Proteinogramas séricos de ratos Wistar experimentalmente infectados com Trypanosoma evansi

Serum protein concentrations in Wistar rats experimentally infected with Trypanosoma evansi

Resumos

Estabeleceu-se o perfil eletroforético de proteínas séricas de ratos Wistar experimentalmente infectados com Tripanosoma evansi, utilizando-se 40 ratos, distribuídos em oito grupos de cinco animais cada. Um grupo foi mantido como testemunho (G1), e os demais (G2 a G8) foram inoculados, via intraperitoneal, com cerca de 10³tripomastigota de T. evansi. Amostras de sangue para obtenção de soro foram coletadas no quinto (G2), 10º (G3), 15º (G4), 30º (G5), 45º (G6), 60º (G7) e 75º (G1 e G8) dia após as inoculações. O fracionamento das proteínas foi realizado pela técnica SDS-PAGE. Foram identificadas 31 proteínas, sendo sete de fase aguda: ceruloplasmina (101KD), hemopexina (83KD), transferrina (75KD), albumina (66KD), antitripsina (60KD), haptoglobina (44KD) e glicoproteína ácida (38KD). As proteínas com pesos moleculares 12KD; 22KD; 25KD; 28KD; 32,5KD; 35KD; 53,5KD; 63KD e 72KD apareceram apenas nos ratos inoculados com T. evansi.

rato; proteína; eletroforese; Trypanosoma evansi

This study established the electrophoretic profile of serum proteins of Wistar rats experimentally infected with Tripanosoma evansi. For such, 40 rats were allocated into eight groups of five animals. A group was kept as control (G1) and the others (G2 to G8) were intraperitoneally inoculated with 1.0 x 10³ tripomastigote of T. evansi. Blood samples were collected at 5th (G2), 10th (G3), 15th (G4), 30th (G5), 45th (G6), 60th (G7), and 75th (G1 and G8) days after inoculation (DAI). The serum protein concentrations were determined by means of sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis. Thirty-one distinct proteins were identified, seven of these were identified as acute phase proteins: ceruloplasmin (110KD), hemopexin (83KD), transferrin (75KD), albumin (66KD), antitrypsin (60KD), haptoglobin (44KD), and acid glycoprotein (38KD). The proteins with molecular weights 12KD; 22KD; 25KD; 28KD; 32,5KD; 35KD; 53,5KD; 63KD, and 72KD were found only in infected rats.

rat; protein; electrophoresis; Trypanosoma evansi

MEDICINA VETERINÁRIA

Proteinogramas séricos de ratos Wistar experimentalmente infectados com Trypanosoma evansi

Serum protein concentrations in Wistar rats experimentally infected with Trypanosoma evansi

M.C.A. Teixeira^I; L.C. MarquesI, ^*; F.A. Cadioli^II; J.J. Fagliari^I; R.Z. Machado^I; P.C. Silva^I

^IFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n, 14884-900 - Jaboticabal, SP

^IICurso de Medicina Veterinária - FOA-UNESP - Araçatuba, SP

RESUMO

Estabeleceu-se o perfil eletroforético de proteínas séricas de ratos Wistar experimentalmente infectados com Tripanosoma evansi, utilizando-se 40 ratos, distribuídos em oito grupos de cinco animais cada. Um grupo foi mantido como testemunho (G1), e os demais (G2 a G8) foram inoculados, via intraperitoneal, com cerca de 10³tripomastigota de T. evansi. Amostras de sangue para obtenção de soro foram coletadas no quinto (G2), 10º (G3), 15º (G4), 30º (G5), 45º (G6), 60º (G7) e 75º (G1 e G8) dia após as inoculações. O fracionamento das proteínas foi realizado pela técnica SDS-PAGE. Foram identificadas 31 proteínas, sendo sete de fase aguda: ceruloplasmina (101KD), hemopexina (83KD), transferrina (75KD), albumina (66KD), antitripsina (60KD), haptoglobina (44KD) e glicoproteína ácida (38KD). As proteínas com pesos moleculares 12KD; 22KD; 25KD; 28KD; 32,5KD; 35KD; 53,5KD; 63KD e 72KD apareceram apenas nos ratos inoculados com T. evansi.

Palavras-chave: rato, proteína, eletroforese, Trypanosoma evansi

ABSTRACT

This study established the electrophoretic profile of serum proteins of Wistar rats experimentally infected with Tripanosoma evansi. For such, 40 rats were allocated into eight groups of five animals. A group was kept as control (G1) and the others (G2 to G8) were intraperitoneally inoculated with 1.0 x 10³ tripomastigote of T. evansi. Blood samples were collected at 5^th (G2), 10^th (G3), 15^th (G4), 30^th (G5), 45^th (G6), 60^th (G7), and 75^th (G1 and G8) days after inoculation (DAI). The serum protein concentrations were determined by means of sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis. Thirty-one distinct proteins were identified, seven of these were identified as acute phase proteins: ceruloplasmin (110KD), hemopexin (83KD), transferrin (75KD), albumin (66KD), antitrypsin (60KD), haptoglobin (44KD), and acid glycoprotein (38KD). The proteins with molecular weights 12KD; 22KD; 25KD; 28KD; 32,5KD; 35KD; 53,5KD; 63KD, and 72KD were found only in infected rats.

Keywords: rat, protein, electrophoresis, Trypanosoma evansi

INTRODUÇÃO

Trypanosoma evansi é um protozoário flagelado (Wakelin, 1996) de grande impacto econômico em animais domésticos e selvagens. Este hemoflagelo é o agente causal da "surra" (Hoare, 1972), doença amplamente distribuída em regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, ocorrem principalmente em eqüídeos, cães, capivaras e quatis (Aquino et al., 2002).

O curso da doença pode ser subagudo, agudo ou crônico (Singh e Chaudhri, 2002). O diagnóstico da enfermidade é relativamente simples em animais com infecções agudas, quando os parasitas estão presentes em grande número no sangue periférico; entretanto, é mais difícil nas infecções crônicas quando a parasitemia é baixa e intermitente (Oliveira et al., 1989). Hospedeiros infectados pelo T. evansi exibem lesões de natureza inflamatória (Marques, 1996; Cadioli et al., 2006). As proteínas de fase aguda refletem a gravidade da reação inflamatória, podendo auxiliar no diagnóstico e prognóstico, bem como no entendimento de mecanismos patogênicos de doenças (Godson et al., 1996).

O fracionamento eletroforético é um dos mais confiáveis métodos de identificação e quantificação de proteínas dos fluidos corporais (Kaneko et al., 1997). Assim, o objetivo principal deste estudo foi determinar o perfil eletroforético das proteínas séricas de ratos Wistar, experimentalmente infectados com T. evansi, utilizando-se como matriz o gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).

MATERIAL E MÉTODOS

A cepa de T. evansi empregada foi isolada de um cão naturalmente infectado (Moreira e Machado, 1985). Foram utilizados 40 ratos Wistar, machos, com peso médio de 300 gramas. Destes, cinco ratos foram mantidos como testemunhos (G1) e outros 35 foram subdivididos aleatoriamente, em sete grupos de cinco animais (G2 a G8), e inoculados, via intraperitoneal, com cerca de 1,0 x 10³ tripomastigotas de T. evansi.

As pesquisas de tripamastigotas no sangue periférico dos animais foram realizadas de cinco em cinco dias após as inoculações (DAI). Uma gota de sangue da ponta da cauda de cada roedor foi colhida e acondicionada em frascos limpos e secos contendo EDTA na proporção de 2mg/ml de sangue (Rosenfeld, 1955). A parasitemia foi avaliada pelo exame da gota espessa.

Os ratos foram anestesiados em câmara contendo éter etílico, e a colheita de sangue para obtenção do soro foi realizada por punção cardíaca no quinto (G2), 10º (G3), 15º (G4), 30º (G5), 45º (G6), 60º (G7) e 75º (G1 e G8) dia. Após esse procedimento, os animais foram submetidos à eutanásia em câmara contendo éter etílico.

Para determinação da proteína sérica total, empregou-se o método do biureto ¹. Para fracionamento, identificação e quantificação das proteínas séricas, foi realizado o fracionamento eletroforético em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), utilizando-se a técnica de Laemmli (1970). Os pesos moleculares e as concentrações das frações protéicas foram determinados mediante densitometria. Como referência, foi utilizada solução marcadora com pesos moleculares 29; 45; 66; 97,4; 116 e 205 quilodáltons (KD), além de proteínas purificadas (albumina, IgG, ceruloplasmina, haptoglobina, α₁- antitripsina e transferrina).

Utilizou-se o delineamento inteiramente ao acaso com um grupo submetido a avaliações em sete momentos. Quando se constatou significância entre grupos e momentos, aplicou-se teste t para comparação das médias.

RESULTADOS

Pelo exame da gota espessa, evidenciaram-se parasitemias em todos os ratos inoculados com T. evansi (G2 a G8).

Trinta e uma proteínas, com pesos moleculares variando de 12KD a 165KD, foram encontradas em todos os ratos (Tab.1). Ceruloplasmina (101KD), hemopexina (83KD), transferrina (75KD), albumina (66KD), antitripsina (60KD), haptoglobina (44KD) e glicoproteína ácida (38KD) são consideradas proteínas de fase aguda. As proteínas com pesos moleculares 12KD, 22KD, 25KD, 28KD, 32,5KD, 35KD, 53,5KD, 63KD e 72KD apareceram apenas nos ratos inoculados com T. evansi.

No G2, verificou-se aumento significativo do teor sérico de hemoglobina e das proteínas com pesos moleculares 53KD, 33KD, 13KD e 12KD e reduções significativas da fosforilase, antitripsina, imunoglobulina de cadeia pesada, haptoglobina, imunoglobulina de cadeia leve e da proteína de peso molecular 135KD. No G3, notaram-se aumentos significativos das concentrações séricas de transferrina, hemoglobina e das proteínas com pesos moleculares 158KD, 53,5KD, 32,5KD, 13KD e 12KD e reduções de imunoglobulina A, ceruloplasmina, fosforilase e das proteínas com pesos moleculares 165KD, 135KD e 95KD. No G4, reduções significativas foram verificadas nas concentrações de imunoglobulina A, albumina e da proteína com peso molecular 135KD. No G5, aumentos significativos das concentrações séricas das proteínas com pesos moleculares 53KD e 35KD e reduções significativas foram verificados nas concentrações de imunoglobulina A, haptoglobina e das proteínas com pesos moleculares 165KD, 135KD e 33KD. No G6, foram verificados aumentos significativos da proteína total, da imunoglobulina de cadeia leve, da antitripsina, das proteínas com pesos moleculares 165KD e 53KD e reduções significativas da imunoglobulina A, ceruloplasmina, haptoglobina, glicoproteína ácida e da proteína com peso molecular 40KD. No G7, reduções significativas foram verificadas nas concentrações de imunoglobulina A, hemopexina, albumina, glicoproteína ácida e das proteínas com pesos moleculares 135KD e 40KD. No G8, ocorreram reduções significativas da glicoproteína ácida e das proteínas com pesos moleculares 95KD e 40KD.

DISCUSSÃO

Foi possível identificar, em todos os ratos, 31 proteínas distintas, com pesos moleculares que variaram de 12 a 165KD. Passos (2004), ao trabalhar com ovinos infectados com a mesma cepa de T. evansi, relatou a presença de 45 frações protéicas, com pesos moleculares que variaram de 12KD a 205KD. Dentre as proteínas identificadas nominalmente em ovinos e as encontradas nos ratos, certificou-se que a proteína C-reativa e a hemopexina apareceram nos ovinos e nos ratos, respectivamente, e as demais proteínas nominalmente identificadas foram encontradas em ambas as espécies animais. Os ovinos apresentaram baixa parasitemia, confirmada apenas na prova biológica, e albergaram T. evansi por longo período de tempo, sem manifestação clínica de doença, enquanto os ratos apresentaram alta parasitemia, testada pelo método parasitêmico direto (gota espessa) e sinais característicos da enfermidade. Há hipótese de que a proteína C-reativa seja um dos fatores que participa da limitação da parasitemia (Passos, 2004) e, contrariamente à hemopexina, pode ser um substrato essencial à multiplicação dos parasitas. Assim, a susceptibilidade dos diferentes hospedeiros ao T. evansi possivelmente esteja relacionada, também, à indução da síntese de algumas proteínas específicas.

Nos ratos infectados com T. evansi, verificou-se aumento significativo da proteína total sérica no 45º dia após infecção. Vermam e Gautam (1982) e Marques (1996) não observaram em bovinos e eqüinos infectados com T. evansi alterações significativas da proteína total sérica. Herrera (1998) e Passos (2004) verificaram em quatis e em ovinos infectados aumento do teor sérico de proteína total. Em búfalos (Kathira e Avastthi, 1985) e em cães (Sandoval et al., 1994) infectados por este hemoparasita, há relatos de diminuição dessa variável. Assim, há indícios de que cada espécie animal responde de maneira diferente a estímulos semelhantes.

A IgA apresentou reduções significativas entre o 10º, 15º e 60º DAI. A IgA está presente nas secreções externas (lágrima, saliva, sistema respiratório e gastrintestinal) e atua na defesa local e de superfícies corporais, limitando invasão bacteriana e viral (Jain, 1993). As implicações fisiopatológicas da diminuição da IgA em ratos infectados por T. evansi ainda são desconhecidas, portanto novos estudos são necessários para melhor esclarecer estes aspectos.

A ceruloplasmina apresentou redução significativa nos estágios inicial (10º DAI) e intermediário (45º DAI) da evolução da doença. Não há, na literatura consultada, dados de proteinogramas em ratos infectados com tripanossomos que permitam comparações acuradas. Entretanto, em processos inflamatórios agudos causados por outros agentes (Fagliari et al., 1997; 2003); há indícios de que esta proteína aparece apenas na fase aguda de evolução. Solter et al. (1991) demonstraram que a ceruloplasmina foi mais sensível para detecção de doenças inflamatórias em cães. Cães com gastrite hemorrágica aguda causada pelo parvovírus aparentemente apresentaram níveis de ceruloplasmina mais baixos que os de haptoglobina e glicoproteína ácida (Kogika et al., 2003).

A fosforilase apresentou reduções significativas entre o quinto e 10º DAI. Na literatura consultada, não foi possível identificar a função desta proteína frente a qualquer tipo de injúria. Assim, o papel dessa proteína em ratos infectados com T. evansi tem significado ainda desconhecido. A única evidência é que ela apareceu apenas na fase aguda da infecção.

A hemopexina apresentou redução significativa no 60º DAI. Do mesmo modo, ainda não se conhece a função dessa proteína em ratos infectados com T. evansi, mas as evidências demonstram que ela só apareceu na fase crônica da infecção.

A transferrina apresentou aumento significativo no 10º DAI. Ratos infectados com T. evansi desenvolveram anemia hemolítica, assim, possivelmente, o aumento dessa proteína esteja correlacionado com esse fator.

A albumina apresentou reduções significativas no 15º e 60º DAI. Sandoval et al. (1994), ao trabalharem com cães infectados com T. evansi, também relataram diminuição dessa proteína. Passos (2004) relatou que os teores séricos de albumina em ovinos foram relativamente menores durante o período experimental, apesar do aumento das globulinas. Monzon e Villavicencio (1990), ao usarem Hamster infectados com T. evansi e compararem os resultados encontrados com eqüinos, relataram, em ambas as espécies, decréscimo significativo das frações de albumina e aumento de gama-globulinas. Mudanças em diferentes frações protéicas do soro também foram encontradas em camelos (Boid et al., 1980), bezerros (Vermam e Gautan, 1979) e eqüinos (Brem et al., 1984) infectados com T. evansi, cujo fator comum foi o aumento de frações de gamaglobulina e diminuição dos teores de albumina.

A antitripisina apresentou redução significativa no quinto DAI e aumento significativo no 45º DAI. Embora essa proteína seja considerada de fase aguda positiva, elevando-se imediatamente após a instalação de processos inflamatórios ou endotoxêmicos (Godson et al., 1996), verificou-se que ela também apareceu nos ratos infectados com T. evansi na fase crônica da infecção. Aumento significativo da concentração plasmática de antitripsina foi observado em pôneis com laminite e bezerros com pneumonia (Fagliari et al., 1997; 2003).

A IgG de cadeia pesada apresentou redução significativa no quinto DAI. Já a IgG de cadeia leve apresentou redução significativa no quinto e aumento significativo no 45º DAI. Goodwin (1970), citado por Vermam e Gautam (1982), relatou que grande quantidade de imunoglobulinas são produzidas nas infecções por T. brucei, mas parece não ter especificidade e são incapazes de fornecer total proteção ao hospedeiro. Na literatura consultada, há relatos da presença de imunoglobulinas não específicas que aparecem em infecções causadas por T. evansi (Vermam e Gautam, 1982). Segundo Jain (1993), as imunoglobulinas no soro e no complemento também são alteradas durante infecções causadas por tripanossomos.

As tripanossomíases africanas induzem pronunciada resposta de anticorpos (Le Ray, 1975). Entretanto, a natureza exata das alterações em determinados órgãos durante a infecção pelo tripanossomo e os eventos que levam a conseqüências fatais em animais ainda não são bem esclarecidos (Seed, 1969). Talvez a incidência da resposta imune específica ao tripanossomo esteja relacionada à habilidade do parasita em apresentar variação antigênica, levando à persistência da infecção (Vickerman, 1978).

A haptoglobina apresentou reduções significativas nos estágios inicial (quinto DAI) e intermediário (30º e 45º DAI) do período de evolução da doença. No entanto, tais observações diferem das encontradas por Ngure et al. (1997). Estes, ao trabalharem com camundongos infectados com T. brucei, verificaram que a haptoglobina somente foi detectada dois dias após a inoculação, e sua concentração máxima foi verificada aos 10 dias de evolução. Passos (2004) verificou elevação e diminuição dessa proteína em vários períodos, nos ovinos infectados com a mesma cepa.

A glicoproteína ácida apresentou reduções significativas no 45º, 60º e 75º DAI. Estes resultados diferem dos encontrados em pôneis com laminite (Fagliari et al., 1997), em cães infectados com parvovírus (Kogika et al., 2003), em bezerros infectados com Mannheimia haemolytica (Fagliari et al., 2003) e em bovinos infectados com Theileria annulata (Glass et al., 2003), que apresentaram aumento da glicoproteína ácida.

A hemoglobina apresentou aumento significativo no quinto e 10º DAI. O aumento desta proteína no soro dos ratos infectados com T. evansi, provavelmente, deve-se à hemólise intravascular. Anemia é um achado comum em animais infectados por tripanossomos (Boero, 1974). A gênese desse distúrbio é multifatorial, mas é sabido que a hemólise intravascular é um dos fatores implicados (Aquino, 1997) e a severidade da anemia usualmente reflete a intensidade e a duração da parasitemia (Murray e Dexter, 1988).

CONCLUSÕES

O proteinograma, embora não forneça informações específicas, pode auxiliar no diagnóstico das tripanossomíases. Dentre as proteínas encontradas, sete são consideradas como proteínas de fase aguda: ceruloplasmina, hemopexina, transferrina, albumina, antitripsina, haptoglobina e glicoproteína ácida. Assim, a avaliação dos teores séricos das proteínas de fase aguda constitui um importante teste de auxílio diagnóstico, de manejo e verificação da evolução das enfermidades inflamatórias, qualquer que seja a sua origem. Além das proteínas de fase aguda, a identificação de outras frações protéicas presentes no plasma ou no soro sangüíneo torna-se, também, útil como indicadora do estado de sanidade e/ou imunológico dos animais. As proteínas 12KD, 22KD, 25KD, 28KD, 32,5KD, 35KD, 53,5KD, 63KD e 72KD somente aparecem em ratos inoculados com T. evansi.

Recebido em 27 de novembro de 2007

Aceito em 20 de outubro de 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Fev 2009
• Data do Fascículo
  Dez 2008

Histórico

• Aceito
  20 Out 2008
• Recebido
  27 Nov 2007