Efeito da adição de trolox e pentoxifilina na motilidade, integridade do acrossoma e do DNA de espermatozoides equinos após descongelação

Effect of trolox and pentoxifylline on motility and integrity of, acrossome and DNA of equine spermatozoa after thawing

MEDICINA VETERINÁRIA

Efeito da adição de trolox e pentoxifilina na motilidade, integridade do acrossoma e do DNA de espermatozoides equinos após descongelação

Effect of trolox and pentoxifylline on motility and integrity of, acrossome and DNA of equine spermatozoa after thawing

K.M.G. Silva^I; T.A.P. Moraes^I; E.C.B. Silva^I; S.C. Gamboa^II; M.M.P. Guerra^I

^IDepartamento de Medicina Veterinária - UFRPE - Recife, PE

^IIEscola Superior Agrária - Instituto Politécnico de Coimbra - Bencanta - Coimbra, Portugal

RESUMO

Três garanhões foram utilizados para estudar o efeito da adição de trolox e pentoxifilina na motilidade, integridade do acrossoma e DNA de espermatozoides pós-descongelação. Para congelação, utilizou-se Tris-gema com glicerol (5%) em máquina de congelação de sêmen. As amostras foram descongeladas a 37ºC durante 30 segundos e tratadas com: T1= 150µL de sêmen + 150µL de Tris; T2= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 120µM/mL de trolox; T3= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 3,5mM de pentoxifilina e T4= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 3,5mM de pentoxifilina + 120µM/mL de trolox. Após 0, 60 e 120 minutos de incubação (37ºC), as amostras foram analisadas quanto à motilidade, vigor, integridade de acrossoma e DNA. Não houve diferença (P>0,05) entre tratamentos após 0 e 60 minutos de incubação em todos os parâmetros estudados. Após 120 minutos de incubação, verificou-se maior porcentual (P<0,05) de células com motilidade total e progressiva nas amostras do T2. Conclui-se que a adição de trolox após descongelação do sêmen equino preserva a motilidade total e progressiva dos espermatozoides submetidos à incubação a 37ºC durante 120 minutos.

Palavras-chave: equino, sêmen, incubação, antioxidante

ABSTRACT

Three stallions were used to study the effect of trolox and pentoxifylline addition on the motility and integrity of acrossome and DNA equine spermatozoa after thawing. Tris-egg-yolg diluent with glycerol (5%) were used to freeze the semen samples in a freezing machine. The samples were thawed at 37ºC during 30 seconds and treated with: T1=150µL of semen + 150µL of Tris; T2= 150µL of semen + 150µL of Tris +150mM/mL of trolox; T3= 150µL of semen + 150µL Tris +3.5mM of pentoxifylline; and T4= 150µL of semen + 150µL of Tris + 3.5mM of pentoxifylline + 150mM of trolox. After 0, 60, and 120 minutes of incubation (37ºC), the samples were analyzed to motility, vigor, and integrity of acrossome and DNA. There was no difference (P>0.05) among treatments considering 0 and 60 minutes of incubation in all studied parameters. After 120 minutes of incubation, it was observed higher percentage (P<0.05) of cells with total and progressive motility in the samples of T2. It can be concluded that the trolox addition after thawing of equine semen preserved total and progressive motility of the sperm incubated at 37ºC during 120 minutes.

Keywords: equine, semen, incubation, antioxidant

INTRODUÇÃO

Na maioria dos garanhões, as características espermáticas pós-congelação apresentam características inadequadas, resultando em índices baixos de fertilidade, como consequência das crioinjúrias espermáticas ocorridas durante o processo de congelação/descongelação. Por isso, várias pesquisas têm sido realizadas com o intuito de melhorar a qualidade espermática (Dell'Áqua Júnior e Papa, 2001; Snoeck et al., 2007) visando aumentar as taxas de prenhez nessa espécie.

O papel das espécies reativas ao oxigênio (ROS) tem sido enfatizado na fisiopatologia da reprodução e, apesar de estar envolvido no controle fisiológico de algumas funções espermáticas, como capacitação e reação do acrossoma, a sua produção excessiva é prejudicial em virtude de reduzir a motilidade espermática, a capacidade de fusão dos gametas e a fertilidade (Guerra et al., 2004). Sabe-se que muitos procedimentos utilizados em laboratório podem interferir na produção de ROS espermáticos, tendo sido demonstrado aumento de sua concentração em amostras de sêmen dos animais domésticos submetidas à centrifugação (Twigg et al., 1998) e congelação (Wang et al., 1997; Ball et al., 2001; Chatterjee e Gagnon, 2001).

Durante a congelação, a produção de ROS pode induzir mudanças na estrutura e na função espermática (Ball et al., 2001), além de alterar o sistema de defesa antioxidante (Bilodeau et al., 2000). Por isso, Gadea et al. (2005), visando aumentar a viabilidade e a subsequente capacidade fertilizante de espermatozoides suínos, sugeriram a adição de antioxidante ao meio diluidor após a descongelação, em virtude de reduzir a produção de ROS e aumentar a habilidade de penetração no oócito.

Os antioxidantes são inibidores de radicais livres que suprimem a formação de ROS e/ou suas ações. Estudos têm mostrado que a vitamina E (α-tocoferol) é capaz de interagir diretamente com radicais oxidantes (Jones et al., 1995) interrompendo a reação em cadeia da peroxidação lipídica em biomembranas e lipoproteínas (Dieber-Rotheneder et al., 1991) e protegendo as células de estresse oxidativo (Kagan et al., 1992) e de danos das membranas plasmática e acrossomal, bem como do DNA (Sikka, 2004). O trolox (6-hydroxy-2,5,7,8tetramethylchroman-2-carboxylic acid) é um análogodo α-tocoferol hidrossolúvel que, devido à sua solubilidade em água, apresenta potente propriedade antioxidante (Wu et al., 1991).

A pentoxifilina está sendo utilizada nos casos de infertilidade causada por fator masculino na espécie humana, levando em consideração a sua capacidade de preservar a capacidade fertilizante dos espermatozoides (Goulart et al., 2004). Segundo Yovich (1993), esse inibidor da fosfodiesterase auxilia na fertilização do ovócito durante os procedimentos de fertilização in vitro, promovendo aumento de sua motilidade. No sêmen equino, a pentoxifilina aumentou a motilidade progressiva de espermatozoides descongelados após incubação nos momentos 0 e 120 minutos (Marques et al., 2002).

Considerando que o uso da pentoxifilina associada ao trolox aumenta a viabilidade de espermatozoides descongelados, este estudo teve o objetivo de avaliar o efeito da adição de trolox e de pentoxifilina na motilidade, integridade do acrossoma e do DNA de espermatozoides de equinos após a descongelação.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras de sêmen foram obtidas de três garanhões da raça Mangalarga Marchador, com idades entre quatro e oito anos, os quais permaneceram estabulados durante o experimento, junho e julho, e foram alimentados com ração balanceada e feno. Os animais foram avaliados por meio de exame andrológico, sendo aprovados para congelação apenas os ejaculados com valores mínimos de 60% de motilidade total e 3 de vigor espermático.

A cada três dias, foram colhidas amostras de sêmen, totalizando três ejaculados de cada reprodutor, mediante uso de vagina artificial, com auxílio de uma égua em cio. Imediatamente após a colheita, procedeu-se à filtragem das amostras de sêmen com gaze, visando remover o gel e as partículas grandes de debris celulares. As amostras sem gel foram colocadas em banhomaria a 35ºC durante os procedimentos de diluição e análise espermática: motilidade total e progressiva, e concentração espermática que foram avaliadas segundo o Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal do CBRA (Manual ..., 1998). Em seguida, o sêmen diluído (1:1, sêmen:diluidor; Kenney, 1975) foi transportado à temperatura ambiente ao laboratório para congelação.

Foram preparadas as amostras de sêmen in natura para avaliação de: a) integridade do acrossoma, em que 10µL do sêmen diluído 1:1 (sêmen:diluidor; Kenney, 1975) foi utilizado para confecção de esfregaços, os quais foram armazenados a 4ºC, protegidos da luz e analisados no prazo de duas semanas utilizandose a técnica de coloração FITC-conjugada ao Pisun sativun aglutinina¹ (FITC-PNA; Roth et al., 1998); b) integridade do DNA, em que a alíquota de 10µL de sêmen foi diluída em 990µL de solução de TNE contendo 0,15M NaCl; 0,01M TRIS.HCl; 1mM EDTA.Na₂.2H₂O em 100mL, cujo pH foi em torno de 7,4; colocadas em tubos de microcentrífuga (1,5mL) e incubadas a -20ºC, para posterior análise, de acordo com a técnica de laranja de acridina²(Evenson et al., 1999).

Antes do procedimento de congelação, as amostras de sêmen foram centrifugadas (600 x g, durante 10 minutos) para retirada do plasma seminal e os péletes ressuspensos em diluidor de congelação FR5³ (Tris-gema com 5% de glicerol), na concentração de 100x10⁶ espermatozoides/mL. A seguir, as amostras foram envasadas em palhetas de 0,25mL e transferidas imediatamente para a máquina de congelação de sêmen⁴, onde foram submetidas ao processo de refrigeração iniciando à temperatura ambiente até atingir 5ºC, a uma taxa de 0,25ºC/min. A partir daí, foram realizadas duas curvas negativas, a primeira de -15ºC/min até atingir -5ºC, e a segunda a -10ºC/min até atingir -120ºC. Após o processo de congelação, as palhetas foram armazenadas em botijão criobiológico à temperatura de -196 ºC.

Para descongelação, duas palhetas de sêmen de cada reprodutor foram colocadas a 37ºC, durante 30 segundos. Em seguida, as amostras foram diluídas em solução Tris (1:1; v:v) acrescida de trolox e pentoxifilina de acordo com os seguintes tratamentos (T): T1= 150µL de sêmen + 150µL de Tris (controle); T2= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 120µM/mL de trolox¹; T3= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 3,5mM de pentoxifilina⁵ e T4= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 3,5mM de pentoxifilina + 120µM/mL de trolox. As amostras foram analisadas quanto à motilidade total e progressiva, vigor e integridade de acrossoma e DNA, nos momentos 0, 60 e 120 minutos de incubação a 37ºC em banho-maria. As concentrações de pentoxifilina e trolox foram baseadas em estudos preliminares desenvolvidos por Silva et al. (2006).

As características espermáticas - motilidades total e progressiva, vigor, integridade acrossomal e integridade de DNA - de cada reprodutor foram avaliadas antes e após a congelação, bem como após diluição e incubação de 60 e 120 minutos. Aplicou-se análise de variância considerando os fatores tratamento e tempo de incubação das amostras e sua interação. A significância estatística foi estabelecida para 0,05 de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As análises das amostras de sêmen realizadas imediatamente após a descongelação e diluição, e aos 60 minutos de incubação, não evidenciaram diferenças (P>0,05) entre os tratamentos para motilidade total e progressiva, vigor, integridade de acrossoma e DNA (Fig. 1I, II, III e ^2I, ^II). Entretanto, aos 120 minutos de incubação, verificou-se diferença entre tratamentos (P<0,05) na motilidade total e na motilidade progressiva, sendo os valores de T2 e T4 mais elevados do que os dos T1 e T3 (Fig. 1I e II).

Segundo Marques et al. (2002), a adição de 3,5mM de pentoxifilina em diluidor TALP, com ou sem ácido ascórbico, após descongelação do sêmen equino criopreservado em diluidor à base de gema de ovo (20,0%) e Orvus-Es Past, agente emulsificante que aumenta a proteção dos fosfolipídios, preservou a motilidade progressiva e o vigor espermático do momento 0 até 120 minutos de incubação. Isto não foi observado nesse experimento, em que a motilidade total e a motilidade progressiva foram menores aos 120 minutos de incubação, quando se utilizou esse antioxidante. As diferenças de resultado podem estar relacionadas ao tipo de diluidor utilizado no experimento anteriormente citado, em virtude de conter substâncias que auxiliam na manutenção da qualidade espermática após o processo de congelação/descongelação, como, por exemplo, o porcentual elevado de gema de ovo e o Orvus-Es-Past.

Quanto ao vigor espermático (Fig. 1 III), não se observou efeito dos tratamentos (P>0,05), embora aos 120 minutos de incubação tenha sido verificada redução dos valores médios dessa variável em T1 (sêmen + Tris) e T3 (sêmen + Tris + pentoxifilina). Por outro lado, as amostras submetidas aos T2 (sêmen + Tris + trolox) ou T4 (sêmen + Tri + pentoxifilina + trolox), após o descongelamento, apresentaram valores similares (P>0,05) de vigor espermático, aos 120 minutos de incubação, ressaltando o efeito da vitamina E, como uma das mais importantes moléculas antioxidantes (Ehrenkranz, 1980; Palamanda e Kehrer, 1993). Ressalta-se, ainda, não ter havido interação tratamento x tempo para as variáveis estudadas.

Observou-se redução significativa (P<0,01) nos porcentuais de células com acrossomas íntegros em decorrência do tempo de incubação, sendo mais acentuada aos 120 minutos no T3, 90,0%; 89,0%; 78,0%; e em menor intensidade no T4, 93,0%; 87,5%; 87,0%, respectivamente, aos 0, 60 e 120 minutos de incubação (^{Fig. 2I}). A peroxidação lipídica é iniciada pelo radical hidroxil que reage com o ácido graxo poliinsaturado, gerando radicais orgânicos livres que, em contrapartida, reagem rapidamente com o oxigênio para formar o peróxido de hidrogênio. Esses peróxidos lipídicos, que agem como radicais livres, iniciam uma reação em cadeia autocatalítica, resultando em danos à membrana celular (Cotran et al., 1989). A peroxidação lipídica e o subsequente dano de membrana ocorrem principalmente durante o processo de descongelação (Sinha et al., 1996). O estudo da integridade acrossômica evidenciou porcentuais elevados de células íntegras no decorrer dos intervalos estudados, demonstrando que nesse experimento todos os tratamentos proporcionaram ambiente adequado à integridade das membranas plasmática e acrossômica externa, evitando dano celular e preservando as células espermáticas da capacitação e da reação do acrossoma precoces, comumente observadas durante o processo de congelação (Neild et al., 2003). Este resultado difere dos relatados por Marques et al. (2000) em que o acrossoma comumente sofre alteração estrutural determinada por elevada concentração de ROS.

No T3, após 120 minutos de incubação, observou-se redução acentuada dos valores de todos os parâmetros observados, com exceção da análise do DNA que manteve 100,0% das células íntegras. Baixa qualidade da cromatina detectada em espermatozoides morfologicamente anormais pode representar um dos maiores fatores limitantes da habilidade fertilizante do espermatozoide, dando ênfase à importância da integridade do DNA como expressão do potencial de fertilidade (Frase, 2004). Todavia, neste experimento, a análise de integridade do DNA espermático não evidenciou diferença (P<0,05) entre os tratamentos e os tempos de incubação, demonstrando que o processo de congelação não danificou o material genético encontrado no núcleo desses gametas. Esse fato evidencia que, quando as células espermáticas encontram-se em condições favoráveis à manutenção da integridade do DNA, não é necessária a adição de substâncias antioxidantes como trolox e pentoxifilina após a descongelação, confirmando os resultados obtidos por Donelly et al. (1999), em amostras contendo espermatozoides com mais de 80% de integridade de DNA. Esses autores verificaram que a adição de antioxidantes como ascorbato ou α-tocoferol não determinou efeito positivo na qualidade espermática, apesar de esses antioxidantes promoverem decréscimo na produção de ROS.

A manutenção da estrutura do DNA imediatamente após a descongelação (0 min) e durante a incubação a 37ºC (120 min) pode ser atribuída ao fato de o grau de compactação da cromatina espermática proporcionar proteção e manutenção de sua integridade, tornando os espermatozoides mais resistentes às mutações e ao estresse ambiental (Perreault et al., 1988). Isto confirma os resultados observados por Peris et al. (2004) que, após descongelar espermatozoides ovinos e incubá-los por três horas a 38ºC, não detectaram danos ao DNA genômico.

Nas variáveis motilidade total e progressiva, aos 120 minutos de incubação, a associação de trolox e pentoxifilina (T4) conferiu valores mais elevados (P<0,05) do que aqueles obtidos com a adição de pentoxifilina (T3), porém os valores foram semelhantes àqueles constatados com o uso do trolox (T2). Esperava-se que a associação dos dois antioxidantes (trolox e pentoxifilina) apresentasse efeito potencializante, conferindo maior proteção às células espermáticas contra a ação de ROS, uma vez que, em experimento com sêmen refrigerado de equino, a pentoxifilina reduziu os efeitos deletérios dos radicais livres de oxigênio sobre a atividade celular (Goulart et al., 2004). No entanto, neste experimento, as evidências indicam que os resultados obtidos no tratamento T4 devem ser atribuídos apenas à ação do trolox, independente da adição de pentoxifilina.

Assim, pode-se concluir que a adição de 120µM/mL de trolox ao diluente utilizado após a descongelação do sêmen equino preserva a motilidade total e progressiva das células espermáticas submetidas à incubação a 37ºC durante 120 minutos.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, pelo apoio financeiro, e à médica veterinária Ana Emília Motta (Haras Aparthorse - Camaragibe/PE), pela concessão dos garanhões utilizados nesse estudo.

Recebido em 26 de maio de 2008

Aceito em 23 de dezembro de 2008

E-mail: [e-mail]

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1

Sigma - Saint Louis, EUA.

2

Molecular Probes Inc. - Oregon, EUA.

3

Nutricell - Porto Alegre, Brasil.

4

Modelo Tetakon® -TK 3000, Tecnol. Congel. Ltda - Uberaba, Brasil.

6 A Fórmula - Salvador, Brasil.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Maio 2009
• Data do Fascículo
  Fev 2009

Histórico

• Recebido
  26 Maio 2008
• Aceito
  23 Dez 2008