 2007

Aceito em 6 de março de 2008

E-mail: [e-mail]

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Jul 2008
• Data do Fascículo
  Jun 2008

Histórico

• Aceito
  06 Mar 2008
• Recebido
  14 Maio 2007